提取工艺论文提纲

论文题目：山竹中具有抑制QR-2和PTP1B活性成分的发现、体内代谢及其提取工艺优化研究

摘要：山竹（Garcinia mangostana L.）是一种广泛种植于热带的水果,富含多种营养物质,具有极高的药用价值,近年来也出现一些关于山竹提取物及其活性成分的研究报道。疟疾通过蚊虫叮咬或输血感染了疟原虫的血液来进行传播,红细胞中醌还原酶2（QR-2,NQO2）的活性受到抑制会导致细胞内超氧化物自由基的积累,而超氧化物自由基的积累可能是杀死寄生虫的原因。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）是一种重要的调控葡萄糖体内平衡和能量代谢的酶,在胰岛素及瘦素信号传导通路中起着重要的负调控作用,PTP1B过度表达,使蛋白质酪氨酸激酶的活性降低,从而削弱胰岛素受体对胰岛素的约束力,引起胰岛素抵抗,最终导致2型糖尿病。本论文采用UF-HPLC-QTOF/MS法对山竹提取物入血成分中可能的QR-2及PTP1B抑制剂进行筛选及鉴定。山竹以乙醇热回流提取法进行提取,提取物进行动物灌胃给药,并采用眼眶取血法进行取血,对血清进行沉淀蛋白处理,得到血清提取物后与QR-2共孵育,采用UF-HPLC-QTOF/MS法对山竹提取物给药后大鼠血液中能与QR-2形成的配合物的化合物进行筛选,共筛选出16种氧杂蒽酮类化合物,它们分别为mangostenone C,1,3,6,7-tetrahydroxy-8-prenylxanthone,garcinone C,garcimangosone C,1,5,8-trihydroxy-3-methoxy-2-（3-methylbut-2-enyl）xanthone,garcinone D,mangostanol,1,7-dihydroxy-2-（3-methylbut-2-enyl）-3-methoxyxanthone,γ-mangostin,8-deoxygartanin,1,3,7-trihydroxy-2,8-di-（3-methylbut-2-enyl）-xanthone,α-mangostin,garcinone E,9-hydroxycalabaxanthone,β-mangostin,tovophyllin A。接下来,选出6种含量较大的化合物（γ-mangostin,8-deoxyartanin,1,3,7-trihydroxy-2,8-di-（3-methylbut-2-enyl）-xanthone,α-mangostin和9-hydroxycalabaxanthone）进行体外酶活性实验,结果显示γ-mangostin的抑制活性最强,IC50值为3.82±0.51μM。分子对接结果显示,氧杂蒽酮结构中酚羟基和异戊二烯基较少则很难与QR-2形成相互作用关系;具有四环结构的氧杂蒽酮很难进入QR-2的活性位点。另外,药代动力学结果表明,六种氧杂蒽酮均可以在体内快速分布,并出现二次达峰现象,而肝肠循环可能是导致分析物出现双峰现象的主要原因。本实验是由山竹果及其主要活性成分（氧杂蒽酮）可抑制恶性疟原虫的生长,但其作用机制尚不清楚,我们推测血液中存在的某些摄入的山竹果成分通过抑制QR-2的活性,从而发挥抗疟作用,或许可以成为按需食用山竹果来帮助预防疟疾发生的理论基础的推测进行设计。在本研究中,采用UF-HPLC-QTOF/MS方法,对大鼠口服山竹提取物后的血液样本进行筛选,以确定山竹中的化合物是否可以对QR-2的活性进行抑制。另外,还对大鼠口服山竹提取物进行了药代动力学分析,探讨了实验的意义。这项研究的结果可以为经常食用山竹果在预防疟疾方面的益处提供一些理论支持。山竹以乙醇热回流提取法进行提取,提取物进行动物灌胃给药,并采用眼眶取血法进行取血,对血清进行沉淀蛋白处理,得到血清提取物后与PTP1B共孵育,采用UF-HPLC-QTOF/MS法对山竹提取物给药后小鼠血液中能与PTP1B形成的配合物的化合物进行筛选,从小鼠血液中鉴定出六种氧杂蒽酮（γ-mangostin,8-deoxyartanin,1,3,7-trihydroxy-2,8-di-（3-methylbut-2-enyl）-xanthone,α-mangostin,garcinone E和9-hydroxycalabaxanthone）并进行了体外酶活抑制试验。其中最有效的PTP1B抑制剂是garcinone E,其IC50值为0.43±0.11μM。并且利用UHPLCQQQ法进行的组织分布试验表明,这些氧杂蒽酮吸收迅速,在不同组织中分布广泛。本实验的结果显示,山竹提取物中发现的部分氧杂蒽酮也可以改善糖尿病的一些症状且山竹中的这些氧杂蒽酮可以被吸收,被吸收后会对PTP1B产生抑制作用,这项结果可以为减轻糖尿病影响所需的山竹果的日摄入量提供了一些线索。为了能更加充分的利用山竹资源,提高山竹提取物中的六种主要活性成分即γ-mangostin,8-deoxyartanin,1,3,7-trihydroxy-2,8-di-（3-methylbut-2-enyl）-xanthone,α-mangostin,garcinone E和9-hydroxycalabaxanthone的提取率。实验首先对加热提取法、超声辅助加热提取法及球磨提取法进行单因素考察,分别考察液料比、提取时间和乙醇浓度等对提取率的影响;然后再用响应面分析法优化提取工艺,从而确定最佳提取工艺。以γ-mangostin为例,加热提取法实际提取工艺参数为:提取时间150 min,提取温度为70℃,液料比40 m L/g,实际测得的得率为0.711%,与理论预测值相比相对误差为2.1%左右;球磨提取法实际提取工艺参数为:提取时间30.0 min,球磨机功率为20.0 Hz,液料比32 m L/g,实际测得的得率为0.534%,与理论预测值相比相对误差为4.5%左右。超声辅助加热提取法,提取时间较长,不适宜作为山竹中六种氧杂蒽酮类化合物的提取方法。综上所述,本研究可为山竹果作为功能性食品成分抑制QR-2活性的潜在应用提供了新的视角,也为通过抑制PTP1B从而减轻糖尿病影响所需的山竹果每日摄入量提供了一些线索。而山竹对防治疟疾和糖尿病的体内机制,以及摄入山竹果产生积极影响所需的用量、频率和方式仍有待进一步研究。

