肝细胞生物学论文

普罗米修斯是希腊神话中的英雄，他用黏土创造了人类，并且违抗宙斯的命令，盗火给了人類，最后使得自己在高加索山脉上接受宙斯的惩罚：每天恶鹰会来啄食普罗米修斯的肝脏，而他的肝脏又会在夜晚重新生长出来。为了人类能拥有光明和温暖，他必须日复一日地忍受这种痛苦。这个神话刻画了普罗米修斯为人类献身的英雄主义，普罗米修斯之火也成了引导人类进步的象征。下面小编整理了一些《肝细胞生物学论文 (精选3篇)》，希望对大家有所帮助。

肝细胞生物学论文 篇1：

α-硫辛酸对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢紊乱的改善作用

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.07

摘 要 目的：研究α-硫辛酸对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢紊乱的改善作用。方法：采用MTT法测定25～1 000 ?mol/L α-硫辛酸对人肝癌细胞HepG2存活率的影响，以确定α-硫辛酸给药浓度。实验设阴性对照组、胰岛素抵抗组(1×10-7 mol/L胰岛素)、联合抵抗组(30 ?mol/L 亚砷酸钠+1×10-8 mol/L胰岛素)和α-硫辛酸低、中、高浓度组。按分组加入α-硫辛酸作用HepG2细胞12 h后，再分别给予相应浓度的亚砷酸钠或/和胰岛素继续培养24 h。采用葡萄糖氧化酶法检测细胞葡萄消耗量，比色法检测细胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性，蒽酮法检测细胞糖原含量，Western blot法检测细胞中葡萄糖转运体4(GLUT4)、磷酸化糖原合成激酶3β(p-GSK3β)、GSK3β蛋白表达水平和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值。结果：25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸对细胞存活率无明显影响(P>0.05)，且细胞存活率均大于96%，故将其作为后续研究的低、中、高浓度。与阴性对照组比较，胰岛素抵抗组、联合抵抗组细胞葡萄糖消耗量、己糖激酶和丙酮酸激酶活性、糖原含量、GLUT4和p-GSK3β蛋白表达水平、p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β比值均显著降低，GSK3β蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸各浓度组细胞葡萄糖消耗量(α-硫辛酸低浓度组除外)、己糖激酶(α-硫辛酸低、中浓度组除外)和丙酮酸激酶(α-硫辛酸低、中浓度组除外)活性、糖原含量、GLUT4(α-硫辛酸低浓度组除外)、p-GSK3β蛋白表达水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸低、中浓度组除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低浓度组除外)比值均显著升高，GSK3β(α-硫辛酸低、中浓度组除外)蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，且α-硫辛酸高浓度组细胞糖原含量、GLUT4蛋白表达水平、p-GSK3β/GSK3β比值和α-硫辛酸中、高浓度组细胞p-GSK3β蛋白表达水平的改善效果更明显(P<0.05)。结论：α-硫辛酸对胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢紊乱具有一定的改善作用，其机制可能与增加葡萄糖消耗，增强糖代谢相关酶活性，提高糖原含量，上调Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表达水平，下调GSK3β蛋白的表达水平有关。

关键词 α-硫辛酸;人肝癌细胞HepG2;亚砷酸鈉;胰岛素抵抗;糖代谢紊乱;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B

Improvement Effects of α-lipoic Acid on Glucose Metabolism Disorder of Insulin Resistant HepG2 Cells

AN Xianrong1，GUAN Junhuan1，YANG Xiuli1，WU Xianjin1，LIANG Bing1，2(1. Dept. of Pharmacology， School of Basic Medical Sciences， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China; 2. Key Laboratory of Environmental Pollution and Disease Monitoring， Ministry of Education， Guiyang 550025， China)

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of α-lipoic acid on glucose metabolism disorder of insulin resistant HepG2 cells. METHODS： The effects of 25-1 000 ?mol/L α-lipoic acid on survival rate of human hepatoma cell HepG2 were determined by MTT assay so as to determine the concentration of α-lipoic acid. Negative control group， insulin resistance group (1×10-7 mol/L insulin)， combination resistance group (30 ?mol/L sodium arsenite+1×10-8 mol/L insulin)， α-lipoic acid low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups were set up. HepG2 cells were treated with α-lipoic acid for 12 h and then cultured with corresponding concentration of sodium arsenite or/and insulin for 24 h. The glucose oxidase method was used to detect the glucose consumption， colorimetric method was used to detect hexokinase activity and pyruvate kinase activity， and anthrone method was used to detect glycogen content. Western blot assay was used to detect the protein expression of GLUT4， p-GSK3β and GSK3β as well as the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β. RESULTS： 25， 50， 100 ?mol/L α-lipoic acid had no significant effect on the survival rates of HepG2 cells (P>0.05)， and survival rates of HepG2 cells were higher than 96%， so they were used as the low， medium and high concentration for follow-up study. Compared with negative control group， glucose consumption， the activities of hexokinase and pyruvate kinase， glycogen content， protein expression of GLUT4 and p-GSK3β， the ratio of p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were decreased significantly in insulin resistance group and combined resistance group， while the protein expression of GSK3β was increased significantly (P<0.05). Compared with combination resistance group， the glucose consumption (except for α-lipoic acid low- concentration group)， the activities of hexokinase (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) and pyruvate kinase (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups)， glycogen contents， protein expression of GLUT4 (except for α-lipoic acid low-concentration group) and p-GSK3β， the ratio of p-Akt/Akt (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) and p-GSK3β/GSK3β (except for α-lipoic acid low-concentration groups) were increased significantly in α-lipoic acid groups， while protein expression of GSK3β (except for α-lipoic acid low-concentration and medium-concentration groups) was decreased significantly (P<0.05); glycogen content， protein expression of GLUT4 and the ratio of p-GSK3β/GSK3β in α-lipoic acid high-concentration group as well as the protein expression of p-GSK3β in α-lipoic acid medium-concentration and high-concentration groups were improved significantly(P<0.05). CONCLUSIONS： α-lipoic acid can improve the disorder of glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells， the mechanism of which may be associated with the increase of glucose consumption， the activities of glucose metabolism related enzymes and glycogen content， and expression up-regulation of the phosphorylation levels of Akt and GSK3β protein， the expression of GLUT4 and p-GSK3β proteins， down-regulation of the expression of GSK3β protein.

