流式细胞仪分析技术

流式细胞仪分析技术（精选5篇）

流式细胞仪分析技术 篇1

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

（3）数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号（FL）测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理（图示见上）

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

（二）FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液；

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法（金属网引起细胞破碎）

深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的几类荧光染料

（二）免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

（一）单细胞悬液制备的质控

（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）

温度 试剂选择

pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

（四）免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

流式细胞仪分析技术 篇2

流式细胞仪(Flow Cytometer)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器。它以流式细胞术为理论基础,集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体[1,2,3],具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点[4,5,6],被广泛应用于生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域。通过CNKI数据库检索统计,近十年来共收录以“流式细胞仪”为关键字的论文约为15万篇。

流式细胞仪属于大型贵重仪器设备,专业性强且价格较高,单一高校拥有量偏少。因此本文选取本地区部分高校10台流式细胞仪,对其使用现状和存在的问题进行分析,通过搜集并研究样本数据,有针对性地提出加强高校流式细胞仪使用效益的建议与意见。

1 流式细胞仪使用效益分析

大型仪器设备是一个复杂的投入产出系统,对设备的效益评价涉及到很多相关的指标,使用全部指标是不可能也是不现实的,实际效益评价只能选择部分指标进行评价[7]。因此本文选择年使用机时、承担科研项目数和发表论文数三项指标来对流式细胞仪进行使用效益分析。

1.1 年使用机时分析

根据教育部办法的《高等学校仪器设备管理办法》和《高等学校贵重仪器设备年度效益评价表》中,对03类和04类大型贵重仪器设备进行了规定,其中03类仪器仪表专用设备使用机时最低为800 h/年,通用设备使用机时最低为1400 h/年,04类机械类使用机时最低为800 h/年。流式细胞仪为07类,医疗设备类大型仪器设备,并未对其使用机时有明确规定。但地方教育主管部门和高校本身,一般以800 h/年作为衡量所有类型大型仪器设备使用机时是否合格的标准[8]。样本平均年使用机时数据,见表1。

由表1看出,样本流式细胞仪年使用机时均达到额定使用机时800 h要求,平均年使用机时为875 h。流式细胞仪在高校主要应用于科研中,其科研机时占总体比例88%,且样本中80%流式细胞仪的教学机占总机时数不足10%甚至为0。由此可见,流式细胞仪在高校集中应用于科研项目中,在教学使用及开放共享方面略有不足。

1.2 科研项目分析

大型仪器设备是重大科研项目研究与开发主体工具,其在科研成果中作用的大小,直接反应大型仪器设备的使用水平和效益[9]。样本年科研项目统计,见表2。

由表2可以看出,流式细胞仪所承担项目数差异较大。但从整体平均来看,其承担项目多为国家级项目及国家级重大项目,二者总和占总体科研项目的68%,而校局级项目数占总体最少,仅为8%。由此可见,流式细胞仪在高校所承担的科研项目较前端,但同时也应积极参与低级别项目的申请,以提高其使用效率。

1.3 发表论文分析

科研任务是高等学校的重要任务[10],因此,科学研究同样是评价大型仪器设备使用效益的重要指标之一,期刊发表论文数是科学研究成果主要表现。样本年均发表论文数统计,见表3。

由表3可以看出,应用流式细胞仪刊发的期刊中,高水平文章(三大检索论文)占总体的60%,但国内论文数仅占总体28%,且论文发表数量较少。这也说明了流式细胞仪在高校中的所参与的科研项目使用较前端,但国内普遍应用较少,同时,参与使用的教师与学生数量也略低。

2 提高高校流式细胞仪使用效益建议

2.1 提高流式细胞仪在教学中的使用

高校大型仪器设备对提高教师的教学科研水平以及学生的动手能力有很大帮助,因此人才培养是大型仪器设备使用效率评价重要组成部分。样本所有流式细胞仪虽然都满足额定800机时要求,但教学机时明显不足,仅占总体年使用机时的3%。由于流式细胞仪单体价格高,数量较少,满足师生普遍应用不现实,但可以通过增加实验演示课程,让更多的学生接触到这一先进性的大型仪器设备,并能有效的增加仪器设备的使用机时,从而提高流式细胞仪的使用效益。

