烟草烟油抗水痘-带状疱疹病毒的药学研究

烟草烟油为茄科烟草属植物烟草(Nicotiana tabacum L.或Nicotiana rustica L.)被烟客用烟斗常年抽吸后,在烟杆内积存的黑色油膏。清代赵学楷在《百草镜》中首次提及烟油:“凡蛇咬有蛇齿留肉内者,烟油涂之。”赵学敏在《本草纲目拾遗》中称烟油为“烟膏”“太极膏”“气泥”“五行丹”等,并记录“治蜈蚣咬:烟筒内膏油,涂在咬处,或烟灰搽之。”在我国土家族和苗族等少数民族地区又称为烟屎,《湖南药物志》载:“治痧症,疗毒:烟油少许,对水服。”笔者通过民间调查和文献检索发现,烟草烟油对治疗带状疱疹有奇效。因烟膏来源紧缺,为了应用方便,课题组以烟草为原料,以民间烟油膏HPLC指纹图谱为依据,研制出了烟草烟油。

1.材料

(1)实验动物:

健康中国本兔,18只,体重2kg左右,雌雄各半,由徐州医学院实验动物中心提供,许可证号:SYXK(苏)2015-0029。

(2)细胞和病毒:

HEL细胞(人胚肺成纤维细胞)购自美国ATCC公司;VZV(水痘-带状疱疹病毒)购自武汉艾美捷科技有限公司。HEL细胞传代后滴定其半数细胞培养物VZV感染量(TCID50)为1×10-3.8/100μl。

(3)药物和试剂:

烟草烟油(稠浸膏)自制(批号为151005),应用时以生理盐水稀释,121℃高压湿法灭菌30min,密封后4℃冷藏保存;注射用阿昔洛韦(ACV)(批号为150705),由华北制药股份有限公司提供;阿昔洛韦软膏(ACV软膏)(批号为150412)由上海通用药业股份有限公司提供;DMEM培养基、胎牛血清为美国Invitrogen GIBCO公司产品;MTT为AmrescO公司产品。

(4)主要仪器:

细胞培养箱(HERA Cell 150),荧光倒置显微镜(Olypus),Safire 2型微孔板测读器(瑞士TECAN公司),XS105DU电子天平(瑞典METTLER TOLEDO),超低温冰箱(日本Panasonic)。

2.方法与结果

(1)烟草烟油对HEL细胞毒性测定

将HEL细胞以2×104个/孔接种于96孔板中,置于37℃、 5%CO2细胞培养箱中培养,24h后给药,即将稀释好的烟草烟油溶液和ACV溶液(浓度分别为600μg/ml,1200μg/ml,2400μg/ml,3600μg/ml,4800μg/ml)加入到细胞培养液中,每孔20μl,重复6孔,正常细胞对照组加入等量培养基,继续培养,连续3d,每日在荧光倒置显微镜下观察各组HEL细胞生长变化情况,最后用MTT法检测各组细胞存活率。整体实验重复3次,最后以Probit回归方法计算烟草烟油和ACV对HEL细胞的半数中毒浓度(TD50)。

结果显示,烟草烟油和ACV对细胞毒性作用表现为在给定浓度范围内(600～4800μg/ml),随着浓度的增加,HEL细胞存活率逐渐降低,并出现变形、破碎、脱落等现象,烟草烟油和阳性药物ACV对HEL细胞的TD50分别为308μg/ml和78.5μg/ml。

