一种有效的红树根部总RNA提取方法

一种有效的红树根部总RNA提取方法（推荐3篇）

一种有效的红树根部总RNA提取方法 篇1

活性污泥高质量总RNA提取的一种有效方法

摘要：提取高质量的RNA是在基因表达水平上研究废水生物处理过程活性污泥中微生物菌群变化及关键调控基因表达规律的必要条件,但由于活性污泥富含腐殖质与RNA酶,导致常规提取方法难以获得高质量的RNA.本研究通过反复探索与试验,得到了一种经济而快捷的从活性污泥中提取高质量RNA的方法,即在PBS洗涤沉淀污泥的基础上,用含PVP和巯基乙醇的.CTAB(十六烷基溴化三甲胺)裂解液裂解活性污泥细胞,并与细胞中的核酸形成核酸-CTAB复合体,然后用酚-氯仿-异戊醇去除细胞裂解液中的蛋白,最后采用LiCl选择性沉淀其中的RNA.经核酸蛋白测定仪和1 %变性琼脂糖凝胶电泳检测表明,用此方法提取的RNA均一性和完整性好,并且具有反转录活性.作 者：黎秋华    李平   陈忠正    吴锦华    梁世中    LI Qiu-hua    LI Ping    CHEN Zhong-zheng    WU Jin-hua    LIANG Shi-zhong  作者单位：黎秋华,梁世中,LI Qiu-hua,LIANG Shi-zhong(华南理工大学生物科学与工程学院,广东,广州,510006)

李平,吴锦华,LI Ping,WU Jin-hua(华南理工大学环境科学与工程学院,广东,广州,510006)

陈忠正,CHEN Zhong-zheng(华南农业大学食品学院,广东,广州,510640)

期 刊：陕西科技大学学报（自然科学版）  ISTIC  Journal：JOURNAL OF SHAANXI UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：, 26(4) 分类号：X172 关键词：活性污泥    RNA提取    CTAB   

一种有效的红树根部总RNA提取方法 篇2

目前, 国内关于植物组织总RNA提取方法的报道很多, 但是有关沙棘总RNA提取报道很少。在现有的报道中, 绝大多数常规的植物组织总RNA提取方法均存在有比较费时的缺点。沙棘叶片中又富含多糖、多酚、粗蛋白、粗脂肪、类黄酮及维生素等多种次生代谢物质[2,3], 加之内源RNase的影响, 这给提取沙棘叶片高质量的RNA增加了难度。本研究在RNAplant Plus总RNA提取试剂提取的方法上进行了改良, 以期在较短时间内获得高质量的沙棘叶片RNA, 进而为以后沙棘相关的分子生物研究打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的沙棘叶片采自陕西省定边县西南林业大学实习基地, 为移栽后两年的实生苗嫩叶。

1.2 试验试剂

试验所用主要试剂有RNAplant Plus总RNA提取试剂 (TIANGEN公司) , DEPC (Sigma公司) , DNA酶I (Takara公司) , 其他试剂均为国产分析纯。用于RNA提取的所有试剂及一次性塑料耗材均用0.1%DEPC水 (V/V) 处理并高压灭菌, 玻璃制品及研钵等180℃烘烤8h备用。

1.3 试验方法

RNAplant Plus总RNA提取试剂改良法在加入氯仿之前加入DNA酶I, 以去除RNA中残留的基因组DNA, 其他步骤均按说明书进行。具体步骤如下:提取前按1:4 的体积比将β-巯基乙醇与RNA Plus reagent混合;取不多于0.1g冷冻沙棘叶片粉末, 加0.5m L提取试剂 (4℃) , 振荡至彻底混匀; 室温平放离心管5min; 4℃ 12000rpm离心1min, 上清液转入新的无RNase离心管;加入0.1m L5MNa Cl, 温和混匀;加入DNA酶I, 轻轻吹打混匀1min;加入0.3m L氯仿, 上下颠倒混匀;4℃12000rpm离心10min, 取上层水相转入新的无RNase离心管;重复步骤6、7 一次;加与所得水相相等体积的异丙醇, 混匀, 室温放置10min;4℃12000rpm离心10min。弃上清液, 注意不要倒出沉淀。加1m L75%乙醇 (沉淀可能很难看出, 应小心操作) ;4℃5000rpm离心3min。倒出液体, 注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体短暂离心, 然后用枪头吸出, 室温晾干2~3min;加50μl无RNase水, 反复吹打、混匀, 充分溶解RNA;室温条件下12000rpm离心1min, 取上清液转入干净的无RNase离心管中, -70℃保存。

