PBL模式生物化学论文提纲

论文题目：以果蝇为模型研究铁对帕金森疾病的调控机制

摘要：随着人们对健康生活的日益重视,饮食的营养、安全问题更加突出,开发更有效、更健康的食品迫在眉睫。必需微量元素是生物体不可缺少的元素,机体不能自身产生与合成,一般需由食物供给。饮食不均衡、机体稳态失衡均可能导致微量元素代谢紊乱,从而引起疾病。铁是体内含量丰富的微量元素之一,参与多种酶、激素、维生素和核酸的代谢过程。另一方面,体内铁代谢紊乱与多种疾病相关。帕金森疾病（Parkinson’s disease,PD）是一种神经退行性疾病,其病因病理目前尚不清楚,也缺乏有效治疗手段。有研究表明,PD病人体内存在铁离子水平紊乱,本论文旨在探究体内铁离子水平对PD疾病进程的影响及作用机理,从而为改善PD疾病进程和铁相关功能食品开发的可行性提供一定的基础理论支持。果蝇是经典的模式生物,与人类基因同源性高,具有基因调控便捷、易饲养、生长快、表型丰富等特点,近年来被广泛应用于食品营养和健康领域研究。本课题借助经典遗传性PD果蝇模型——帕金森致病基因PTEN诱导的假定激酶1（Phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase protein 1,PINK1）基因沉默,利用遗传学、生物化学、生理学、分子生物学及行为学技术手段,通过遗传学方法改变铁转运蛋白d ZIP13和Transferrin1（Tsf1）的表达水平,借助于行为学、生理学及生物化学的方法检测对遗传性PD疾病表型的影响,利用生物化学、分子生物学的方法深入探讨了体内铁水平变化对线粒体功能的影响,发现了改变体内铁离子的水平能通过影响线粒体呼吸链酶活性进而改变线粒体产生ATP的功能来影响遗传性PD疾病进程。此外,我们利用鱼藤酮暴露建立了散发性PD模型,通过遗传学方法改变Tsf1的表达水平,检测了体内铁水平对散发性PD表型、氧化损伤方面的影响,并从分子水平进一步探究了可能机制。本课题主要研究内容和结果如下:（1）为了探讨铁对遗传性PD的调控作用,采用上游激活序列/半乳糖调节的上游启动子元件（upstream activating sequence/galactose regulated upstream promoter element,UAS/GAL4）系统将肌肉组织PINK1敲低建立了遗传性PD模型,同时在果蝇肌肉中将铁转运蛋白d ZIP13过表达（d ZIP13 overexpression,d ZIP13 OE）或者Tsf1基因沉默（Tsf1 RNA inteferance,Tsf1 RNAi）,结果表明d ZIP13 OE和Tsf1RNAi能显著缓解PINK1缺陷所致遗传性PD模型的疾病进程,包括肌肉退化、翅型异常、蹦跳能力下降。（2）PINK1的生理功能有多方面,最经典的是与Parkin共同作用,参与对线粒体自噬的调控,为了探讨d ZIP13 OE和Tsf1 RNAi是否通过影响线粒体自噬调控PINK1的功能,我们利用行为学手段检测了d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi对线粒体自噬通路下游基因Parkin缺陷所致遗传性PD表型的影响,包括肌肉退化、翅型异常、蹦跳能力下降,发现d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi并不能挽救Parkin缺陷的表型,这间接说明d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi对PINK1缺陷的调控可能与线粒体自噬无关。