肿瘤细胞对凋亡的耐受是多药耐药(MDR)的重要机制之一,Bax、BCL-2是调控凋亡的关键基因,是通过抑制肿瘤细胞的凋亡而导致耐药的发生[1]。笔者前期的研究发现班贞1号、TMP联合5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强逆转作用[2]该研究试图从细胞凋亡的角度探讨其逆转人胃癌SGC-7901/ADR细胞耐药的机制,为胃癌MDR的治疗提供新方法。
由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠的人胃癌耐阿霉素细胞株SGC-7901/ADR细胞。
(1)药物与试剂:斑贞1号:斑蝥、女贞子、露蜂房、山茱萸按一定比例制备(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院),原生药含量:0.2 g/mL,4℃保存。TMP(浙江新华制药有限公司)、RPMI1640(美国GIBCO公司产品)、5-FU(南通精华制药有限公司产品)、新生小牛血清(赛默飞世尔生物化学制造(北京)有限公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)。(2)仪器:PCR扩增仪(美国AB公司),RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。
于实验两周前培养于不含ADM的培养液中取对数生长期的SGC-7901/ADR细胞,以5×104/mL接种于6孔板上,2 mL/孔,培养24 h后,分别在实验孔加入等量如下试剂:A:新培养液(对照组),B:5-FU稀释液(5-FU组);C:班贞1号稀释液(班贞1号组);D:班贞1号+5-FU稀释液(班贞1号+5-FU);E:班贞1号+5-FU+TMP稀释液(班贞1号+5-FU+TMP);各组药物浓度依之前MTT试验的结果,选取对应的IC50值)。继续培养48 h后,用PBS缓冲液冲洗1次,准备提取总mRNA。
(PCR方法按照文献提取组织RNA,)采用Trizol试剂盒提取RNA,引物均由大连宝生物工程有限公司合成,用于特异性扩增的Bcl-2基因序列的正义列引物为5-
TCTCTCCC
GACATGACCGAGG-3’,反义列引物为5-CCAGGAATAT-GCCCCGACTTC-3,Bax基因序列的正义列引物为5’-ACCACC-CTGGTCTTGGATCC-3’,反义列引物为5’-GCGTCCACCAA-GAAGCTGAG-3,-action的正义列为5-GTGGGGCGCC-CCAGGCACCA-3’,反义列为5-CTCCTTAATGTCACGCAC-GATTTC-3’,先逆转录出cDNA,每个样品反应体系25 uL,即ddH2O13.5 uL,10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 ul,dNTP Mixture 2 uL,Takara Taq 1 uL,目的基因上、下游引物各0.5 uL,各样品cDNA5uL,灭菌蒸馏水13.5 uL.Bcl-2扩增条件:预变性94℃、2 min;变性94℃、30 s,退火45℃、30 s,延伸72℃、1 min,35个循环;最后72℃、延伸8 min.Bax扩增条件:50℃、2 min;95℃、10 min;95℃、15 s,60℃、1 min,40个循环,最后72℃、延伸8 min。扩增结束后,取样品10 uL,100 V恒压,2%琼脂糖电泳60 min。紫外反射透射分析仪采集电泳图像,凝胶图象分析系统扫描得到各电泳带平均光密度值,目的条带与内参条带光密度比值为相对光密度值(relative optical density,ROD)。
所有数据均采用SPSS 14.0软件进行统计分析,计量数据以表示,行方差分析及LSD-t检验。
RT-PCR检测Bcl-2、BaxmRNA表达的变化(图1、2)、凝胶成像分析结果(表1)显示,5-FU组与阴性对照组相比,Bcl-2、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax比值无明显差异(P>0.05)。中西药联合组BaxmRNA表达明显增高,Bcl-2mRNA表达及Bcl-2/Bax比值明显降低,与阴性对照组及其他实验组比较有统计学意义(P<0.05)。