KEYWORDS α-lipoic acid; Human hepatoma cell HepG2; Sodium arsenite; Insulin resistance; Glucose metabolism disorder; PI3K/Akt

砷是广泛分布于自然界的非金属元素，具有较强的毒性，长期饮用含砷量较高的水会引起慢性砷中毒[1]。已有流行病学调查结果显示，环境砷暴露与糖尿病患病率或发病率增加有关，且砷暴露条件下的糖尿病特征与2型糖尿病相似[2-5]。因此，砷与糖尿病的关系成为砷中毒研究领域的热点问题之一。

α-硫辛酸是一种兼具水溶性和脂溶性的代谢抗氧化物，临床研究发现，该成分可促进体内葡萄糖的吸收，具有调节血糖平衡的作用[6]。此外，α-硫辛酸还能改善糖尿病周围神经病变引起的临床症状(如肢体麻木、烧灼感、刀割样痛、针刺样痛症状)[7-8]。不仅如此，α-硫辛酸还可解除重金属对巯基酶的毒性作用，促进大鼠体内重金属的外排，减少重金属在其体内的蓄积[9]。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的重要原因[10]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路是胰岛素信号转导的重要通路之一，其可通过调节下游葡萄糖转运体4(GLUT4)、糖原合成激酶3β(GSK3β)蛋白的表达来参与细胞的糖代谢过程，该通路的传递受阻与胰岛素抵抗的发生密切相关[11]。本课题组前期研究发现，一定浓度的亚砷酸钠与1×10-8 mol/L胰岛素联合可致人肝癌细胞HepG2产生胰岛素抵抗，提示砷可能具有加速或促进胰岛素抵抗形成的作用。基于此，本研究以α-硫辛酸为受试药物，基于PI3K/Akt信号通路探讨该成分对亚砷酸钠联合胰岛素所致胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢紊乱的改善作用，旨在为砷暴露下糖尿病治疗药物的研发提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括2001HY-6003型CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)、SW-CJ-2D型超净工作台(浙江苏净净化设备有限公司)、IX71型倒置显微镜(日本Hitachi公司)、Elx800 UV型酶标仪(美国BioTek公司)、722SP型可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)、Universal HoodⅡ型凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad公司)、WD-9405D型水平摇床和DYCZ-24DN型电泳仪(北京市六一仪器厂)、Allegray 64R Centrifuge型台式高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)等。

1.2 主要药品与试剂

亚砷酸鈉对照品(批号H4525，纯度97%)购自山东西亚化学工业有限公司;胰岛素对照品(批号J1001A，纯度96.8%)购自大连美仑生物技术有限公司;α-硫辛酸对照品(批号1077287，纯度>99%)购自美国Sigma公司;DMEM高糖培养基(批号8121089)购自美国Gibco公司;1%青霉素-链霉素双抗(批号J190005)购自美国HyClone公司;胎牛血清(批号19070506)购自浙江天杭生物科技股份有限公司;葡萄糖测定试剂盒(批号20200902137)购自上海荣盛生物药业有限公司;二甲基亚砜(DMSO)、MTT、糖原含量试剂盒、己糖激酶试剂盒、丙酮酸激酶试剂盒、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)制备试剂盒(批号分别为12130234、1117X054、20200903、20201211、20201112、20200916、20201030、20201116)均购自北京索莱宝科技有限公司;兔抗磷酸化Akt(p-Akt，Ser473位点)、Akt单克隆抗体(批号分别为P31749、4691S)均购自美国CST公司;兔抗GLUT4、磷酸化GSK3β(p-GSK3β，Ser9位点)、GSK3β、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(批号分别为NQ30、10016184、00083124、00047696、116154)均购自武汉三鹰生物技术有限公司;快速封闭液、化学发光试剂盒(批号分别为P0252、123119200731)均购自上海碧云天生物科技有限公司;其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞

人肝癌细胞HepG2购自中国科学院上海细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养

HepG2细胞复苏后，接种在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养(培养条件下同)。

2.2 α-硫辛酸的细胞毒性检测

采用MTT法进行检测。取对数生长期HepG2细胞，以6×103个/孔接种于96孔板中，培养24 h;弃去培养基，加入α-硫辛酸终浓度分别为25、50、100、200、500、1 000 ?mol/L的普通培养基(无血清，下同)200 ?L，记为α-硫辛酸组;另设不含药物的阴性对照组和不含细胞、不含药物的调零组，每组设3个复孔。培养12 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT试剂20 ?L，培养4 h后，弃去板中液体，加入DMSO 150 ?L，避光振荡10 min，使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，并计算各组的细胞存活率：细胞存活率(%)=(OD实验组-OD调零组)/(OD阴性对照组-OD调零组)×100%。实验重复3次。

2.3 分组与给药

以HepG2细胞为研究对象，建立胰岛素抵抗模型。实验设阴性对照组(只有细胞、不含药物)、胰岛素抵抗组(1×10-7 mol/L胰岛素，浓度参考文献[12]和前期研究结果设置)、联合抵抗组(30 ?mol/L亚砷酸钠+1×10-8 mol/L胰岛素，浓度参考前期研究结果设置)和α-硫辛酸低、中、高浓度组(25、50、100 ?mol/L，浓度参考α-硫辛酸细胞毒性实验结果设置)。将对数生长期HepG2细胞适量，按照各实验所需的密度接种于96孔板、6孔板或者细胞培养瓶中，培养24 h;弃去培养基，α-硫辛酸各浓度组加入相应浓度的含药普通培养基，其他组加入等体积的普通培养基，培养12 h;弃去培养基，联合抵抗组和α-硫辛酸各浓度组加入含有30 ?mol/L 亚砷酸钠和1×10-8 mol/L 胰岛素的普通培养基，胰岛素抵抗组加入含有1×10-7 mol/L胰岛素的普通培养基，阴性对照组加入等体积的普通培养基，继续培养24 h后进行后续检测。

2.4 细胞葡萄糖消耗量和细胞毒性检测

采用葡萄糖氧化酶法和MTT法分别进行检测。取对数生长期HepG2细胞，以6×103个/孔接种于96孔板中，按照“2.3”项下方法分组、给药、培养，另增设不含药物、不含细胞的空白对照组和1×10-8 mol/L胰岛素组，每组设3个复孔。每孔取培养基上清液2 ?L与葡萄糖测定试剂盒中反应试剂进行反应，严格按试剂盒说明书进行操作。反应完成后，使用酶标仪在505 nm波长处检测各孔的OD值，并计算各组细胞葡萄糖消耗量：葡萄糖含量(mmol/L)=(各组OD值/校准液OD值)×校准液浓度，葡萄糖消耗量(mmol/L)=空白对照组细胞上清液中葡萄糖含量-各实验组细胞上清液中葡萄糖含量。葡萄糖消耗量检测结束后，再按“2.2”项下MTT法进行检测并计算每组细胞存活率。实验重复3次。