此外,通过生物化学及分子生物学技术观察线粒体形态及与自噬相关基因8α（Autophagy-related gene 8α,Atg 8α）的共定位信号发现,d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi并未挽救PINK1缺陷导致的线粒体自噬水平降低,这直接证明d ZIP13 OE或Tsf1RNAi对PINK1缺陷的挽救不依赖于线粒体自噬路径。（3）利用生物化学及生理学方法检测后,我们发现PINK1缺陷导致线粒体呼吸作用减弱、线粒体复合体活性明显降低,通过测定耗氧率（Oxygen Consumption Rate,OCR）及线粒体复合体Ⅰ-Ⅳ的活性发现,d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi能挽救这些表型,起到缓解线粒体损伤的作用,表明d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi对PINK1缺陷的挽救可能与增强线粒体功能有关。（4）我们实验室前期工作表明,d ZIP13及Tsf1在肠道中具有铁代谢的功能,为了进一步检测d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi对PINK1缺陷表型的挽救是否与铁有关,我们通过菲啰嗪（Ferrozine）法及ICP-MS测定铁水平,发现d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi能提高肌肉细胞线粒体内铁水平,线粒体复合体酶活测定结果表明d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi导致线粒体呼吸链上呼吸酶活性升高;进一步的,利用遗传手段敲低线粒体的铁转运体Mitoferrin（Mfrn）表达,减少线粒体内铁含量,能明显抑制d ZIP13OE或Tsf1 RNAi对PINK1缺陷表型的挽救效果,这些结果表明d ZIP13 OE或Tsf1RNAi在肌肉内通过提高线粒体铁水平,进而增强呼吸链上铁酶的功能、增加ATP产生来挽救PINK1缺陷。（5）为了探讨铁对散发性PD的调控作用,我们利用鱼藤酮暴露建立了散发性PD模型,采用遗传学手段将果蝇大脑Tsf1特异性敲低,研究发现,Tsf1 RNAi能明显缓解鱼藤酮所致PD表型,包括爬行变缓、跳跃变少、寿命缩短、多巴胺能神经元丢失;进一步的实验显示,鱼藤酮诱导线粒体复合体Ⅰ活性下降、ROS水平升高,而Tsf1敲低能明显缓解氧化应激压力、增加ATP水平;更深一步的,我们利用普鲁士蓝染色和Ferrozine法测铁含量、增加铁水平并观察相关表型（行为学变化、氧化应激水平、ATP变化）,结果发现Tsf1对鱼藤酮暴露诱发的散发性PD的调控作用与铁直接相关,这进一步表明,调控铁转运蛋白的表达,改变铁水平对于散发性PD也具有挽救效果。综上,本论文利用果蝇模型,通过遗传手段改变体内铁离子转运蛋白的表达,探究对遗传性PD和环境诱导的散发性PD的影响,找到缓解PD的新方法,并探明了分子机制。本文结果表明,d ZIP13 OE或Tsf1 RNAi能通过提高肌肉细胞线粒体内的铁水平,从而增强线粒体呼吸作用和线粒体复合体活性,最终提高线粒体的功能来挽救PINK1缺陷所致遗传性PD表型;另一方面,在鱼藤酮诱导的散发性PD模型中,我们发现Tsf1 RNAi能减少脑内铁水平、降低氧化应激压力,从而缓解鱼藤酮的神经毒性。本工作提供了体内证据表明通过调控微量营养素能够缓解PD,这不仅可作为PD病人日常膳食和营养调节的指导,也为功能性食品的开发提供了一定的理论支持。

