土壤脲酶是存在于土壤中催化尿素分解、具有氨化作用的高度专一性水解酶[1], 土脲酶活性与越强, 尿素水解越快, 产生的速效氮越多, 作物来不及吸收而损失或随地下水流失的氮素就越多[2]。目前国内外研究证实, 脲酶抑制剂种类很多[3], 包括无机物与无机物, 无机物Ag、Hg和Cu盐效果显著[4], 二元酚、醌类、磷酸胺类化合物都是较有效的有机化合物[5,6]。
土壤脲酶动力学参数反映了酶与底物、土壤有机-无机复合体等之间结合的紧密程度和作用过程, 揭示酶反应的速率与活性, 因此被国内外学者认为是理想的研究指标[1]。有关脲酶抑制剂对脲酶动力学参数影响研究较多, 但将几种化合物配制成混合抑制剂, 研究其对脲酶动力学参数的影响, 目前尚未见报道[7,8,9,10], 而生产实际上, 常常使用混合抑制剂, 极少使用单一的抑制剂。本研究以重庆市灰棕紫泥土为对象, 将配制的混合抑制剂直接加入到土壤中, 研究其对土壤脲酶动力学参数的影响, 探究抑制机理, 旨在为研制尿素缓释剂, 提高尿素利用率提供理论依据。
实验土样取自涪陵区李渡玉米地, 灰棕紫泥。取表土层5~20cm土壤, 混匀、风干、研磨, 过1mm样筛后备用。基本农化性状:有机质1.72g/kg, 碱解氮146.29mg/kg, 有效磷51.27mg/kg, 速效钾74.27mg/kg, p H值5.68。
配制0%、0.5%、1%、1.5%、2%五种不同浓度的硼砂-硫脲-苯甲酸钠混合抑制对土壤进行处理。配制4%、8%、12%、16%、20%五种浓度的尿素溶液作为底物;用美国产EUTECH EC-PH1500酸度计, 配制p H值6.7的柠檬酸缓冲液。脲酶活性测定采用苯酚—次氯酸钠比色法 (靛酚蓝比色法) [11], 略有改动:准确称取5.00g土样置于50m L容量瓶中, 加入1m L甲苯, 静置15min, 然后加5m L不同浓度尿素溶液、10m Lp H6.7的柠檬酸缓冲液和1m L不同浓度混合抑制剂溶液, 摇匀后塞好瓶塞, 于37℃下培养培养6h、12h、24h、36h、48h。培养结束, 定容、过滤, 吸取1ml滤液置于50ml容量瓶中, 加20ml蒸馏水, 摇匀, 然后加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液, 摇匀, 静置20min, 定容, 在756型分光光度计上, 于578nm处测定溶液的吸光度值, 每个处理做3个平行样。用硫酸铵做标准曲线, 进行计算。土壤脲酶酶促反应速度以单位时间内10g土产生的NH3-N mg表示。
以不同底物浓度下, 不同时间内脲酶酶促反应产NH3-N mg量计算反应初速度。脲酶动力学参数采用双倒数法 (Lineweaver-Burk) 作图:1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax, 求米氏常数 (Km) 和最大反应速度 (Vmax) [12]。全部数据用DPS7.5和Excel计算。
以12%的尿素为底物, 测定不可混合抑制剂在不同时间对土壤脲酶活性影响, 结果见表1。由表1分析可知:培养时间6h、12h、24h、36h、48h下, 各脲酶活性均随混合抑制剂浓度的增加而降低, 降幅在10.6%~10.2%, 说明本混合抑制剂对土壤脲酶活性具有良好的抑制作用。
在酶促反应动力学中, 初速度准确、真实的反映酶促反应情况, 所以通常用初速度代表酶促反应速度[13]。由表1可看出:混合抑制剂的加入, 抑制了脲酶酶促反应初速度, 这种抑制作用随抑制剂用量的增加而加强, 其初速度降幅在20.5%~46.2%。
进一步用混合抑制剂浓度与V0进行回归分析, 发现混合抑制剂浓度与V0呈二次线性回归关系 (图1) , 其拟合方程为:Y=0.0806-0.0322X+0.0071X2 (R2=0.9929) , 该方程无极值。由图1可看出:随着混合抑制剂浓度的增加, V0总体呈下降趋势, 其下降幅度随抑制剂浓度增加而减缓。