2.5 细胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性检测

采用比色法进行检测。取对数生长期HepG2细胞，以5×106个/瓶接种于细胞培养瓶中，按照“2.3”项下方法分组、给药、培养，每组设3个培养瓶。每组分别收集500万细胞，加入己糖激酶、丙酮酸激酶提取液各1 mL，裂解细胞后，于4 ℃下以8 000×g离心10 min，取上清液30 ?L，与己糖激酶、丙酮酸激酶试剂盒中的反应试剂进行反应，严格按相应试剂盒说明书进行操作。在上清液与己糖激酶反应试剂反应20 s、5 min 20 s时利用可见分光光度计在340 nm波长处检测各组的吸光度(A20 s、A5 min 20 s)值，并计算各组细胞的己糖激酶活性：己糖激酶(U/104 cell)=2.226×(A5 min 20 s-A20 s);在上清液与丙酮酸激酶反应试剂反应20 s、2 min 20 s时利用可见分光光度计在340 nm波长处检测各组的A20 s、A2 min 20 s值，并计算各组细胞的丙酮酸激酶活性：丙酮酸激酶(U/104 cell)=5.226×(A20 s-A2 min 20 s)。实验重复3次。

2.6 细胞糖原含量检测

采用蒽酮法进行检测。取对数生长期HepG2细胞，以5×106个/瓶接种于细胞培养瓶中，按照“2.3”项下方法分组、给药、培养，每组设3个培养瓶。每组分别收集500万细胞，加入糖原提取液750 ?L，裂解细胞后，于25 ℃下以8 000×g离心10 min，取上清液，备用。同时，增设空白组(水)、标准组(0.1 mg/mL葡萄糖標准溶液)。每组取上清液60 ?L，与糖原含量试剂盒中的反应试剂进行反应，严格按试剂盒说明书进行操作。反应完成后，使用酶标仪在620 nm波长处检测各组的A值，并计算各组细胞的糖原含量：糖原含量(?g/104 cell)=0.450×(A实验组-A空白组)/(A标准组-A空白组)/细胞数量×1 000。实验重复3次。

2.7 细胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表达水平检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期HepG2细胞，以6×105个/孔接种于6孔板中，按照“2.3”项下方法分组、给药、培养，每组设3个复孔。每组弃去上清液，裂解细胞后，于4 ℃下以15 294×g离心10 min，取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组细胞的蛋白浓度。蛋白于100 ℃煮沸变性5 min。取变性蛋白样品进行SDS-PAGE分离，转膜，经快速封闭液室温封闭30 min后，加入p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β单克隆抗体(稀释比例均为1 ∶ 1 000)和GAPDH单克隆抗体(稀释比例为1 ∶ 5 000)，于4 ℃孵育过夜;用TBST溶液洗膜10 min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比例为1 ∶ 5 000)，室温孵育1.5 h;用TBST溶液洗膜10 min×3次，经化学发光液显色后，使用凝胶成像分析仪曝光成像。采用Image Lab 5.2.1软件对目的条带进行灰度值分析，计算目标蛋白的表达水平和磷酸化水平：目的蛋白的表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，目的蛋白的磷酸化水平=磷酸化目的蛋白灰度值/总目的蛋白灰度值。实验重复3次。

2.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检测。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 α-硫辛酸对HepG2细胞存活率的影响

与阴性对照组比较，α-硫辛酸25、50、100 ?mol/L组细胞的存活率均无显著变化(P>0.05)，而α-硫辛酸500、1 000 ?mol/L组细胞的存活率均显著降低(P<0.05)，详见表1。因此，后续实验选择25、50、100 ?mol/L作为α-硫辛酸的低、中、高浓度。

3.2 α-硫辛酸对HepG2细胞葡萄糖消耗量和存活率的影响

与阴性对照组比较，胰岛素抵抗组、联合抵抗组细胞的葡萄糖消耗量均显著降低(P<0.05)，而其余各组细胞的存活率均无显著变化(P>0.05)。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸中、高浓度组细胞的葡萄糖消耗量均显著升高(P<0.05)，但两者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

3.3 α-硫辛酸对HepG2细胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性的影响

与阴性对照组比较，胰岛素抵抗组、联合抵抗组细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均显著降低(P<0.05)。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸高浓度组细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性均显著升高(P<0.05)，详见表3。

3.4 α-硫辛酸对HepG2细胞糖原含量的影响

与阴性对照组比较，胰岛素抵抗组、联合抵抗组细胞的糖原含量均显著降低(P<0.05)。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸低、中、高浓度组细胞的糖原含量均显著升高(P<0.05)。与α-硫辛酸低、中浓度组比较，α-硫辛酸高浓度组细胞的糖原含量均显著升高(P<0.05)，详见表4。

3.5 α-硫辛酸对HepG2细胞中p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋白表达水平的影响

与阴性对照组比较，胰岛素抵抗组、联合抵抗组细胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表达水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低，GSK3β蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸各浓度组细胞中GLUT4(α-硫辛酸低浓度组除外)、p-GSK3β蛋白表达水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸低、中浓度组除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低浓度组除外)比值均显著升高，GSK3β(α-硫辛酸低、中浓度组除外)蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与α-硫辛酸低浓度组比较，α-硫辛酸中、高浓度组细胞中p-GSK3β蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与α-硫辛酸中浓度组比较，α-硫辛酸高浓度组细胞中GLUT4蛋白表达水平和p-GSK3β/GSK3β比值均显著升高(P<0.05)，详见图1、表5。

4 讨论

2型糖尿病主要表现为胰岛B细胞分泌胰岛素不足或外周组织(例如肝、脂肪、骨骼肌)发生胰岛素抵抗[13]。HepG2细胞是人肝癌细胞，其保留了大部分肝细胞生物学特征和代谢特点，是用于研究胰岛素抵抗发生机制和降糖药物作用机制的理想模型[14]。

本研究以α-硫辛酸作为受试药物，探讨其对亚砷酸钠联合胰岛素所致胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢紊乱的改善作用。首先，本研究通过MTT法检测了α-硫辛酸对HepG2细胞的毒性，结果发现，25、50、100 ?mol/L的α-硫辛酸对HepG2细胞的存活率均无明显影响，且细胞的存活率均在96%以上，因此选择25、50、100 ?mol/L作为后续实验中α-硫辛酸的低、中、高浓度。