关键词：帕金森;PINK1;鱼藤酮;铁;d ZIP13;Tsf1

学科专业：食品科学

致谢

摘要

abstract

第一章 绪论

1.1 铁与人体健康

1.1.1 微量元素铁

1.1.2 铁的生理功能

1.1.3 铁代谢调控

1.2 功能性食品

1.2.1 概念及应用建议

1.2.2 铁与功能性食品

1.3 帕金森疾病

1.3.1 帕金森疾病概况

1.3.2 帕金森疾病的分类

1.3.3 帕金森疾病的发病机理

1.3.4 帕金森疾病与营养学

1.3.5 铁代谢与帕金森疾病

1.4 果蝇与膳食营养

1.4.1 模式生物果蝇概况

1.4.2 果蝇在膳食营养研究中的应用

1.5 课题的目的及意义

1.6 研究的主要内容

1.6.1 遗传性PD模型

1.6.2 散发性PD模型

第二章 调节铁转运蛋白表达对PINK1 缺陷致PD表型的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 果蝇食物配制

2.1.3 果蝇UAS/GAL4 系统

2.1.4 果蝇构建

2.1.5 果蝇杂交

2.1.6 果蝇半定量RT-PCR

2.1.7 果蝇PD样表型观察

2.1.8 数据统计与分析

2.2 结果与讨论

2.2.1 基因表达效率检测

2.2.2 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对PINK1 RNAi果蝇异常翅型的影响

2.2.3 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对PINK1 RNAi果蝇跳跃缺陷的影响

2.2.4 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对PINK1 RNAi果蝇躯干凹陷的影响

2.2.5 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对PINK1 RNAi果蝇躯干肌肉形态损伤的影响

2.2.6 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对Parkin缺陷果蝇异常翅型的影响

2.2.7 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对Parkin缺陷果蝇跳跃损伤的影响

2.2.8 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低对Parkin缺陷果蝇躯干凹陷的影响

2.3 本章小结

第三章 dZIP13 过表达和Tsf1 敲低调控PINK1 缺陷致遗传性PD的机制研究

3.1 材料与方法

3.1.1 试剂与仪器

3.1.2 果蝇构建

3.1.3 果蝇半定量RT-PCR

3.1.4 果蝇重组

3.1.5 果蝇组织免疫组化染色

3.1.6 ATP含量检测

3.1.7 线粒体提取

3.1.8 线粒体呼吸作用测定

3.1.9 线粒体复合体活性测定

3.1.10 Ferrozine检测铁水平

3.1.11 ICP-MS检测铁水平

3.1.12 表型观察

3.1.13 数据统计与分析

3.2 结果与讨论

3.2.1 基因表达效率检测

3.2.2 多巴胺神经元过表达dZIP13 和敲低Tsf1 对线粒体形态的影响

3.2.3 躯干肌肉过表达d ZIP13 和敲低Tsf1 对线粒体形态的影响

3.2.4 过表达d ZIP13 和敲低Tsf1 对线粒体自噬的影响

3.2.5 d ZIP13 过表达和Tsf1 敲低对ATP产生的影响

3.2.6 d ZIP13 过表达和Tsf1 敲低对呼吸作用的影响

3.2.7 肌肉过表达d ZIP13 和敲低Tsf1 对线粒体复合体活性的影响

3.2.8 d ZIP13 OE和 Tsf1 RNAi对铁含量的影响

3.2.9 降低铁水平对d ZIP13和Tsf1 调控作用的影响

3.3 本章小结

第四章 Tsf1敲低对鱼藤酮诱导PD表型的影响

4.1 材料与方法

4.1.1 试剂与仪器

4.1.2 果蝇半定量RT-PCR

4.1.3 鱼藤酮食物配制

4.1.4 爬行能力测试

4.1.5 弹跳能力测试

4.1.6 寿命测试

4.1.7 多巴胺神经元染色

4.1.8 线粒体复合体Ⅰ活性测定

4.1.9 ATP水平检测

4.1.10 ROS染色

4.1.11 SOD活性测定

4.1.12 Catalase活性测定

4.1.13 数据统计与分析

4.2 结果与讨论

4.2.1 基因表达效率检测

4.2.2 Tsf1敲低对鱼藤酮诱导PD表型的影响

4.2.3 Tsf1敲低对鱼藤酮诱导PD多巴胺神经元数量的影响

4.2.4 Tsf1敲低对鱼藤酮诱导PD线粒体功能的影响

4.2.5 Tsf1敲低对鱼藤酮诱导PD氧化应激水平的影响

4.3 本章小结

第五章 Tsf1对鱼藤酮致PD调控的机制研究

5.1 材料与方法

5.1.1 试剂与仪器

5.1.2 果蝇构建

5.1.3 果蝇半定量RT-PCR

5.1.4 Ferrozine检测铁水平

5.1.5 普鲁士蓝染色

5.1.6 果蝇重组

5.1.7 铁水平干预实验

5.1.8 数据统计与分析

5.2 结果与讨论

5.2.1 基因表达效率检测

5.2.2 Tsf1 RNAi对铁水平的影响

5.2.3 铁对Tsf1对PD行为学调控的影响

5.2.4 铁对Tsf1调控氧化应激和能量供应的影响

5.2.5 中枢神经系统Tsf1作用部位

5.3 本章小结

第六章 总结与展望

6.1 总结

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献