(2)烟草烟油对VZV感染细胞抑制作用的测定

将HEL细胞以2×104个/孔接种于96孔板中,置于37℃、 5%CO2细胞培养箱中培养,24h后用VZV病毒感染,即用100 TCID50/100μl的VZV病毒溶液(1×10-1.8/100μl)于35℃感染HEL细胞,每孔50μl,重复6孔。2h后吸弃病毒溶液,加入稀释好的烟草烟油溶液和ACV溶液(浓度分别为以2～4倍比稀释的最大无毒浓度TD0),同时设立正常细胞对照组和病毒对照组,继续培养,连续3d,每日在荧光倒置显微镜下观察各组HEL细胞生长变化情况。最后用MTT法检测各组细胞存活率,根据在570nm波长处测定的OD判断并计算不同浓度的烟草烟油溶液和ACV溶液对VZV病毒的抑制情况。病毒抑制率=(药物组OD-病毒对照组OD)/(正常细胞对照组OD-病毒对照组OD)×100%。最后以Probit回归方法计算烟草烟油和ACV对HEL细胞感染VZV的半数有效浓度(ED50),并计算治疗指数(TI=TD50/ED50)。

结果显示,烟草烟油和阳性药物ACV对HEL细胞感染VZV的ED50分别为12.5μg/ml和16.0μg/ml,TI分别为24.6和4.9,烟草烟油对VZV的抑制率随着其浓度的增加而增高,在50μg/ml时高达94.8%。

(3)烟草烟油对家兔感染水痘-带状疱疹病毒的影响

①病毒采集:

选择患带状疱疹7天内的病人,采集其疱疹内容物,用50%甘油磷酸盐缓冲液保存,置于-80℃超低温冰箱中备用(带状疱疹内容液由连云港市中医院东区分院提供)。

②病毒接种:

取健康中国本兔18只(雌、雄各半),背部选择性固定区域脱毛,观察2天无恙后,分别经眼前房注入100μl带状疱疹内容液接种,接种后用3%硼酸溶液清洗眼部。VZV接种后,家兔食欲降低、体温升高、活动减少、呼吸减慢,并在24～48小时内出现水痘-带状疱疹症状,表现为水疱长出且膨大,疱壁发亮,内容物先清澈后渐浑浊,并逐渐出现离散的水疱群。

③家兔给药:

接种VZV的家兔随机分为三组(每组雌、雄各半):A.治疗组6只,使用烟草烟油(生理盐水调稀);B.阳性对照组6只,使用ACV软膏;C.空白对照组6只,使用生理盐水。均搽涂脱毛患部,全部覆盖疱疹,1日3次,并常规应用VitB12。

④指标观察:

A.模型观察:家兔水疱长出情况及体征变化情况(即食欲、体温、活动、呼吸情况);B.疗效观察:包括止痛时间(治疗开始到家兔异常活动情况明显改善)、消肿时间(治疗开始到红肿消失)、结痂时间(治疗开始到水疱干涸、结痂)、痊愈时间(治疗开始到症状消失,并恢复至接种前状态);病程(患病开始至痊愈)。

本研究结果综合说明,烟草烟油HPLC研究显示,烟碱是烟袋烟油的主要成分(含量达8%),而有研究报道,糖蛋白H是所有疱疹病毒进行病毒-细胞及细胞间传播所必需的I型跨膜蛋白,抗糖蛋白H抗体能够破坏带状疱疹病毒的致病性,至于烟草烟油抗带状疱疹是否与烟碱抗糖蛋白H有关,有待进一步深入研究。

摘要：目的:研究烟草烟油抗水痘-带状疱疹病毒(VZV)作用。方法:首先测定烟草烟油对HEL细胞的毒性,然后从细胞水平测定烟草烟油抑制VZV的作用,从整体动物水平测定其对家兔感染水痘-带状疱疹病毒的影响,最后通过临床观察其对带状疱疹患者的治疗作用。结果:烟草烟油细胞毒性较低(TD50=308μg/ml),能显著抑制VZV感染细胞作用(TI=24.6),对感染水痘-带状疱疹病毒的家兔的止痛、消肿、结痂、痊愈时间及病程与空白组比较,均具有极显著性差异(P<0.01),并能使80%带状疱疹患者治疗达良级。结论:烟草烟油通过抑制VZV而显示出良好的治疗带状疱疹作用。

关键词：烟草烟油,水痘-带状疱疹病毒,带状疱疹

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