已有研究表明，胰岛素抵抗时外周组织对葡萄糖的消耗量减少，造成机体血糖升高[15]。本研究通过测定葡萄糖消耗量发现，与阴性对照组比较，联合抵抗组细胞葡萄糖消耗量显著降低，而α-硫辛酸中、高浓度组细胞葡萄糖消耗量均显著高于联合抵抗组，由此说明α-硫辛酸可在一定程度上改善亚砷酸钠联合胰岛素所致的HepG2细胞胰岛素抵抗。

肝是葡萄糖代谢的主要场所之一，其可通过调控糖酵解、糖原合成来维持机体的血糖平衡[16]。己糖激酶是糖酵解途径中控制葡萄糖代谢速率的首个关键酶，丙酮酸激酶是糖酵解过程中催化磷酸烯醇丙酮酸和腺苷二磷酸转变成丙酮酸和腺苷三磷酸的磷酸基转移酶，两者都是糖酵解过程中重要的限速酶[17-18]。当肝细胞内己糖激酶和丙酮酸激酶活性下降时，会导致肝细胞对葡萄糖的利用减少，糖原合成降低，从而引发肝脏胰岛素抵抗[19]。本研究通过检测糖代谢相关酶活性及糖原含量发现，与阴性对照组比较，联合抵抗组细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和糖原含量均显著降低，提示细胞糖代谢发生了紊乱;而α-硫辛酸高浓度组细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶活性和α-硫辛酸各浓度组细胞的糖原含量均显著高于联合抵抗组，且高浓度组细胞的糖原含量显著高于α-硫辛酸低、中浓度组。这说明α-硫辛酸可通过提高糖代谢相关酶活性和糖原含量来改善亚砷酸钠联合胰岛素所致的HepG2细胞胰岛素抵抗。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Ser473位点的磷酸化是Akt活化的主要标志[20]。当肝细胞受到胰岛素刺激时，Akt蛋白磷酸化被激活，激活的Akt参与调控细胞的葡萄糖转运和糖原合成[21]。GLUT4是糖转运蛋白之一，p-Akt可使GLUT4发生易位，让GLUT4从细胞囊泡中转移并嵌入至细胞膜上，从而把葡萄糖从细胞外转移到细胞内[22]。GLUT4是维系机体血糖平衡的关键因子，故是抗糖尿病的靶点之一[23]。此外，p-Akt可使GSK3β的Ser9位点发生磷酸化，抑制GSK3β蛋白表达，激活细胞的糖原合成[24]。GSK3β可通过磷酸化失活来促进糖原合成，进一步增加细胞对葡萄糖的利用率，从而达到降血糖的目的，故近年来GSK3β被作为治疗糖尿病的新靶点之一[25]。本研究通过Western blot法检测糖代谢相关蛋白的表达水平发现，与阴性对照组比较，联合抵抗组细胞中GLUT4、p-GSK3β蛋白表达水平和p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均显著降低，GSK3β蛋白表达水平显著升高。这提示亚砷酸钠联合胰岛素可降低GLUT4蛋白表达，造成葡萄糖转运的障碍，同时下调GSK3β蛋白磷酸化水平，造成糖原合成的异常，从而降低细胞对葡萄糖的利用率，导致糖代谢紊乱的发生。与联合抵抗组比较，α-硫辛酸各浓度组细胞GLUT4(α-硫辛酸低浓度组除外)、p-GSK3β蛋白表达水平和p-Akt/Akt(α-硫辛酸中、低浓度组除外)、p-GSK3β/GSK3β(α-硫辛酸低浓度组除外)比值均显著升高，GSK3β(α-硫辛酸中、低浓度组除外)蛋白表达水平显著降低。这提示α-硫辛酸可通过增加GLUT4蛋白表达来改善葡萄糖转运障碍，同时通过上调GSK3β蛋白磷酸化水平、抑制GSK3β蛋白表达来改善细胞糖原合成的异常，从而增加细胞对葡萄糖的利用率，改善亚砷酸钠联合胰岛素所致胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢紊乱。

综上所述，α-硫辛酸对亚砷酸钠联合胰岛素所致胰岛素抵抗HepG2细胞的糖代谢紊乱具有一定的改善作用，其机制可能与增加葡萄糖消耗，增强糖代谢相关酶活性，提高糖原含量，上调Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平和GLUT4、p-GSK3β蛋白的表达水平，下调GSK3β蛋白的表达水平有关。本研究结果为砷暴露下糖尿病治疗药物的研发提供了实验基础，但糖代谢过程还受诸多因素调控，砷对糖代谢的影响有待进一步的深入研究加以证实。

参考文献

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(收稿日期：2021-03-04 修回日期：2021-06-07)

(编辑：邹丽娟)

作者：安仙蓉 管俊欢 杨秀丽 吴先进 梁冰

肝细胞生物学论文 篇2：

普罗米修斯之火

普罗米修斯是希腊神话中的英雄，他用黏土创造了人类，并且违抗宙斯的命令，盗火给了人類，最后使得自己在高加索山脉上接受宙斯的惩罚：每天恶鹰会来啄食普罗米修斯的肝脏，而他的肝脏又会在夜晚重新生长出来。为了人类能拥有光明和温暖，他必须日复一日地忍受这种痛苦。这个神话刻画了普罗米修斯为人类献身的英雄主义，普罗米修斯之火也成了引导人类进步的象征。有意思的是，这个神话还描述了丄 一个生命的奇迹，即肝脏的强大再生能力。

肝脏是体内最重要的器官之一，发挥着代谢、分泌、解毒等多种生理功能。肝脏从大体上来看，是一个相对均质的组织。从具体的构建细节来看，肝脏是由一个一个的肝小叶作为基本功能结构单元构成的。肝小叶可以大致想象成一个多边形的结构，中心区域是中央静脉;几个顶点是汇管区存在的地方，汇管区内有肝动脉，门静脉和胆管。肝细胞和胆管上皮细胞是构成肝脏的主要细胞类型，前者是肝脏内最重要的功能细胞，占肝脏总重量的约80%。肝细胞从中央静脉排列成索状，一直到汇管区。动脉和门静脉的血液经过肝索间内皮细胞形成的肝窦中流入中央静脉。肝细胞和肝细胞之间会形成胆小管的亚细胞结构，肝细胞分泌的胆汁流入胆小管，通过互相间连接的胆小管，最后汇入由胆管上皮细胞构成的胆管中。肝脏中还有一些免疫细胞、星型细胞等，分布于血管内皮细胞周围或者肝窦间隙中。