研究表明,产生耐药的原因之一是肿瘤细胞的凋亡调节失调。有核细胞在凋亡刺激信号作用下通过启动细胞内死亡机制,经过一系列信号转导途径,最终发生细胞程序性变性和死亡的过程谓之细胞凋亡(apoptosis)。Bcl-2基因家族在控制细胞凋亡过程中发挥重要的作用,Bax是Bcl-2基因家族中能够促进细胞凋亡的蛋白,Bcl-2是抑制细胞凋亡的蛋白.Bax过表达可促进细胞死亡,而Bcl-2过表达可阻断或阻碍化疗药物诱导细胞凋亡,抑制Bax引起细胞凋亡的功能,使癌细胞对化疗药产生耐药[3,4]。因此Bcl-2/Bax的比值决定了细胞受凋亡因素刺激后的生与死[5,6]。我们前期研究发现SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性,相对耐药性为97.49[7],该研究结果表明5-FU组Bcl-2、Bax mRNA表达量及Bcl-2/Bax的比值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明Bcl-2、bax蛋白参与耐药细胞对5-FU的耐药性,推测Bcl-2、Bax基因参与SGC-7901/ADR细胞的多药耐药。
斑贞1号合剂以女贞子、山茱萸为辅佐药,以斑蝥、露蜂房为主药,各成分按成人(60 kg)的临床用量制备。其中斑蝥素可抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成,具有以毒攻毒、解毒杀瘤、直接杀伤肿瘤且无骨髓抑制作用[8]。女贞子能调节细胞毒性T细胞,保护致突剂诱发的突变效应和染色体损伤[9]。作为一种中药钙离子通道阻滞剂,TMP可通过多种途径治疗肿瘤,逆转多药耐药作用[10]。该课题组研究证明:“斑贞1号对SGC-7901/ADR细胞存在逆转作用[11];300 mg/L的TMP能有效提高SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性,使其相对耐药性降至12.89,逆转指数为8.43倍。”[7]且中西联合用药对SGC-7901/ADR细胞的逆转作用更为显著[12]。该研究结果显示,SGC-7901/ADR细胞经中西药联合组处理后,baxmRNA表达量与斑贞1号、斑贞1号+5-FU组比较明显增高,而Bcl-2mRNA表达量及Bcl-2/bax比值明显降低(P<0.05),提示中西药联合可提高Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,促进了SGC-7901/ADR细胞凋亡。这种凋亡可能是受到抑制凋亡基因Bcl-2表达下调和促进凋亡基因Bax表达上调的调节,进一步证实其对耐药细胞的显著逆转作用。关于体外试验结果能否在体内发挥相同的作用,则有待进一步研究证明。
﹡:为各组与A组比较;﹡﹡:为C组与B组比较;﹡﹡﹡:为D组与C组比较;﹡﹡﹡﹡:为E组与D比较。
﹡:each group compares with group A;﹡﹡:group C compares with group B;﹡﹡﹡:group D compares with group C;﹡﹡﹡﹡:group E compares with group D。
摘要：目的 探讨川芎嗪(TMP)、班贞1号联合5-氟脲嘧啶(5-FU)对人胃癌SGC7901/ADR细胞Bcl-2、Bax基因表达的影响。方法 以SGC-7901/ADR细胞为靶细胞,以不加药组为阴性对照组,分别以5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号+5-FU组及班贞1号+5-FU+TMP(中西药联合)组为实验组,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定SGC-7901/ADR细胞在不同药物作用下Bcl-2、Bax基因的表达情况。结果 5-FU组与阴性对照组相比,Bcl-2、BaxmRNA表达及Bcl-2/Bax比值经比较,差异无统计学意义(P>0.05);中西药联合组BaxmRNA表达明显增高,Bcl-2mRNA表达及Bcl-2/Bax比值明显降低,与阴性对照组及其他实验组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 中西药联合可诱导人胃癌SGC7901/ADR细胞凋亡,从而逆转了SGC7901/ADR细胞的耐药性。其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,降低Bcl-2/Bax的比值有关。
关键词：胃癌,中西药联合,Bcl-2,Bax
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