组织工程论文提纲

论文题目：基因增强型组织工程支架的制备及其性能研究

摘要：创伤和肿瘤等因素造成的组织和器官受损或功能性障碍严重危害人类健康。组织工程,作为新兴的组织修复再生的手段,与传统的自体/异体移植术相比具有来源不受限、无免疫排斥反应、不携带致病源和无感染风险等优点,在促进组织缺损修复再生方面取得了可喜的进展。但传统的组织工程大多通过负载于缓释支架的方式直接应用外源性细胞因子,其在体内生理环境下易因弥散、转运和降解而迅速失活,从而难以产生预期的生物学效应,这使得组织工程的应用受到了严重的限制。近年来,出现了将组织工程和基因工程相结合的基因增强型组织工程,它利用基因工程技术将目的基因传递至种子细胞或负载于支架材料上,使特定细胞因子能在体内表达,发挥促进细胞增殖和分化的生物学作用,进而促进组织缺损修复再生。然而,目前基因增强型组织工程的研究多数停留在利用基因转染的终末分化细胞作为种子细胞或利用已知的对组织修复再生有作用的生长因子的编码基因转染干细胞的阶段,这使得基因增强型组织工程要么由于终末分化细胞增殖能力差而仅能用于单一损伤组织的修复再生,要么由于某些生长因子的多重生物学效应而使其生物学功能不够稳定可控,严重限制了其在临床上的实际应用。此外,目前肿瘤相关研究多集中于肿瘤的抑制,尚未见任何涉及肿瘤模型下缺损修复再生的报道。事实上,肿瘤多具有强的破坏性,会对周围组织造成伤害,因此对肿瘤抑制和缺损修复进行一体化治疗更符合临床实践的实际情况,对肿瘤抑制和缺损修复进行的系统性考察才能为临床实际应用提供可借鉴的参考。本文通过目的基因的优化选择和基因传递载体的改良设计,分别考察了基因传递载体对不同种属来源的骨髓间充质干细胞的感染效率,成功实现了多种基因增强型组织工程支架的个性化构建;针对缺损所处组织类型的不同或引起缺损病理原因的不同,分别构建了兔膝关节骨软骨全层缺损、兔膝关节软骨全层缺损、大鼠骨肉瘤条件下胫骨近端骨缺损和小鼠黑色素瘤条件下皮肤全层缺损等动物实验模型,探索了所构建的不同类型基因增强型组织工程支架在骨软骨全层缺损修复再生、软骨全层缺损修复再生、骨肉瘤治疗和骨缺损修复再生以及黑色素瘤治疗和皮肤全层缺损修复再生等领域的潜在应用。本论文主要研究内容和结果如下:1.采用有机泡沫界面矿化法制备了孔隙结构完整、孔径尺寸均一可控和贯通性能良好的多孔羟基磷灰石（HA）支架,解决了传统有机泡沫浸渍法孔隙结构不完整、孔径尺寸不均一和时常堵孔的问题。采用E1和E3区基因同时敲除的方式构建了携带骨形态发生蛋白（BMP-2）和Wnt3α编码基因的重组腺病毒载体,解决了传统重组腺病毒载体细胞毒性高、宿主免疫反应强和感染效率低的问题。将载Wnt3α编码基因的重组腺病毒载体感染的兔BMSCs的氧化海藻酸钠/N-琥珀酰壳聚糖（OSA/NSC）水凝胶与载BMP-2编码基因的重组腺病毒载体感染的兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的多孔HA支架复合用以构建基因增强型组织工程骨软骨双层支架,然后将其应用于兔膝关节骨软骨全层缺损修复再生的研究。