哺乳动物的大多数组织器官都缺乏再生完整器官的能力，但肝脏是个例外。在极端情况下，肝脏被切除高达70%后，残余的肝组织仍然可以在2周左右的时间内再生出整个肝脏器官来(尽管其外观的大体结构并不能被再生出来)。在其他一些急性化学性损伤过程中，肝脏也往往能够非常好地再生损伤组织。但当受到持续性损伤时，比如慢性病毒感染、脂肪性肝炎、长期药物肝损伤等，肝脏的再生修复能力会遭到破坏，常会出现肝纤维化等病理状态，严重时会导致肝硬化和肝衰竭，危及病人的生命。

肝脏是再生研究的热点器官

由于肝脏的强大再生能力，并且肝脏再生与相当多的肝脏病理变化相关，因此肝脏一直是再生研究领域中深受关注的器官。肝脏再生过程有相当多非常有意思的科学问题，比如：再生过程的诱导因素是什么，而组织完成再生后，整个过程又是如何被恰到好处地终止;再生过程的血管和胆管重建问题;免疫细胞对肝脏再生的作用;衰老状态下，再生能力下降的原因等等。但在这些问题中，一个核心的关注点是，肝细胞作为最重要的功能细胞，是如何被再生出来的，其细胞来源是什么，涉及哪些调控的因子?

20世纪中后期，对肝脏再生的研究主要是形态学描述，比如利用光学显微镜和电子显微镜，进行组织结构和细胞形态方面的观察。研究者主要采用肝脏切除模型来研究肝脏再生。在这个过程中，观察到在很短时间内，肝细胞就出现了内质网变形、线粒体减少等变化;在肝脏切除大约24小时左右，肝细胞出现了细胞分裂象，提示肝细胞正在发生增殖。随着同位素标记和核酸标记技术的发展，人们可以真正跟踪肝细胞增殖过程中细胞遗传物质——脱氧核糖核酸(DNA)的复制，从而可以了解肝脏再生的细胞来源。利用啮齿类动物模型，研究者发现在肝脏切除后16小时左右，肝细胞开始出现DNA的复制，大约在24～36小时达到高峰;当再生完成时，所有肝细胞发生了一次或者两次增殖。基于这些研究，领域内普遍认为，在肝脏再生过程中，肝细胞的自我复制是再生的主要细胞来源。

在对肝脏切除再生过程的一系列研究中，利用生物化学的分离纯化和检测手段，人们还发现了一系列在再生过程中有诱导生长作用的因子和激素类物质，比如上皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、甲状腺素、去甲肾上腺素等。这些因子的单独使用，在体内和体外实验都可以看到对肝细胞增殖有部分的诱导作用。不过那个时代的研究缺乏遗传学动物模型，因此这些因子体内的确切作用机制，不是非常明朗。有意思的是，对肝脏再生过程进行组织学分析，可以观察到不同形态大小的肝细胞，而体外培养这些肝细胞时，似乎也看到它们的增殖能力不尽相同。也由此提出肝脏内不同肝细胞可能增殖能力不同，对再生的贡献大小不同的假说。

寻找肝脏干细胞

在胚胎发育中，大家发现了胚胎肝脏干细胞的存在，其发育来源于胚胎早期形成的内胚层组织。在肝脏形成过程，这些干细胞可以进一步分化为两类不同的上皮细胞——肝细胞和胆管细胞。20世纪90年代，随着实体组织中成体干细胞概念的逐步形成，肝脏再生领域中也有人提出成体肝脏中是否存在肝脏干细胞。这些成体肝脏中的干细胞可以在损伤后贡献到肝细胞的再生，以及胆管细胞的再生。因此，研究者们参照其他器官，特别是血液组织造血干细胞的研究方案，利用在细胞表面特异表达的分子，分离纯化可能的成体肝脏干细胞。这个研究的过程参考了胚胎发育时期肝脏干细胞的表面特异分子。

最后的结果是，大家发现了近十种不同的表面分子，这些表面特异分子可以标记互相间重叠程度或大或小的若干类群细胞。利用谱系追踪技术，不同实验室在各自研究的损伤模型中，发现这些细胞似乎都能贡献到肝脏再生中去。利用肝细胞移植技术，大家还发现这些细胞多多少少也都可以在移植后再生。但是，很难想象成熟肝脏中存在这么复杂的干细胞体系。因此，成体肝脏干细胞是否存在，让研究人员产生了极大的困惑。

另一方面，在肝切除模型中，早期有人对肝脏尝试了连续的切除和再生研究。发现可以进行多达12次连续的肝脏切除和再生。在20世纪90年代，大家也逐步建立了肝细胞移植的模型，基本思路是构建一些功能缺陷肝脏动物模型，移植野生型动物的肝细胞后，这些野生型的肝细胞可以在肝脏中定植和扩增。利用这些肝细胞移植模型，大家发现肝细胞可以长期连续移植。通过相应的计算，估计肝细胞可以扩增30多次，也就是大约10亿倍左右。

基于这些发现，有人提出了肝细胞可能并不是终末分化细胞，其本身是否就是单能干细胞(unipotent stem cell)的假说。基于这个假说，一直寻找的肝脏干细胞可能就是成熟肝细胞;不过，这个假说也指出，这样的单能肝脏干细胞很可能就无法贡献到胆管细胞了。

尽管成体肝脏干细胞的寻找并不顺利，或者说让人非常有挫败感，但在对肝脏干细胞的探索过程中，还是涌现了大量的新数据和新假说。比如，利用移植技术，基本否定了成体组织内存在多潜能干细胞的概念;也否定了血液细胞可以转换为肝细胞的假说。另一方面，利用这些新发现和新技术，推动了一些成果的临床转化研究。比如，研究者们发现了胚胎肝干细胞的培养方法，提出了肝细胞移植治疗的概念，建立了肝细胞移植的动物模型。此外，也开始初步尝试生物人工肝的大动物和临床研究。但是，由于肝细胞培养和分化的技术难题，而临床治疗所需的细胞数量极大，因此，这些技术都没有真正实现临床的治疗应用。