1.4 RNA完整性分析

称取0.5g的琼脂糖于三角瓶中, 加入50m L0.5×TAE电泳缓冲液, 配制成1%的琼脂糖电泳凝胶, 加热使其完全溶化, 冷却后小心倒入胶膜内, 室温放置0.5h左右。分别取5μl总RNA样品, 在1%琼脂糖凝胶电泳中检测, EB (溴化乙锭) 中染色后, 凝胶成像系统成像观察RNA完整性, 并拍照记录结果。

1.5 RNA纯度分析

取总RNA2μl, 用无RNAase的DEPC水稀释50 倍, 加入石英比色杯中, 在核酸蛋白仪上测定A260/A280和A260/A230值, 分析其纯度。

2 结果与分析

2.1 凝胶电泳分析

琼脂糖凝胶电泳检测结果 (图1) 表明, 未用DNA酶I处理得到的沙棘总RNA电泳图谱 (见图1-a) 可以看到亮度很高的28s和18s两条带, 且28s条带与18s条带亮度比约为2:1, 但在28s上方可见明显的其他条带, 表明基因组DNA未彻底去除。在加入DNA酶I之后成功地去除了DNA (见图1-b) , 并且对总RNA质量、浓度影响不大, 无明显的弥散现象, 表明RNA完整性较好。

2.2 核酸蛋白仪分析

一般认为质量较高的RNA样品, 其A260/A280应在1.7~2.0范围内, 而A260/A230应大于2.0。当A260/A280<1.7时, 说明样品中存在酚类或蛋白质等有机物杂质;当A260/A230>2.2 时, 说明RNA已降解, 而A260/A230<2.0 时, 说明RNA样品中含有其他如萜类化合物等次生代谢物的干扰[4]。由表1 可见本研究中未用DNA酶I处理提取的RNA其A260/A280和A260/A230分别为1.71 和1.12, 表明这种方法提取的RNA纯度不高, 而用DAN酶I处理后提取的RNA其A260/A280和A260/A230分别为1.79 和2.07, 表明这种方法提取的沙棘叶片总RNA纯度较高。

RNA plant Plus总RNA提取试剂改良法的RNA产率为298.1μg/g, 低于未加DNA酶I处理的433.4μg/g, 可能是由于前者加入的DNA酶I对RNA也起到了一定的降解作用, 造成了RNA产量有所下降, 也可能是后者对DNA的去除不彻底, 对RNA的得率有所影响。

3 结论与讨论

植物组织总RNA的提取是进行下游分子生物学实验的关键基础, 高质量的RNA是进行下游实验成功的保障。传统提取RNA的方法有异硫氰酸胍法[5]、苯酚法[6]、SDS法[7]、CTAB法[8]及改良Trizol法[9]等。这些方法可以有效地提取大部分动物组织RNA, 但如沙棘这种富含多糖、多酚和蛋白质等次生代谢产物的高等植物组织, 使用这些方法很难得到纯度较高的总RNA[10,11,12]。

多糖在水中的理化性质与RNA极为相似, 在提取过程中会与RNA结合形成胶状沉淀, 常规的提取方法很难避免在去除多糖的同时造成RNA产量的下降[13]。而酚类物质在细胞破碎时被释放出来, 并会氧化成醌类物质与RNA形成不可逆的结合, 从而大大降低了RNA的活性[14]。而且随着植物的生长发育, 不同的发育时期组织内次生物质积累的量也不同。同时, 由于RNase活性很强, 整个实验过程中, 微量的外源RNase或内源RNase都会使提取的RNA发生降解。因此, 采样时候要选取幼嫩的叶片;实验过程应尽量保证在冰上进行, 以降低内源RNase的活性, 而且要勤换手套, 以降低外源RNase的干扰;材料研磨要彻底, 且研磨后加入到提取液中的动作要迅速, 加入量要适宜。

一种有效的红树根部总RNA提取方法 篇3

关键词：发菜；总RNA；提取；方法优化

中图分类号：Q781文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）09-0058-03

收稿日期：2014-08-22

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360054）。

简介作者：杨佳（1988—），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事资源植物学方面的研究。E-mail：yangjia713@126.com。