2.2 扩大流式细胞仪使用范围

样本流式细胞仪在各自所承担的科研项目中,虽然级别较高,但数量明显不足。同样,在涉及流式细胞仪发表的期刊论文中,高水平文章比较较高,但数量同样明显不足。因此,扩大流式细胞仪的使用范围,不应局限于某一课题组或某一教研室,充分挖掘流式细胞仪潜在作用,以提高其使用效益。

2.3 加强流式细胞仪的开放共享

高等院校大型仪器设备开放共享,是实现资源优化,避免闲置浪费的重要途径。目前国家正加大推动非涉密和无特殊限制的大型仪器设备向社会开放使用。样本流式细胞仪的其他机时仅占总机时的9%,且70%的流式细胞仪并无开放共享。因此,加强流式细胞仪的开放共享,亦是充分发挥其使用价值,提高其使用效益的重要途径。

3 结语

所调研的样本流式细胞仪,90%均为医科院校所有,涉及专业有免疫、肿瘤、临床检验诊断和流行病与卫生统计等,而流式细胞仪应用范围不应仅局限于此。本文通过对流式细胞仪的使用情况研究,就目前存在问题提出建议与意见,以提高各高校相关人员对流式细胞仪在科研和教学中使用的重视程度,扩大其使用范围,探索其使用功能。

参考文献

[1]周丽,周振英.流式细胞仪研制的技术进展[J].分子诊断与治疗杂志,2003,15(1):11-17.

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[3]王敬春,苗术,黄海涛.流式细胞仪在细胞凋亡检测中的应用[J].齐齐哈尔医学院学报,2007,(8):970-971.

[4]王秀丽,范乃军,赵光,等.流式细胞术在临床肿瘤学中的应用[J].实用医药杂志,2012,29(5):464-466.

[5]马莉,顾健,吴蔚,等.BD Calibur流式细胞仪维护方法与技巧[J].中国医学装备,2013,(12):128-129.

[6]农乐根.流式细胞术的工作原理及临床应用[J].右江医学,2005,33(3):301-303.

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[8]阎冰,张小蒙,刘彦强,等.高校不同分类的大型仪器设备使用效益分析[J].中国现代教育装备,2015,(9):4-6.

[9]汪明东.构建效益评价指标体系,提高仪器设备效益[J].中国现代教育装备,2007,(8):107-110.

流式细胞仪分析技术 篇3

【关键词】CD4T淋巴细胞；FACSCount；流式细胞仪；HIV

【中图分类号】R19 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01576-01

流式细胞术自70年代中期就成为研究细胞生物学的重要技术，至今己被广泛应用于肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等领域[1]。FACSCount系统是美国BD公司专门为辅助性T淋巴细胞（CD4细胞）监测而设计的一台经济普及型流式细胞仪，用来计数未裂解全血中的CD4，CD8和CD3T淋巴细胞绝对数值，与传统的流式细胞仪相比，具有完善的CD4、CD8、CD3绝对计数系统；最简化的样本处理过程，全血标本，不需要额外的裂解和洗涤步骤；完善的软件功能，实现样本采集、结果分析和打印的全程自动化；严格完整的质控和对照系统，具有SFDA认证等特点，在CD4+T 细胞监测领域已得到广泛应用和开展。但应用FACSCount流式细胞仪有一个最大的问题，一些标本在FACSCount系统检测不出结果，最终显示为XXXX，这是我们在实际工作中经常遇到和头疼的地方。

1 FACSCount流式细胞仪常见故障原因分析

1.1 环境因素

FACSCount流式细胞仪对环境要求非常高，最适宜环境为温度20-25℃，湿度68-77%RH。在南方，湿度过大会导致仪器软盘磁性丧失，仪器不能进入系统正常运转，实验室内应配置冷暖空调和除湿机。在北方，湿度不够会使过滤泵干燥或上样针结晶，实验室内应配置冷暖空调和加湿器。仪器安装应接单独可靠地线，接地电阻小于1欧姆，电阻过大会导致流式细胞仪的激光器损坏，同时要可持续电源、稳压器，防止突然断电导致数据丢失、仪器损坏。

1.2 样本因素

1.2.1 标本数值超出系统检测可检测范围

1.2.2 严重溶血、凝血或坏死，因为死细胞增强标本对荧光染料的非特异性染色，这使背景荧光增多，干扰真正的荧光信号；

1.2.3 样品内存在干扰因素，黄疸指数过高、吸毒人员的血样、抗凝剂运用不对等；

1.3 操作因素

1.3.1 进样时，样品液面没有因为上样而变少，屏幕显示数值缓慢降为0，最终出现XXXX的结果。可能是进样针堵塞，仪器扑捉不到相应的淋巴细胞，获取细胞率低，此时应进行上样针的清洁并运行清洁程序，一般可以解决。