肝细胞属性转换研究的兴起

21世纪以来，随着细胞谱系遗传标记技术的进一步发展，研究者们可以更为精准地跟踪细胞在体内的谱系变化。到2010年前后，利用了一系列高度复杂和精准的遗传标记方法，若干个实验室陆续确认再生过程中的肝细胞都是来自原有的肝细胞，从而基本否定了肝脏干细胞的存在。在同一个时期内，随着获诺贝尔奖的诱导性多能干细胞(1PSC)技术的建立，以及中国、美国等学者成功实现了将成纤维细胞体外转变为其他类型功能细胞，不同细胞属性间可以发生转换(包括细胞去分化和细胞转分化)这个概念得到广泛认可。与此同时，一些关于体内损伤再生过程的细胞属性转换的研究也开始出现，主要是在肠道、胰岛等上皮组织中发现细胞属性转换对组织损伤修复的作用。

在此背景下，有研究者开始考虑肝脏是否也存在通过细胞属性转换方式实现损伤后的组织再生。因此，利用遗传标记方式，对损伤后肝脏再生过程进行详细的研究分析。研究者发现肝细胞在某些急性损伤后，的确会发生去分化，获得胚胎肝脏干细胞的某些特征;并且这些细胞在损伤后修复过程中，可以再次分化为肝细胞和胆管上皮细胞。这些经由肝细胞“去分化-再分化”的再生方式可以贡献到30%以上的肝组织再生。由于这个去分化过程十分短暂的，因此，用传统方法无法很好地捕捉到。这也部分解释了为何很长一段时间，研究者看到了多种所谓的“肝脏干细胞”——很可能大家标记的细胞处于去分化过程的不同阶段。更为有意思的是，中国和英国的科学家利用细胞谱系标记技术率先证明，在肝细胞增殖受到抑制的条件下，肝细胞的再生可以由胆管细胞而来。在严重的长期损伤下，大约50%以上的再生肝细胞是来自于胆管细胞。虽然胆管细胞形成肝细胞的過程到底是直接转分化，还是去分化后再分化，抑或其本身就具有兼性干细胞的特质，仍然有争论，但是这个发现，给肝脏再生提供了一个全新的模式。

肝细胞是实现细胞移植治疗的关键细胞。虽然肝细胞在体内具有强大的增殖能力，但是在体外培养扩增，一直到最近几年都没有完全解决，这也是造成临床肝细胞移植治疗迟迟没有重大进展的原因之一。上述这些细胞属性转换现象的发现和概念的建立，特别是去分化的概念提示大家，是否可以将分化的肝细胞先进行去分化为肝脏干细胞后，再实现体外扩增肝细胞。因此，中国、荷兰、日本和韩国的学者利用这一假说，率先克服了成体肝细胞无法在体外培养扩增的技术难题，实现了肝细胞的体外获得，为肝细胞移植治疗等提供了扎实的技术支撑。

从这些研究历史可以看到于2010年前后，中国学者开始逐步加入到全球肝脏再生研究的第一梯队中，并做出了一系列重要的本土原创贡献。这完全是因为随着国家经济实力的增强，对科研投入的加大，才能使新一代的本土研究者能够有机会在相关领域内做出中国人的贡献。可以预期，我国的科技人员未来会在各个前沿基础和应用研究领域获得更多出色的原创成果，也期待相关研究成果能够早日实现产业化和临床应用的突破，为中国和全世界人民的健康谋福祉。

新技术促进肝脏再生研究

从上述对肝脏再生研究的回顾，我们大致可以看到知识发展的某些规律性。新发现的产生，常常伴随一些无法解释的现象，一些未被解答的科学问题。利用时代发展中全新的技术方法，结合本领域或者其他领域一些尚未被完全证实的新概念范式，逐步产生了一些新的发现。而新的发现必然带来新的认知、新的突破和新的应用(这些新认知、新突破、新应用，有些是可以预测的，有些是无法预测的)，同时也带来了一些新的困惑、新的不解，这又推动研究者继续探索新的方向和领域，肝脏再生也是如此。

肝小叶是肝脏的基本功能结构单元，长期以来，大家知道从汇管区到中央静脉，肝细胞的代谢表达谱不同。在肝细胞移植过程不同区域肝细胞移植后，可以形成所有的肝细胞，因此这种不同被认为是微环境诱导的差异，并没有联系到肝脏再生中去。随着谱系追踪技术不断深入，研究者们可以更好地标记不同区域的肝细胞。这时，大家发现肝脏不同部位的肝细胞似乎贡献到再生中的能力不同。近来，随着单细胞测序技术的引入，带来了大量的数据，从而使得数据源头驱动、结合生物学机制研究的范式，也在肝脏再生研究领域成为一种新的研究方法和体系。2015年前后，单细胞表达谱测序技术开始逐步成为实验室的常规技术。与此同时，有不少研究者对肝脏不同部位的肝细胞，不同损伤状态下的肝细胞进行了单细胞测序，发现的确肝脏这个表面上看起来均质的组织，实质上在不同组织区域，存在着很大的表达差异。因此，这就对肝脏的再生提出了全新的挑战，这些空间位置不同，表达谱不同的细胞，在再生中是如何作用，是否都发生一样的变化?在再生过程中，又是如何重新形成的?在特定病理条件下，如何重塑微环境?如何合理精准地动员这些细胞贡献到再生，并且避免肝脏疤痕(纤维化)的形成?对这些问题的回答和了解，很可能把我们对肝脏再生带入到一个全新的领域，非常值得期待。

肝脏再生的普罗米修斯之火

回溯过去半个多世纪肝脏再生的历史，在探索未知的前沿，是一条充满荆棘的光荣之路，艰辛曲折然而意义深远。我们对自然的认识很大程度上是受限于我们现有的技术和工具;技术和工具的局限性，使得很多探索无法深入并企及细节，相关的结论和由此构建的理论框架也就必然会在某些方面存在困难。框架性理论的构建一方面指导了我们更高效地对未知的探索和理解，另一方面也常常会使我们对新的认知造成局限。所以那些全新的技术体系，那些反复出现、无法解释的现象，不管是新的还是旧的，成为那些活跃在第一线的先锋们的关注点。只有那些勇于打破成规的行动者和真正深刻的思考者，如同普罗米修斯给人类带来火种，才会给整个领域一次又一次地带来全新的观察和颠覆性的理论体系。