通信作者：梁文裕，博士，教授，主要从事植物资源及植物分子生物学的研究。E-mail：liangwy2009@163.com。生物体性状和对外界环境的响应归根到底是由基因调控的，基因调控主要涉及到核酸、蛋白质等生物分子，高质量RNA是进行基因表达分析的基础。细胞内RNA分子多样性和易被降解的特性决定了RNA提取过程的复杂性[1]，RNA酶高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。RNA提取过程中出现的RNA酶有2种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源RNA来自RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身以及分离过程中用到的试剂或溶液，但这些外源性RNA酶可以通过RNA酶抑制剂处理或使用RNA研究的专用试剂等措施来解决[2-4]。而内源性RNA酶存在于材料本身，如材料的不新鲜会降低RNA的产量，破碎细胞内含物常与RNA形成难溶的物质（多糖类等）导致RNA分离困难[5-6]，因此，诸多因素会直接影响RNA的提取效果，增加RNA的提取难度。

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻，生长在干旱-半干旱荒漠草原地区，具有独特的抗干旱、高温、高光照度、紫外线等非生物胁迫的特性[7]。RNA提取是探索发菜抗逆差异基因表达或转录组研究的重要基础，但由于发菜藻体被较厚的胶质鞘包被，对发菜藻体和细胞的破碎存在一定难度，同时发菜藻体富含的多糖、色素、蛋白质等会以不同方式干扰RNA的提取，从而加大了发菜藻体RNA提取的难度。目前，国内尚无发菜高质量RNA提取的相关报道，找到适合提取发菜总RNA的方法具有重要意义。本研究对3种发菜藻体RNA的提取方法进行比较和优化，筛选出最适合发菜RNA的提取方法，为从抗逆差异基因表达或转录组角度研究发菜耐干旱、抗紫外辐射等机理奠定重要基础。

1材料与方法

1.1材料

野生新鲜发菜采自宁夏贺兰山发菜自然生长地。

1.2发菜藻体总RNA的提取及优化

1.2.1Omega试剂盒法提取发菜藻体总RNA将研磨充分的发菜藻体粉末转入Buffer RCL中（含β-巯基乙醇），迅速涡旋振荡，使材料充分裂解，按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒说明书中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ进行试验。

1.2.2Trizol法提取发菜藻体总RNA按照TRIzol Reagent说明书进行发菜藻体RNA的提取。

1.2.3天根试剂盒法提取发菜RNA将充分研磨至粉末的发菜藻体迅速转移至裂解液SL（含β-巯基乙醇）中，立即涡旋剧烈振荡混匀，按天根公司RNAprep Pure Plant Kit试剂盒步骤提取发菜藻体总RNA。

1.3发菜藻体总RNA提取方法的优化

1.3.1Omega试剂盒方法的优化参照Omega试剂盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL进行材料的裂解。试验步骤中增加DNase I，即当RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后，加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上，10 000 g离心1 min，把配好的DNase Ⅰ mix准确地加入柱子中心，室温静置15 min；将HiBindTM RNA Mini柱子放入1个新的收集管中，加400 μL RWC Wash Buffer，静置5 min，10 000 g离心 1 min；最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水进行RNA的提取。

1.3.2改良Trizol法提取发菜RNA对TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的发菜细胞中加入1 mL Trizol 后，用涡旋混合器充分混匀，并在冰上放置15 min；55～60 ℃水孵育10～15 min后，4 ℃放置1 h再转移至-80 ℃冰箱备用。

1.3.3天根试剂盒方法的优化参照天根试剂盒法稍作修改。将研磨好的材料加入裂解液SL充分涡旋振荡混匀后，12 000 g 离心3 min；2次加入去蛋白液RW1后，放置1 min再进行离心1 min；用漂洗液RW漂洗3次再空转离心2 min；加入RNase-Free水后于室温放置5 min后离心收集RNA。

1.4RNA质量和完整性检测

1.4.1琼脂糖凝胶电泳检测分别取RNA样品进行1.0%的琼脂糖凝胶，电泳条件为0.5×TAE缓冲液、160 V恒压、15 min，紫外灯下观察RNA条带并照相记录结果。

1.4.2RNA产量和纯度检测RNA产量和纯度通过核酸浓度测定仪进行检测。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.2之间，D260 nm/D230 nm比值在2.0左右，说明RNA纯度较高，D260 nm/D280 nm比值为2.0时质量最高[8]。用RNase free ddH2O作为空白对照，取1 μL RNA样品，用核酸浓度测定仪检测D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的浓度（ng/μL）值。

2结果与分析

2.13种方法提取发菜总RNA质量比较

Omega试剂盒法提取的发菜总RNA样品电泳显示无典型的RNA条带（图1）；Trizol法所提RNA无23S、16S条带，只有1条条带，表明RNA完全降解（图2）；天根试剂盒法提取的发菜总RNA电泳结果表明，23S、16S条带明显，但条带拖尾现象严重（图3）。

