水痘全球分布, 全年均可发生, 以冬春季节多见, 散发性。偏僻地区偶可爆发, 城市可每2～3年发生周期性流行。人群普遍易感, 主要见于儿童, 病人为唯一的传染源, 发病后2～5 d特异性抗体出现, IgM滴度逐渐升高, 检测血液中IgM含量可以确诊水痘病毒的感染, 病毒存在于病人皮肤粘膜组织疱疹液及血液中, 发病后1～2 d出现疱疹, 疱疹呈向心性分布, 先躯干后四肢, 采样部位主要是四肢的疱疹液。该研究对2002—2009年收集水痘病人血清采用PCR的方法可以检测疱疹液中的水痘病毒核酸。进一步确诊。
收集水痘病人血清50份用于ELISA方法检测IgM, 疱疹液50份, 用于PCR水痘分子生物学检测, 正常人50份血清, 50份皮肤表面涂抹。正常人标本与病人标本同时检测, 检测项目相同。
ELISA主要基于抗原或抗体能吸附致固相载体的表面并保持其免疫活性。抗原或抗体与酶形成酶的结合物仍保持其免疫活性和酶的催化活性的基本原理。
水痘IgM的检测, 采用ELISA试剂盒, 被检血清离心后取10μL血清稀释于500μL稀释液中, 混匀取200μL混合液加入T480μL后加入120μL稀释液, 混匀静置15 min, 取试剂盒中的反应板, 按空白、两个阳性对照、一个阴性对照及样品摆放, 阳性孔加入阳性对照试剂100μL, 阴性孔加入100μL阴性对照, 测定孔加入被测样品, 随后封孔保湿, 放入37℃温箱中孵育60min, 60 min后用洗涤液洗涤, 洗涤完毕加入抗人球蛋白100μL, 继续封孔保湿37℃温箱中孵育30 min, 30 min后用洗涤液洗涤, 洗涤完毕加入100μL酶底物, 继续封孔保湿37℃温箱中孵育30 min, 30 min后加入终止液, 在酶标仪405 nm波长处比色, 计算结果。
PCR分子生物学检测程序, RNA载体加入310μL (AVE) , 取5.6μL, 加入560μL (AVL) 加入140μL疱疹液, (疱疹液使用之前, 应在振荡器上反复震荡, 使疱疹液从棉签分离) , 在震荡器上震荡之后静止10 min, 加入560μL无水乙醇, 于振荡器上震荡, 高速离心机8 000转/min离心1 min, 让液体经过柱子用真空抽吸的办法两次抽吸, 留取柱子, 加入AW1 500μL, 真空泵抽吸干净, 加入AW 2 500μL, 取下柱子放入新的离心管中, 13 000转3 min, 弃离心管留柱子, 加入AVE 40μL, 重新换离心管8 000转/分钟离心1 min, 弃掉柱子, 留下离心管中的液体, 此液体为RNA提取液。PCR体系采用水痘-带状疱疹病毒核酸检测试剂盒 (实时荧光PCR法) R-t PCR反应混合液-17.8μL, DNA聚合酶0.2μL, 样品核酸2μL, 阳性/阴性质控品2μL, 探针参数设置, 水痘-带状疱疹病毒探针, 报告基因团设置FAM, 淬火基团设置NONE。反应条件预变性阶段, 95℃2 min, 循环阶段, 变性95℃, 15 s, 退火及延伸60℃, 1 min;共40个循环。结果:阳性出现S形扩增曲线, CT值<35。可疑出现S形扩增曲线, CT值>35, 阴性没有S形扩增曲线。
ELISA方法和PCR方法各检测样品100例.对照组 (健康人群) 50例, 水痘病人50例, 两组分别取血清和疱疹液 (对照组疱疹液为皮肤涂抹液) ELISA方法检测水痘病人血清50例, 48例阳性, 2例可疑, 对照组50例均为阴性。见表1。
PCR方法检测水痘病人疱疹液50例, 49份阳性, 1例为阴性, 对照组为阴性。见表2, ELISA方法检测2例为可疑是因为IgM抗体产生需要一定的时间, 抗体水平还没有达到检出浓度, 此时采的血清在检测时出现了可疑值, PCR方法检测出现1例阴性是因为水痘疱疹分为红色斑疹期和红色丘疹期疱疹期, 采样的时间在红色斑疹和红色丘疹期, 经χ2检验, P<0.05, χ2=0.343 6两者差异无统计学意义。
ELISA方法检测材料为人的血清, 一般采取静脉血, 水痘高发于儿童及婴幼儿, 因为婴幼儿的恐惧心理不予配合静脉采血比较困难, 易造成溶血而影响检验结果。PCR方法的检材是疱疹液, 只需将病人的疱疹液轻轻剖开, 用无菌棉签蘸取疱疹液, 对病人的伤害较小, 婴幼儿对此采样方法易于接受。
ELISA方法检测水痘IgM抗体, 需要3.5 h, PCR方法检测水痘需要3 h, 从时间上看几乎相同, 但是ELISA方法检测水痘IgM抗体全程都要有实验人员参与, PCR方法只是前处理需要25 min, 之后由仪器完成, PCR方法在较大程度上节省了人力。
ELISA方法实验条件要求不高相对比较简单, 一般实验室即可完成, 使用的酶标仪比较经济, 易于操作, PCR方法实验条件要求较高, 为了防止交叉污染, 提取、配置体系、扩增过程均需要单室, 扩曾仪器在经济上也比较昂贵。
实验显示ELISA方法和PCR方法检测水痘检测结果一致率非常高, 两种检测方法具有高度的一致性, 均可以作为确诊水痘理想的实验方法。
摘要：目的 应用PCR方法对水痘进行分子生物学检测, 和用ELISA方法对水痘IgM抗体检测, 进一步比较两种检测方法的优略。方法 对德国维润赛润研发有限公司研制的ELISA方法检测水痘IgM抗体和成都生物制剂公司生产研制的PCR水痘分子生物学检测水痘病毒核酸方法进行比对实验。对比实验分为2组, 试验组和对照组, 试验组为水痘病人50人, 对照组为正常健康人群。结果 对照组ELISA方法和PCR方法均为阴性。试验组50份血清用ELISA方法检测水痘IgM抗体, 48份阳性, 2份不确定。50份疱疹液用PCR方法检测, 49份阳性, 1份不确定.两种检测方法检测结果一致率为97.9% (48/49) 。结论 两种检测方法具有高度的一致性。
关键词：水痘,PCR,ELISA
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