关键词：山竹提取物;QR-2;PTP1B;体内代谢;提取工艺

学科专业：药物化学

摘要

ABSTRACT

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前言

0.1 山竹的研究现状

0.2 山竹提取物及主要成分药理作用

0.2.1 抗肿瘤活性

0.2.2 抗氧化活性

0.2.3 抗微生物活性

0.2.4 抗疟疾活性

0.2.5 抗糖尿病活性

0.2.6 其他活性

0.3 山竹的化学成分提取工艺研究进展

0.4 研究目的及设计思路

第1章 山竹提取物中QR-2抑制成分的鉴定及药代动力学研究

1.1 实验材料

1.1.1 药品

1.1.2 实验仪器与耗材

1.2 实验过程与方法

1.2.1 山竹提取物的制备

1.2.2 实验动物准备

1.2.3 利用UF-HPLC-QTOF/MS筛选QR-2抑制成分

1.2.4 体外QR-2酶活性测定

1.2.5 QR-2抑制剂分子对接

1.2.6 药代动力学实验

1.3 实验结果

1.3.1 QR-2配体的结构鉴定

1.3.2 QR-2体外抑制活性和计算模拟对接结果

1.3.3 山竹中六种氧杂蒽酮的药代动力学结果

1.4 讨论

1.5 小结

第2章 山竹提取物中PTP1B抑制成分的鉴定及组织分布研究

2.1 实验材料

2.1.1 药品

2.1.2 实验仪器与耗材

2.2 实验过程与方法

2.2.1 山竹提取物的制备

2.2.2 实验动物准备

2.2.3 利用UF-HPLC-QTOF/MS筛选PTP1B抑制成分

2.2.4 体外PTP1B酶活性测定

2.2.5 PTP1B抑制剂分子对接

2.2.6 组织分布实验

2.3 实验结果

2.3.1 PTP1B配体的结构鉴定

2.3.2 PTP1B体外抑制活性和计算模拟

2.3.3 组织分布实验及方法学考察结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 山竹中六种氧杂蒽酮类化合物提取最佳工艺条件的确定

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.2 实验过程与方法

3.2.1 单因素实验

3.2.2 响应面试验

3.3 实验结果

3.3.1 加热提取法单因素实验结果

3.3.2 球磨提取法单因素实验结果

3.3.3 超声波预处理加热提取率的单因素试验结果

3.3.4 加热提取法响应面实验结果

3.3.5 球磨提取法响应面实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 结论与展望

4.1 结论

4.2 进一步工作的方向

致谢

参考文献