用核酸浓度测定仪分别检测3种方法所提发菜藻体RNA的产量和纯度，检测结果表明，Omega试剂盒所测值均超出了正常值的范围；Trizol法所提RNA相关数据远远低于正常值范围，RNA浓度值较高，说明所提RNA不纯，蛋白质、多糖等杂质污染严重；天根试剂盒法所得数值均正常，且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0，说明RNA纯度较高，可进行优化后用于后续的分子试验（表1）。

2.23种方法优化后所提发菜藻体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测

优化后Omega试剂盒法所提发菜总RNA（图4）与优化表1不同方法所提发菜藻体RNA的质量及产量检测

方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA浓度

（ng/μL）峰值波长

（nm）Omega试剂盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根试剂盒法2.071.9397.1260

前（图1）无明显差异，用DNase处理后，仍有杂带，无明显改变，在最下1条亮带以上，能清晰看到4条条带，这与正常RNA电泳条带相异，推测Omega试剂盒不适合发菜藻体RNA的提取；改良后的Trizol法23S、16S 2条带已有大部分降解，5S条带比较明亮，并伴有拖尾现象，表明该方法所提RNA降解快，不适合进行后续试验（图5）；优化后的天根试剂盒法所提发菜总RNA质量有明显提高，23S、16S条带清晰，无明显弥散、拖尾现象（图6）。

与没有优化前的3种RNA提取方法相比，优化的Omega试剂盒法和改良Trizol法所提RNA并没有提高其质量和纯度，优化的Omega试剂盒法比值依然较高；改良Trizol法所得比值均低，说明改良后Trizol法所提RNA仍伴有蛋白质、多糖等杂质的污染；天根试剂盒经过优化，所提取的RNA质量和浓度都有所增加，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm、浓度分别达2.06、2.08、154.3 ng/μL（表2），260 nm处峰值显著（图7）。

表2不同方法优化后所提发菜藻体RNA的质量及产量检测

方法D260 nm/

D280 nmD260 nm/

D230 nmC

（ng/μL）峰值波长

（nm）优化Omega试剂盒法2.122.24663.1260改良Trizol法1.770.5845.5220优化天根试剂盒法2.062.08154.3260

3讨论

RNA提取一般采用研磨等方法使细胞破碎，通过去除材料中的多糖、蛋白质、DNA的污染，进一步进行洗涤和沉淀，最终得到纯度较高的RNA。有效细胞裂解是提取高质量及高产量RNA的关键环节[8-9]，由于发菜藻体富含胶质、色素和多糖等，并且极易大量吸水和细胞壁坚硬的特性造成了RNA提取困难，对发菜藻体和细胞破碎以及缓冲液的选择无疑成为提取其RNA的关键步骤。笔者进行了几种破碎方法的比较，发现采用反复多次液氮研磨是破碎发菜藻体和细胞的理想方法。然而研磨过程中还应确保研磨用力恰当、液氮充足，避免材料溶解，而且研磨时间不宜过长（小于8 min）。

根据不同试验目的和材料，RNA提取可采用不同的方法[10-11]。李亚军等研究表明，Trizol法能更简单有效获得莱茵衣藻中高质量的RNA，而最适合提取微芒藻中高质量RNA的方法是SDS-LiCl沉淀法[12]。本研究结果表明，Omega试剂盒法所提取的RNA伴随杂质较多；Trizol法和改良Trizol法均不适用于发菜藻体RNA的提取，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm 都与标准数值相差甚远；天根试剂盒法是发菜总RNA提取的理想选择，所得发菜RNA基本可以满足RT-PCR要求，但仍达不到转录组测序的要求。通常情况下，试剂盒法所提取的RNA质量并不高，原因是不同材料组织结构以及其中所含物质的种类不同，导致试剂盒在提取过程中并不理想，因此，试剂盒使用应根据试验目的及试验材料的特性进行适当改进。王友华等用改进的热酚提取法获得了高质量的棉花根总RNA[13]；王春晖等通过对2种试剂盒法和改良的异硫氰酸胍法的比较，得出改良的异硫氰酸胍法所提出的棉花幼根总RNA能够满足转录组测序要求[14]；杨晓燕等针对3种常用RNA提取试剂盒对红地球葡萄叶样品RNA的提取效果进行评估和优化，结果显示最适于提取葡萄叶片总RNA的为RNeasy Plant Mini Kit试剂盒，同样需要延长提取试剂与样品的接触时间从而提高RNA的提取质量[8]。笔者对Omega RNA提取试剂盒、Trizol RNA提取法、天根试剂盒等3种方法进行优化，结果表明，天根试剂盒法所提发菜RNA质量最高，达到转录组测序要求。

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