1.3.2 进样时，样品液面因上样而变少，屏幕获取数值会迅速减少为0而出现XXXX的打印结果。可能是鞘液过滤器里有空气，使得仪器获取率低而致。解决办法是松开滤器处的塑料夹，使空气通过排除管，排尽所有气体后，关闭塑料夹。

1.3.3进样时，液面因上样而变少，屏幕获取数值缓慢减少，但不会降到很低，检测很长一段时间后才会降为0出现XXXX的打印结果。原因可能是流动池内有空气，进入清洗程序界面，按[DRAN]进行灌冲冲洗，排掉流动池内空气。

2 质控运行过程中出现的故障及解决办法

质控运行的目的是校准机器，检查试剂的活性和线性，每日开机或启用一个新批号的试剂前都应运行质控。质控运行结果是不可选择的，所有质控结果都会被打印出来并储存在程序软盘中，最后一次质控运行的数据最终显示在测试结果中，下次运行质控时，数据会自动更新。质控结果会出现在屏幕上，以“通过（PASSED）”和“失败（FAILED）”显示，并且自动打印。打印结果包括很多统计数据，但最重要的是运行结果如何。质控通过不成功，病人的样品报告会出现“上次质控：失败（FAILED）”的标记。如果不重新进行质控检测并成功通过，样品报告上就会一直出现这条信息，这时应该检查打印出的错误编码，与FACSCount 中文操作手册99页中列出的错误对照并找出可能原因，直至质控运行成功通过。没有成功的质控运行不能确保病人结果的可靠，不能发出病人的检测报告。

3 样本运行过程中出现的故障及解决办法

样品测试中出现的一些错误常使测试过程出现异常可能会影响样品测试结果，屏显以[confirm]显示，点击[confirm]键则会出现[continue]显示，按此键出现xxxx的打印结果，此时可以根据打印出的错误编码或屏幕上显示出错误信息与FACSCount 中文操作手册7.2、7.3中错误编码及信息列表对比查看，每一个错误都给出了可能引起的原因和解决方法。如果应用这些推荐方法后错误仍然存在，请与当地BD公司服务商或代理商联系。有时标本测试出现错误，但输出结果中仍然打印出测试结果数值，表明这一错误不会影响测试结果。只有出现错误影响测试结果，测试数值才会不显示。

艾滋病最主要的免疫学特征是CD4+T淋巴细胞数量显著减少，同时 CD4+/CD8+ 比例倒置，准确可靠的CD4+T 细胞检测是评价HIV感染感染者或病人免疫状况，预测判断疾病进程、评价抗病毒治疗效果和评测预后的重要指标， 通过上文介绍的FACSCount流式细胞仪的一些应用细节和使用技巧，能有效地提高CD4计数检测水平和能力，为艾滋病预防、诊断和治疗提供的客观准确的检测结果。

参考文献：

流式细胞仪分析技术 篇4

CLOUTER XL型流式细胞仪主要由5个部分组成: (1) 流动系统; (2) 激光系统; (3) 信号处理放大系统; (4) 计算机控制系统; (5) 细胞分选系统。由流式仪的原理可知, 仪器用鞘液将样本包裹成单个细胞, 在细胞逐一通过激光照射区时, 激光激发细胞上的标记荧光产生散射光。要顺利而准确的检测, 首先要求激光能准确地照在细胞上 (涉及激光系统) , 其次细胞是否能稳定通过激光照射区 (液流驱动系统) , 即有稳定的压力和畅通的流路。这些常见的故障报警主要集中在3个方面: (1) 激光系统。 (2) 液流驱动系统不稳。 (3) 流路阻塞。

1 仪器的光路问题

1.1 光路散

1.1.1 故障现象

所有线性信号HPCV>2。

1.1.2 分析与检修

首先, 排除由于流路不洁造成的细胞通过不稳定, 间接导致光路收集到细胞的信号不佳, 多次使用clean panel均无效;其次, 排气泡, 目的是清除鞘液内的气泡, 改善鞘液包裹的稳定性。按Prime按键, 并按下鞘液箱过滤器的排气按钮, 仪器会自动将鞘液箱到Flow cell之间管道的气泡排掉, 以确保样本的包裹稳定。