作者：惠利健

肝细胞生物学论文 篇3：

人脐血间充质干细胞治疗肝纤维化的研究进展

研究发现，具多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)， 脐带间充质干细胞具有无限增殖和多项分化潜能， 可以向肝细胞分化， 能在体外自我增殖， 并可以定向分化为内、中、外3 个胚层来源的多种细胞， 如骨、软骨、脂肪、神经及类肝细胞等， 有望用于肝脏疾病的治疗。脐带来源广泛，无伦理道德方面的争议。如果能够利用易于获得的MSCs在体内外定向分化为肝前体细胞，则可做为肝细胞移植的一个主要来源。不过脐血中的间充质干细胞含量很少， 如何分离纯化?如何使其较长时间保持干细胞特性? 如何诱导其向肝细胞分化? 据研究表明，人脐血间充质干细胞能够贴壁生长， 而体外培养的贴壁细胞是一个异质细胞群， 可能含有多种细胞成分。一般呈现类纤维细胞形态，并可分裂增生， 且同时具有间皮细胞标志的贴壁细胞， 如CD44+ 细胞， 可以初步判断为是MSCs。之前，报道HUCMSCs可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得， 并可冷冻保存; 复苏后在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4 的联合诱导下， 能定向分化为表达CK8&18， 并合成白蛋白和糖原的类肝细胞， 类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用。脐血中存在MSCs， UCBMSc 形态与MSCs相似，倍增时间为48 h ， 传代后形态基本无变化; UCBMS C 不表达CD34及CD45， 强表达CD44及CD166 ， 与MSCs的表面抗原特性一致， 是脐血中区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干祖细胞。本研究先通过对hUCMSCs 的体外培养，对hUCMSCs进行纯化、扩增和鉴定;初步掌握hUCMSCs分离、培养及冻存的技术和方法，探索有效诱导hUCMSCs分化为肝前体细胞的途径;然后，将诱导和未诱导的hUCMSCs在体外与人肝星状细胞(HSC)共培养，为下一步研究其在体内通过不同途径移植到肝纤维化鼠体内，以观察其对肝功能的修复情况及对肝纤维化进程的影响奠定基础。

1 MSCs 体外诱导培养

任红英等[1] 尝试诱导HUCMSCs向肝细胞系分化， 诱导1周后细胞表达肝细胞特异标志物甲胎蛋白( AFP)、白蛋白( ALB) 诱导后的肝细胞样细胞能够分泌白蛋白， 具有一定的肝细胞功能， 且诱导后的细胞仍然低表达HLA??DR 抗原，具有低免疫原性的特点。因而认为HUCMSCs呈肝分化后，诱发同种异体免疫排斥反应的程度仍然较低。还有研究者发现在MSCs 单独培养或与肝细胞共培养体系中， 均需要有肝细胞生长因子HGF 、FGF-4 以及表皮生长因子( EGF) 才出现肝细胞的基因表达[2]。何念海等[3]的实验结果显示UCBMS C 向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞， 表达肝细胞分化的早期标志GATA4 ，CK19和AF P ， 再分化为成熟肝细胞， 表达肝细胞的晚期标志HNF l a ， HNF 3 β ， CK18 和ALB。UCBMSC 在诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。体外一定条件下利用2 步法可诱导成具有肝细胞形态和功能的肝细胞样细胞。第1 步， MSCs 在IMDM 培养基， 内含H GF、bFGF、烟碱中培养7 d。第2 步， 在IM DM 的培养基中加入制瘤素M( o ncostatin M) 、地塞米松以及ITS+ 的混合物中培养。2 周后培养的MSCs 逐渐出现肝细胞样形态， 随着诱导时间的延长， 细胞质中出现丰富的颗粒物质， 并能持续保留至12 周。2 周时甲胎蛋白( AFP) 、葡萄糖-6-磷酸酶( Gluco se-6-pho sphatase) 出现表达， 酪氨酸氨基转移酶 (ty rosine-aminotr ansfer ase) 于4 周开始表达。CK18、白蛋白( ALB) 以及色氨酸2， 3-过氧化物酶( tr yptophan 2， 3-dio xy genase) 在培养期间均能检测出。此外， 细胞色素P4502B6、肝细胞核因子-4( HNF-4) 的表达分别在第4 周和第6 周检测出。功能实验， 肝细胞样细胞还能摄取低密度脂蛋白( LDL) ， 4 周后贮存糖原， 6 周后合成尿素， 并呈时间依赖方式递增， 胆小管抗原9B2 呈阳性。用此二步法诱导肝细胞样细胞有几点优势： ( 1) 增加细胞来源; ( 2) 过程简单; ( 3) 细胞寿命长;(4) 数量充足; ( 5) 所需时间短。有研究者将诱导培养后的MSCs 消化洗净， 用无血清的DMEM 培养基加0. 05%的牛血清ALB 培养24h， 收集培养的上清液， 用超滤方式浓缩25 倍成为MSCs 的条件培养基( MSC??CM)[5]。应用此MSC??CM 可减轻由D??半乳糖胺( D??g alacto sam ine) 诱发的大鼠暴发型肝炎的肝细胞坏死， 减轻肝细胞的凋亡( 能使凋亡的细胞减少90%) ， 促进受体鼠肝细胞的再生( 使再生速度增加3 倍) ， 小鼠生存时间明显延长。

2 MSCs 分化为肝细胞的体外及动物模型研究

终末期肝病的唯一有效疗法是肝移植， 然而肝源的缺乏以及终身应用免疫抑制剂而导致严重的不良反应， 使整体肝脏器官移植的临床应用受到限制， 人们开始寻求另一种途径， 即应用肝细胞进行移植治疗， 有些治疗取得了一定疗效。由于肝细胞移植同样需要有肝源提供质量良好的肝细胞， 且体外培养肝细胞的条件苛刻， 效率不高， 因此肝細胞移植并不是一个可供选择的适合方法。基于干细胞的强大分化潜能， 人们开始尝试应用干细胞治疗各种疾病， 包括肝病特别是肝衰竭或终末期肝病。干细胞包括MSCs 分化为各种组织细胞的潜能， 包括肝细胞。由于MSCs 很容易从成人的骨髓及其他组织中获取， 在体外可大量扩增， 长时间培养可使MSCs 保持分化成各种组织的潜能， 且能分化为肝细胞样细胞， 并具备肝细胞功能。