土壤脲酶Km值是脲酶与底物亲和力的指标, 即是说, Km值越小, 土壤脲酶与底物 (尿素) 的亲和力越强, 形成酶-底物复合体的速度越快;反之, 脲酶与底物结合速度越小[13]。由表2可知:加入混合抑制剂后, Km值略有下降, 说明抑制的加入, 有利于加快尿素与脲酶结合为复合体, 但这种作用很微弱, 因此, 我们可以认为Km基本无变化, 也就是说混合抑制剂对土壤脲酶与尿素的亲和力没有明显的影响。
最大反应速度 (Vmax) 是总酶量的量度, 它反映酶-底物复合体 ([ES]) 分解为产物和酶的速率[13]。由表2可知:混合抑制剂的加入, 降低了Vmax, 其降幅在3.53%~6.62%之间, 说明混合抑制剂能很好地抑制酶-底物复合体分为产物与酶的速度。进一步用混合抑制剂浓度与Vmax进行回归分析, 结果发现混合抑制剂浓度与Vmax呈二次线性回归关系 (图2) , 其拟合方程为:Y=34.5270-2.7817X+0.8429X2 (R2=0.9863) , 该方程无极值。由图2可看出:随着混合抑制剂浓度的增加, Vmax总体呈下降趋势, 其下降幅度随抑制剂浓度增加而减缓。
抑制剂类型主要分为可逆抑制剂与不可逆抑制剂两大类, 其中, 可逆抑制剂分为竞争性抑制、反竞争抑制和非竞争抑制三类[13]。根据可逆抑制剂理论:加入混合抑制剂后, Km几乎不变, Vmax减小, 属于非竞争抑制剂[13];即是说, 混合抑制剂既能与土壤脲酶[E]结合又能与酶-底物复合物[ES]结合;在脲酶酶促反应中, 可以是土壤脲酶先与尿素结合生成[ES], 再与混合抑制剂结合形成[ESI];也可是土壤脲酶先与混合抑制剂结合形成[EI], 再与尿素结合形成[ESI], 其中间产物有三种[ES]、[EI]、[ESI], 前两种是过渡态, 停留时间短, 不稳定, 以[ESI]为主。混合抑制剂的加入使[ESI]比[ES]更为牢固, 而不易分解。
Sor等首先研究证实, 含硼化合物如硼酸、硼砂等是脲酶抑制剂[14], 硫脲能抑制脲酶活性, 是一种弱脲酶抑制剂[15]。本研究证明, 三种化合物混配成混合抑制剂, 能较好地抑制土壤脲酶活性, 其抑制初速度和最大反应硬度能力较强, 对Km影响微弱, 揭示出混合抑制剂属于非竞争抑制剂, 可能是三种化合物均为非竞争抑制原因。
硼砂是良好的脲酶抑制剂, 但由于硼是作物生长的必须元素, 在作物生长过程中, 会逐渐变作物吸收。硫脲是一种硝化抑制剂[16], 同时也是一种弱的脲酶抑制剂[15], 对土壤尿素转化过程有良好的作用, 且硫脲施入土壤后能分解NH4+, 被作物吸收利用, 因此硫脲可作为肥料在生产上使用, 但硫脲有微毒性, 不宜大量使用。苯甲酸钠是一种良好的反硝化抑制剂[17], 也是一种良好的脲酶抑制剂, 但由于它是一种广谱抗微生物试剂, 易穿透细胞膜进入细胞体内, 干扰细胞膜的通透性, 抑制细胞膜对氨基酸的吸收;进入细胞体内电离酸化细胞内的碱储, 并抑制细胞的呼吸酶系的活性[18];因此, 它可能对土壤有益微生物存在抑制作用, 虽然它在土壤中可以被微生物降解[19], 但也不可大量使用。为此, 在生产实际中, 利用三者的有利面而形成互补, 同时能减少单一抑制剂的用量, 减少甚至保证土壤不会有抑制剂残留, 从而达到既能控制尿素分解转化, 又能保证土壤环境不被污染, 具有良好的实际应用价值;当然, 关于混合抑制剂在作物生长的田间实际应用效果以及土壤残留、对土壤微生物的影响, 有待田间进一步研究确认。
摘要：以三种抑制剂复配成土壤脲酶混合抑制剂, 采用室内模拟培养, 用靛酚蓝比色法研究了混合抑制剂对灰棕紫泥土脲酶动力学参数的影响。结果表明, 混合抑制剂对灰棕紫泥土脲酶酶促反应的抑制能力随混合抑制剂浓度的增大而增强, 混合抑制剂的加入, 降低了V0和Vmax值, 而对Km值没有影响, 揭示出混合抑制剂对土壤脲酶的作用类型表现为非竞争性抑制作用。考虑抑制剂的互补性与使用的安全性, 使用混合抑制剂更符合生产实际, 在尿素缓释肥研制上, 具有良好的应用前景。
关键词：土壤脲酶,动力学参数,抑制剂
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