实验结果表明,所构建的基因增强型组织工程骨软骨双层支架促进了新生骨软骨组织与宿主骨软骨组织之间的整合,维持了软骨细胞表型的稳定性,实现了骨软骨全层缺损的完全修复再生,促进了修复关节功能的恢复。2.采用气体自发泡的方法制备了具有本征抗菌特性的聚谷氨酸/聚赖氨酸大孔水凝胶。采用tat、rev、nef、vir、vpr和vpu同时敲除的方式构建了携带C型凝集素（CLECSF1）编码基因的重组慢病毒载体,完全保证了其生物安全性,并在一定程度上提高了其感染效率。将携带CLECSF1编码基因的重组慢病毒载体感染的兔BMSCs与聚谷氨酸/聚赖氨酸大孔水凝胶复合用以构建基因增强型组织工程软骨支架,然后将其应用于兔膝关节软骨全层缺损修复再生的研究。实验结果表明,所构建的基因增强型软骨支架促进了新生软骨与宿主软骨的整合,促进了软骨特异性细胞外基质蛋白和软骨特异性胶原蛋白的合成与分泌,实现了软骨全层缺损的完全修复再生,恢复了所修复关节吸收机械冲击的功能。3.采用有机泡沫界面矿化法制备了孔隙结构完整、孔径尺寸均一可控和贯通性能良好的多孔HA支架,采用E1和E3区基因同时敲除的方式构建了携带BMP-2编码基因的重组腺病毒载体,采用tat、rev、nef、vir、vpr和vpu同时敲除的方式构建了携带Bax编码基因的重组慢病毒载体。将携带BMP-2编码基因的重组腺病毒载体感染的大鼠BMSCs和携带Bax编码基因的重组慢病毒载体感染的大鼠BMSCs同时与多孔HA支架复合用以构建基因增强型组织工程骨支架,然后将其应用于骨肉瘤抑制和骨缺损修复再生一体化治疗的研究。实验结果表明,所构建基因增强型组织工程骨支架能够抑制骨肉瘤发展和肺转移,促进了骨缺损修复再生,对荷瘤大鼠的肝脏和肾脏起到了积极的保护作用。4.采用气体自发泡的方法制备了具有本征抗菌特性的聚谷氨酸/聚赖氨酸大孔水凝胶,采用tat、rev、nef、vir、vpr和vpu同时敲除的方式构建了携带Bax编码基因的重组慢病毒载体。将携带Bax编码基因的重组慢病毒载体感染的小鼠BMSCs与聚谷氨酸/聚赖氨酸大孔水凝胶复合用以构建基因增强型组织工程皮肤支架,然后将其应用于黑色素瘤抑制和皮肤全层缺损修复再生一体化治疗的研究。实验结果表明,所构建基因增强型组织工程皮肤支架能够防止黑色素瘤复发和抑制肺转移,促进了皮肤全层缺损的完全修复再生,有效地保护了荷瘤小鼠的心脏、肝脏和肾脏。以上结果表明,本文构建的基因增强型组织工程支架既能促进生理条件下单一或两种组织缺损修复再生,又能实现肿瘤条件下缺损修复和肿瘤抑制的一体化治疗。这为临床实践中多种组织同时缺损的修复再生研究提供了一种有力的工具,为其它病理因素条件下的缺损修复和致病性移除和抑制的研究奠定了基础。