3 脐带血间充质干细胞的生物学特性

有研究认为足月妊娠产妇的脐带血中不存在或者仅有微量的间充质干细胞，很多实验否定了这个观点，Karen Bieback等通过实验证明了足月妊娠产妇脐带血中MSCs的存在，而且探究了MSCs的分离与脐血采集量、保存时间、单个核细胞数以及是否发生凝血和溶血有关。与造血有关的表面抗原CD14、CD34、CD45均为阴性，上皮细胞标记抗原CD31及CD106亦为阴性，而与MSCs相关联的抗原CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD90、AMSA、SH2(CD105) 及SH3(CD73)均为阳性(SH2、SH3 为MSCs相关性抗原)。这与骨髓来源的MSCs表面抗原报道一致。

间充质干细胞起源于中胚层间充质， 形成于发育中的骨髓腔， 是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞。间充质干细胞主要来源于成体骨髓、胰腺、皮肤、肾脏等多处器官组织， 也可从相应胎儿组织中分离获得。纯化的间充质干细胞在体外大量增殖且具有向三个胚层的所有类型细胞分化的潜能。在光镜和相差显微镜下， 间充质干细胞显示出类似成纤维细胞外观; 透射电镜下可表现为两种不同的形态结构类型： 一种是处于相对静息状态的细胞， 核较大， 椭圆形， 仅含1 个核仁， 核质比大， 胞质内细胞器少; 另一种是处于相对活跃期细胞， 细胞体积大于前者， 核不规则， 有核袋及核突， 含2～3 个核仁， 核质比小， 胞质中有丰富的细胞器。间充质干细胞表面微绒毛可摄取大量营养物质， 供生长增殖所需。在相邻细胞间的部分细胞膜局部电子密度增高。间充质干细胞自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白介素和化学激动因子， 但除细胞因子是持续性产生外， 其他的仅仅在受到刺激后表达。间充质干细胞还能产生一系列的基质分子， 包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖， 还能表达基质- 细胞， 细胞- 细胞等相互作用的反受体， 其中特别有关的是对CD44强表达。CD44 是多种配体的受体， 其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用。這些资料还表明间充质干细胞在骨髓中有助于骨髓基质的形成和发挥功能。

HUCM SCs是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞， 与其他来源的MSC s相比， 具有明显的优势， 如表1所示[4]。

在MSCs 抗肝纤维化方面， 研究也取得了一些进展， 但也存在争议。国内外一些研究首先应用CCL4 建立动物肝脏损伤模型， 将人或动物来源的MSCs植入肝脏损伤的动物体内后，可减少肝组织内的胶原沉积和羟脯氨酸含量， 抑制肝细胞内转化生长因子β1( TGF-β1) 、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 表达， 降低血清Ⅲ型前胶原氨基末端肽( PⅢP) 、透明质酸和层黏连蛋白水平， 并持续表达和分泌ALB， 减轻肝纤维化， 降低ALT， 提高动物生存率。肝纤维化模型第4 -6 周进行MSCs 移植仍具有较好的抗纤维化效果。有的研究进一步报道， MSCs 在有HGF 培养条件下， 可上调ALB 的分泌，减轻肝细胞损伤以及肝纤维化， 但在缺乏H GF 的培养条件下，M SCs 无此功能。MSCs 移植抗肝纤维化的机制尚不清楚， 可能主要包括2 方面： 一是M SCs 通过分化为功能性肝细胞， 促进受体内源性肝细胞增殖[ ， 分泌多种生长因子如HGF、碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 等促进肝再生; 二是M SCs 通过直接诱导肝星状细胞凋亡或抑制其激活， 分泌抗纤维化物质如HGF、G-CSF、基质金属蛋白酶-9( MMP-9)等减少ECM 沉积、抑制肝组织纤维化的形成。有研究发现， 肝纤维化患者或肝损伤小鼠体内， 骨髓来源细胞更倾向于分化为肝星状细胞和肌成纤维细胞2 种细胞， 而非肝细胞， 虽然数量不多， 但在慢性肝损伤条件下能被激活， 发挥促肝纤维化作用， 有加重肝纤维化形成的可能。慢性肝损伤尚可诱导MSCs 分化为肌成纤维细胞的前体细胞-成纤维细胞， 促进肝纤维化的发展。Russo 等应用小鼠骨髓来源的MSCs 异体移植于肝硬化的同系小鼠， 在受体鼠肝内， 骨髓MSCs 极少分化为肝实质细胞( 0.6%) ， 而主要分化为肌成纤维细胞( 70%) 和肝星状细胞( 68%) ， 且% 型胶原转录活化，有可能导致或加重肝硬化结局。有研究应用喂饲液体乙醇及腹腔注射CCL4 建立慢性肝损伤的大鼠模型， 再通过尾静脉输注同品系大鼠的骨髓来源的MSCs， 1、2 个月后评价肝细胞功能及肝脏纤维化， 发现MSCs 不能减少肝纤维化， 也不能改善慢性肝损伤的肝脏功能。最近有报道， 将人骨髓来源的MSCs 移植入急性和慢性肝损伤的NOD/ SCID 鼠中， 发现外源人骨髓来源的M SCs 在受体鼠体内可诱导分化为肌成纤维细胞样细胞， 而很少或不分化为肝细胞样细胞， 说明人MSCs是把双刃剑， 既能分化为肝细胞样细胞， 也可能分化为成纤维细胞， 促进肝硬化的形成。以上研究结果的差异可能是制造肝损伤模型的时间长短以及给药时机不同而造成肝脏损伤的程度不一致， 以及肝脏微环境的不同， 对MSCs 诱导分化产生的作用也不同所致; 此外，MSCs 的来源以及在体外诱导培养的条件不同， 也可能造成MSCs 的分化潜能发生改变， 具体机制有待探讨。因此， 应用MSCs 治疗肝硬化有利还是有害， 还需进一步深入研究。国内有报道利用自体脂肪来源的MSCs 治疗晚期肝病， 并取得了一定疗效。[5]

5 间充质干细胞在肝脏疾病治疗中的应用

各种慢性肝病的终末期， 肝纤维化、肝硬化是常见的病理结果。在临床上肝纤维化、肝硬化会导致患者出现各种严重并发症， 包括腹水、食管静脉曲张， 肝功能衰竭及肝性脑病等。现有的一些治疗方法尚不能从根本上逆转这种病变。肝移植是治疗各种终末期肝病的有效方法， 虽然目前肝移植的1、5年生存率分别可达83% 和75% ， 但由于供肝来源不足、操作复杂、并发症多、移植后免疫排斥及治疗费用昂贵等原因， 限制了临床肝移植的发展[6]。自20世纪末开展干细胞研究以来， 细胞移植为治疗肝纤维化带来了新的希望。

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作者：多吉卓玛 小达瓦 扎桑 索朗巴措