犯罪现场检验研究论文提纲

论文题目：不同环境条件下血痕中microRNA稳定性研究

摘要：研究背景在法医现场勘验工作中常遇到不同种类的体液斑迹,如血痕、精斑、唾液斑、汗渍等,其中血痕是犯罪现场中最常见的生物检材,也是法医物证检验工作中最重要的检测项目之一。血液一旦离开人体,便在载体上逐渐形成血痕（迹）,且面临外界物理、化学以及生物学等多种因素的作用和影响,导致其污染、降解、腐败过程十分迅速。此外,随着血痕的老化,其内部成分不断发生改变,其中大分子蛋白质、DNA及RNA破坏会增加血痕检验的难度。故血痕的检验过程及难度也高于临床血液检验,且血痕的腐败严重影响其检测结果,如何准确、高效地对遗留于犯罪现场中的血痕进行识别,是法医检案工作中必须解决的关键问题。MiRNA作为一类单链内源性非编码小RNA分子（22个左右核苷酸）,其表达具有高度的组织特异性和时序性,并且不易降解（强稳定性）等特征。这些优势为miRNA应用于法医工作中提供基础,使其在法医物证学检测方面（如体液、组织识别等）具有重要的意义和良好的应用前景,目前已有大量文献证实hsa-miR-16-5p（miR-16-5p）,hsa-miR-451a（miR-451a）可作为血液特异性分子标志物。与此同时,miRNA虽具有较强的稳定性,但理论上而言,其仍会受到RNA酶的影响。既往临床研究通常将血液样本置于冰冻条件下保存来进行miRNA的稳定性研究,以找寻其最佳存储条件。近年来有研究者将血液、精液、唾液等制作成体液斑迹后,初步探讨其中miRNA的降解规律。而在法医现场勘验工作中遇到的生物检材多为微量物证,且常存在于室内或室外（自然条件）,甚至遭到人为破坏（水洗或高温处理等）;此外在法医物证工作方面,对生物检材的长期保存是其重要工作之一。目前多在实验室条件下（室温、低湿、避光）保存,而该存储条件对其中miRNA的稳定性的影响尚未可知。故探讨不同环境条件下血痕样本中miRNA的稳定性及时序性规律,判断miRNA应用于体液来源鉴定方面的潜力,进而确定血痕检材的最佳存储条件显得尤为重要。目的通过实验控制建立不同环境条件（温度、湿度、紫外光照强度、自然条件下等）,研究血痕样本中miRNA的稳定性和降解规律,判断其应用于法医实际工作中的潜力,并确定适合提取miRNA的时间点,提高检测效率;此外,本研究一方面可以为法医物证样本的存储提供参考,对法医实际工作具有重要理论及实践意义,另一方面,本研究拟通过分析U6能否在多种实验环境条件下稳定存在,判断其是否适合作为内参应用于腐败血痕检验中。方法将血痕样本放置于不同温度（-20℃,4℃,25℃,37℃）、不同湿度（30%±0.5%,45%±0.5%,60%±0.5%,75%±0.5%）、不同紫外光照强度（25uw/cm~3,44uw/cm~3）、不同自然条件（有雨,无雨）、实验室条件下（RT,低湿且避光）分别保存一定时间后,应用逆转录PCR及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）等技术检测其中hsa-miR-16-5p（miR-16-5p）,hsa-miR-451a（miR-451a）及U6 snRNA（U6）含量,通过统计学方法对获得的数据进行方差分析、拟合、回归分析等处理,进而观察血痕中目标miRNA及U6的稳定性和降解特点。结果与讨论本研究通过实验控制建立一系列环境条件,探讨在不同实验环境条件下血痕中目标miRNA及U6稳定性,并为法医物证检验工作中涉及血痕样本的储存提供参考,以期在保证miRNA稳定性的基础上实现血痕的长期储存。首先,我们通过对血痕样本中miRNA（miR-16-5p,miR-451a）的稳定性研究发现,四种温度条件下放置180天的血痕样本中均能成功检出miRNA,而于37℃条件下烘干血痕后,将其放置于-20℃条件下长期保存更能确保其中miRNA的稳定性;不同湿度环境条件研究结果表明miRNA的降解速率与血痕所处的环境湿度密切相关,较高的湿度（相对湿度75%）环境将导致miRNA的降解速率加快;在不同紫外光照强度条件研究结果提示早期充分的紫外光照更能保证样本中miRNA的稳定存在;通过对不同自然条件下（有雨、无雨）放置的血痕中的miRNA研究发现,在室外放置60天的血痕样本中仍能成功检出目标miRNA,但雨水对其稳定性具有不利影响,导致血痕中miRNA含量快速降低;此外,在实验室条件下（RT、低湿且避光）存储3年和6年的血痕样本中均可成功检出目标miRNA,证实miRNA在老化血痕样本中的稳定性。另外,针对血痕中U6的稳定性研究发现,高温或高湿度的环境将加快血痕中U6降解速率,且随着时间的延长,其含量逐步降低;在不同紫外光照强度条件研究结果与miRNA相似;在不同自然条件（有雨、无雨）研究表明随着存储时间的延长,U6逐步降解,且雨水加快其降解速率;在实验室条件下（RT、低湿且黑暗）存储3年和6年的血痕样本中均可成功检出U6,且在不同时间样本之间U6的含量并无显著性差异（P=0.913）。结论本研究通过探讨不同外界环境因素对血痕中目标miRNA和U6的影响,确定其稳定性及时序性规律,判断其应用于法医实际工作中的潜力,确定适合提取miRNA的时间点,提高检测效率并筛选出适合血痕的存储条件。我们的结果表明,血痕样本中miR-16-5p和miR-451a在所设置的实验条件及时间节点均能被成功检出,表现出较强的稳定性,这可能是由于它们的长度较短,不易降解。与此同时,不同种类的miRNA表现出不同的降解特征,miR-451a与miR-16-5p相比,具有较高的丰度和稳定性,这可能与其所含的GC或CG的序列数有关。此外在实验室条件放置6年的血痕样本中检测出目标miRNA的存在,证实其作为血痕识别特异性标志物的潜力,但同时高湿度和雨水对血痕样本表现出强烈的破坏作用,使得其中miRNA含量急剧下降,证实其应用于室外血痕检验方面仍具有一定的难度。在之前的研究中,人们认为U6具有很强的稳定性,可以作为内参基因辅助进行miRNA的定量工作。但在本次研究中,我们发现高温、高湿环境将加快血痕样本中U6的降解,且随着存储时间的延长,U6的含量逐步降低,证实其不适宜作为内参用于腐败血痕检验工作中。另一方面,该研究有望为法医物证检材的存储提供参考。首先,保证承接血液的载体（玻璃板、棉签、采血卡等）的充分灭菌处理将有利于其后续储存。此外,将血痕检材于37℃条件下烘干,再放置于-20℃、低湿的环境条件下长期存储将更能保证样本中miRNA的检测成功率。

关键词：microRNA;血痕;体液来源鉴定;降解;稳定性

学科专业：法医学

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 不同实验控制环境条件下血痕中microRNA稳定性研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 小结

第二部分 自然环境及实验室存储条件下血痕中microRNA稳定性研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果与讨论

4 小结

全文总结

不足之处与展望

参考文献

文献综述

参考文献

致谢