关键词：组织工程;基因工程;重组腺病毒;重组慢病毒;骨软骨全层缺损;软骨全层缺损;骨肉瘤;黑色素瘤

学科专业：材料科学与工程

西南交通大学学位论文创新性声明

摘要

abstract

论文主要缩写对照表

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 组织工程

1.3 基因治疗

1.4 基因增强型组织工程

1.5 课题的提出

1.6 研究目的及意义

1.7 基因增强型组织工程策略的优化设计

1.7.1 支架材料选择及优化设计

1.7.2 种子细胞选择

1.7.3 目的基因的选择

1.7.4 基因传递载体的选择及改良设计

1.7.5 细胞-支架和细胞-水凝胶复合物的构建

第2章 多孔HA支架的制备及其用于异位成骨和骨缺损修复再生的研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验材料及试剂

2.2.2 实验设备

2.2.3 多孔HA支架的制备及表面形貌调控

2.2.4 动物实验及组织学染色分析

2.3 实验结果

2.3.1 XRD结果

2.3.2 SEM结果

2.3.3 Micro-CT结果

2.3.4 孔隙率及抗压强度

2.3.5 组织化学染色

2.4 分析讨论

2.5 本章小结

第3章 基因增强型组织工程骨软骨的构建及其用于临界尺寸骨软骨全层缺损修复再生的研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 材料及试剂

3.2.2 实验设备

3.2.3 复合支架的制备

3.2.4 兔BMSCs的分离、培养及鉴定

3.2.5 重组腺病毒的构建

3.2.6 BMSCs的感染及其成骨分化研究

3.2.7 细胞-支架复合物的构建

3.2.8 动物实验

3.2.9 组织化学及免疫组织化学染色分析

3.2.10 Micro-CT分析及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

3.3 实验结果

3.3.1 重组腺病毒表征及其在体外成骨分化中的作用

3.3.2 新生骨软骨组织与宿主骨软骨组织的整合

3.3.3 兔膝关节骨软骨缺损的修复

3.3.4 兔膝关节功能的恢复

3.4 分析讨论

3.5 本章小结

第4章 基因增强型组织工程软骨的构建及其用于临界尺寸关节软骨全层缺损修复再生的研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 材料及试剂

4.2.2 实验设备

4.2.3 聚谷氨酸/聚赖氨酸水凝胶的制备

4.2.4 兔BMSCs的分离、培养及鉴定

4.2.5 重组慢病毒的构建

4.2.6 重组慢病毒感染BMSCs

4.2.7 细胞-水凝胶复合物的构建

4.2.8 动物实验

4.2.9 组织化学染色分析及评分

4.2.10 修复关节的生物力学特性及RT-PCR

4.3 实验结果

4.3.1 水凝胶支架表面形貌、抗菌结果及溶胀率分析

4.3.2 重组慢病毒感染

4.3.3 软骨修复的大体观察

4.3.4 软骨修复的组织化学染色分析及组织学评分

4.3.5 修复关节软骨功能的恢复

4.4 分析讨论

4.5 本章小结

第5章 基因增强型组织工程骨的构建及其用于骨肉瘤治疗和骨缺损修复再生的研究

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 实验设备、材料及试剂

5.2.2 SD大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定

5.2.3 重组慢病毒的构建

5.2.4 重组腺(慢)病毒感染BMSCs

5.2.5 细胞-支架复合物的构建

5.2.6 大鼠骨肉瘤细胞的培养及动物实验

5.2.7 组织化学染色分析

5.2.8 Micro-CT

5.3 实验结果

5.3.1 多孔HA支架表面形貌

5.3.2 重组慢病毒感染

5.3.3 骨肉瘤细胞培养及骨肉瘤模型的建立

5.3.4 骨肉瘤性骨缺损修复结果

5.3.5 骨肉瘤性骨缺损修复后的脏器组织化学染色

5.4 分析讨论

5.5 本章小结

第6章 基因增强型组织工程皮肤的构建及其用于黑色素瘤治疗和皮肤全层缺损修复再生的研究

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 实验设备、材料及试剂

6.2.2 水凝胶敷料的制备

6.2.3 C57BL/6小鼠BMSCs的分离、培养及鉴定

6.2.4 重组慢病毒的构建

6.2.5 重组慢病毒感染BMSCs

6.2.6 细胞-水凝胶复合物的构建

6.2.7 小鼠黑色素瘤细胞的培养及动物实验

6.2.8 组织化学染色分析

6.3 实验结果

6.3.1 水凝胶支架表面形貌及抗菌结果

6.3.2 重组慢病毒感染

6.3.3 黑色素瘤细胞的培养及黑色素瘤皮肤缺损模型的建立

6.3.4 黑色素瘤性皮肤缺损修复的大体观察

6.3.5 黑色素瘤性皮肤缺损修复后的组织化学染色

6.4 分析讨论

6.5 本章小结

第7章 全文讨论与展望

7.1 全文讨论

7.2 主要研究结论

7.3 研究展望

致谢

参考文献