如果还是无法改善光路情况, 那么就需要调节激光光束成型器的位置, 让激光以最佳的角度和最小的光点照射在样本微粒上, 即所有线性信号HPCV<2。使用FLOW CHECK调节激光光束成型器位置, 具体方法是: (1) 打开所有开关; (2) 打开顶盖、侧板等; (3) 长按Sys in TFC电路板上的黑钮, 使激光强行启动; (4) 用7/64的内六角扳手 (英制工具) 调整光束整型器侧面的螺钉洞, 调FS信号到最大, 即主机示波器上FS左起第6格稳定的前提下, 闪动的格子尽可能多; (5) 调整FS的电压和增益, 使细胞团集中且成左右走向; (6) 观察FS/SS的图, 在前几种方法均无效时则考虑清洁光束成型器, 方法是:使用粘满95%酒精的细小棉签, 小心擦拭光束成型器的正面, 再重复前面 (1) ～ (5) 的步骤。

如以上方法均不能使HPCV<2, 则考虑压力问题。

1.1.3 预防措施

仪器使用一段时间后, 易出现激光不能准确对准流动池内流过细胞的中心, 使HPCV<2, 应定期调节光束成型器, 使激光聚焦。

2 各种压力报警

压力报警主要分为3类:

(1) 鞘液压力报警 (sheath pressure error或sheath pressure warning) ;

(2) 真空压力报警 (vacuum chamber error或vaccum pressure warning) ;

(3) 系统压力报警 (system pressure error或system pressure warning) 。

2.1 鞘液压力报警

2.1.1 故障现象

样品管被样品台抬起, 样品快速减少, 主机上的信号指示二极管时有时无, 且在短时间内样品台自动降下。

2.1.2 分析与检修

由于样品管的样品需要一定量的鞘液包裹通过检测区, “样品快速减少”提示鞘液吸取不足, 鞘液流路负压有故障。原因可能有: (1) 鞘液箱盖未拧紧或鞘液盒连接头松, 导致压力外泄, 拧紧即可; (2) 压力调节阀漂移, 导致鞘液压力偏低, 可调节此阀, 使Sheath pressure为27.56 kPa (4 psi) ; (3) 鞘液过滤器阻塞, 更换过滤器即可。

但当鞘液管完全阻塞时, 会无任何报警现象, 且FS/SS反复出现类似平行线的点阵, 毫无细胞群, 应注意区分。

2.1.3 预防措施

每天开机前检查压力表是否在正常的范围;每次添加鞘液和清洁液时注意将盖子拧紧, 并在关闭液体箱时注意管路保持通畅, 不弯折;定期更换易老化的部位, 如鞘液盒和清洁液盒的连接头。

2.2 真空压力报警

2.2.1 故障现象

系统不能进样。

2.2.2 分析与检修

仪器的真空瓶是仪器正压和负压的切换中心, 当真空瓶内的液体达到瓶内感应器的位置时, 会出现真空报警故障。该故障产生的原因是废液不能正常排放。首先, 应解决好VL7以及CV3的通畅问题, 保证VL7阀的正常工作, CV3单向导通, 保证正负压的正常切换, 当排废液时真空瓶须加入正压 (VL11要加电打开) 。另外, 还有可能是液面水平传感器自身损坏导致错误报警, 此种情况若没有好的传感器, 可以暂时断开感应器, 仪器也可正常工作。

2.2.3 预防措施

每天开机前检查真空瓶, 保证真空瓶内无液体。

2.3 系统压力报警

2.3.1 故障现象

检测立即终止, 样品和上样台迅速下降, 系统进入自校状态, 系统压力低。若上样管有裂缝, 管中液体由裂缝处喷射。

2.3.2 分析检修

(1) 故障分析: (1) 检查电源箱的SYStem PRESure表是否在192.92～220.48 kPa (28～32 psi) ; (2) 检查气水隔离瓶是否漏气; (3) 检查气泵压力输出; (4) 检查交流电磁阀; (5) 检查电源箱面板快速接头是否插紧; (6) 检查主机管道是否漏气或管道是否脱落; (7) 上样管出现裂缝。

(2) 故障排除:若SYStem PRESure表不在192.92～220.48 kPa (28～32 psi) , 可按以下步骤恢复:将PRESSure AD-Juster钮拉出;调节压力到合适的位置;调节钮复位。若为气水隔离瓶漏气, 最好及时更换。若出现 (3) (4) 的情况, 应交给工程师处理。若电源箱面板快速接头松脱, 须将快速接头复位。若是清洁液盒和鞘液盒的气体快速进样头出现裂缝漏气, 可折叠相连的气管使之不通气, 保持气路的压力。若清洁液盒的液路快速进样头出现裂缝漏气, 将其拔出即可, 因为液路快速进样头有自动封闭结构, 保证液体不外漏污染主机。但这两种情况均属于应急处理, 仅能保证当日样本的及时检测, 最好的方法是更换快速进样头。出现情况 (7) , 立即更换上样管。

2.3.3 预防措施

系统压力报警的多种情况基本属于以下情况:

(1) 长期忽视主机工作液盒的清洁导致不洁物质产生。在系统吸样时, 快速接头阻塞或细小的杂质堆积在管道内, 导致管道不通畅。系统压力增大, 快速接头和局部管路长时间处在高压力状态下, 易出现裂隙, 导致漏气漏液。预防措施是定期清洁工作液盒, 保证管路的通畅。

(2) 仪器元件的老化, 应在仪器工作5～8 a后进行一次全面的维护和保养, 以保证其良好的工作状态。其他如情况 (7) , 只需要每次使用前检查上样管是否完好即可。

3 各种管路的阻塞

3.1 样品流路阻塞报警

3.1.1 故障现象

进样时, FS/SS直方图中无点信号出现, 主机上的信号指示二极管时无闪烁。多次使用clean panel无效, 使用高浓度的漂白液和Prime也无效。观察发现, 使用clean panel和cleanse程序时均能吸样, 而检测时无法吸样。

3.1.2 分析与检修

考虑样品流路出现阻塞, 在熟悉管路分布的基础上, 可采用分段排除法判断阻塞发生的位置。样品流路为:从进样头开始经蓝色微管由MCL probe→seg.valve→FC→VL3→waste, 可分为4段。在分段拔出移液胶管后, 可用注射器连接输液管依次向各段正反2个方向分别加压推进高浓度的漂白液或清洁液, 通过压力和高浓度液体的清洁力, 排除样品流路阻塞[1]。80%以上是在进样管即蓝色微管处发生的, 首先考虑排除MCL probe→seg.valve段, 但注意在MCL probe→seg.valve段清洁进样头时, 流动池处会有液体流出, 要放置吸水纸。分段排除法适用于样品流路的任何部位阻塞。

3.1.3 预防措施

由于要保证细胞逐一通过流动池, 进样蓝色微管管径小, 易阻塞。因此所用溶液均需过滤处理, 以免沉淀物阻塞管路。而检测细胞样品上机前则使用300目的滤网过滤, 防止细胞团块阻塞。

3.2 气路阻塞报警

3.2.1 故障现象

界面提示“Insert sample tube”时插入样品管, 样品管感应器无反应、进样台不上升、界面不显示任何报警信号。检查System pressure表在220.48 kPa (32 psi) 正常范围内, 其他表均正常, 检查发现无法吸样。

3.2.2 分析与检修

考虑气路可能出现阻塞。可采用分段排除法判断阻塞发生的位置:cleanse的路径为:cleanse→VL1→FC→VL2→VL4→VL3→waste。在样品流路畅通情况下, 无需检测与流路重复的VL3→waste段。同样, 用注射器连接输液管进行分段排除法疏通管路, 若阻塞严重, 可使用10%的次氯酸钠代替清洁液等。

3.2.3 预防措施

由于气路清洁不要求每次开机后进行保养, 因此成为容易忽视的部位, 与之相连的清洁液盒消耗慢, 易滋生细菌。应加强气路清洁, 并每季度对清洁液盒进行彻底的清洁除菌处理。

4 小结

注重流式细胞仪的日常维护, 可以减少不必要故障报警的发生次数。而当出现具体故障时, 维修的关键在于熟悉该仪器工作原理的基础上, 针对故障现象, 仔细观察机器检测过程中的状况, 有针对性地制订出具体的维修步骤, 逐一排除故障点。同时, 充分利用维修菜单的各项检测功能, 就能很快地找出问题, 解决问题。

参考文献

流式细胞仪分析技术 篇5

研究表明,Rp1L基因表达的核蛋白L7/L12是布鲁菌中比较重要的疫苗靶蛋白,具有高度的氨基酸序列保守性,可以促进INF-γ基因的转录和表达,从而提高机体的免疫能力[3]。本试验应用流式细胞仪筛选出分泌核蛋白L7/L12抗体的杂交瘤细胞株,与传统方法比较可提高单克隆抗体的表达量及活性,还可以减少单克隆抗体的筛选步骤,同时为后续基因工程疫苗机理和布鲁菌检测方法的研究奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

Balb/c雌性小鼠,6~8周龄,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。

1.2 菌体及细胞

含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)、SP2/0骨髓瘤细胞,由齐齐哈尔大学动物实验室提供。

1.3 主要试剂

聚乙二醇(PEG)、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂,Sigma公司生产;羊抗鼠Ig G-HRP,购自Thermo公司;HAT培养基、HT培养基、RPMI 1640培养基,购自Invitrogen公司;藻红蛋白标记试剂盒,购自Innova Biosciences公司;TMB显色液及其他试剂,Amresco公司生产;NC膜和3 mm滤纸,购自Whatman公司。

1.4 主要仪器

流式细胞仪,购自ABI公司;Ni-NTA纯化预装柱,购自GE公司。

2 方法

2.1 重组布鲁菌核蛋白L7/L12的表达及纯化

将含重组表达载体p ET28a-L7/L12的Rosetta(DE3)菌株活化,并接种至LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养过夜;次日取1%培养液转接于LB液体培养基(氨苄西林浓度为100μg/m L)中,37℃振荡培养至OD600值为0.4~0.6时,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达[4]。收集菌体进行超声波破碎,离心后分别收集菌体上清液和沉淀,SDS-PAGE电泳分析重组核蛋白L7/L12-组氨酸(His)的表达情况。在目的蛋白可溶性表达时,可以直接应用Ni-NTA纯化预装柱对菌体上清液进行纯化,再用紫外分光光度仪测定蛋白浓度[4,5]。

2.2 免疫小鼠

用无菌PBS缓冲液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至200μg/m L,加入等体积的弗氏完全佐剂进行混匀乳化,取6~8周龄雌性健康Balb/c小鼠,首次免疫剂量为100μg,分别在小鼠背部皮下、腹腔及腿肌进行多点注射;首次免疫15 d后进行第2次免疫,取等量蛋白加入弗氏不完全佐剂,免疫方法同首次免疫;首次免疫30 d后进行第3次免疫,方法同第2次免疫;于细胞融合前3天腹腔注射等剂量蛋白(不加佐剂)进行末次加强免疫。

2.3 血清效价的检测

采用间接ELISA方法测定小鼠血清效价,并分别设置阴性对照和空白对照,用包被液稀释纯化后的重组核蛋白L7/L12-His至2μg/m L,加到96孔酶标板中,100μL/孔,4℃包被过夜。次日,用PBST洗涤3次,每次5 min;吸干液体后每孔加入200μL含5%脱脂奶粉的PBST,37℃封闭1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干待用。试验组每孔加入100μL适当稀释的免疫小鼠血清,阴性对照为稀释的未免疫小鼠血清,空白对照加入PBST,37℃孵育1 h;然后用PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后每孔加入100μL羊抗鼠Ig G-HRP(按照1∶5 000比例稀释)温育1 h;PBST洗涤3次,每次5 min;拍干后加入TMB溶液显色10 min左右,加入终止液终止反应,用酶标仪测定OD450值[6]。

2.4 应用流式细胞仪筛选单克隆抗体

末次免疫3 d后,按照1∶10比例将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合,1 000×g离心3 min;弃上清液,将管底细胞敲击松散后置37℃水浴箱中,并沿管壁加入1 m L预热的PEG,45 s内滴加完毕;静置45 s后缓慢加入RPMI 1640培养基10 m L终止反应,1 000×g离心3 min;弃上清液,将细胞重悬于HAT培养基(含20%胎牛血清)中,再与制备好的饲养层细胞混匀,加到T-75培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱中培养5 d;加入10 m L HAT培养基,之后换成含20%胎牛血清的HT培养基继续培养。

按照藻红蛋白标记试剂盒说明书标记重组核蛋白L7/L12-His,制备标记好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,用流式细胞仪筛选单克隆抗体。待细胞密度生长至培养瓶1/4时,将筛选后的融合细胞吹打至悬浮,收集细胞悬液,1 000×g离心3 min;弃上清液,用无菌PBS洗涤细胞后离心;弃上清液,加入PBS稀释好的藻红蛋白-L7/L12-His蛋白,结合40 min;用无菌PBS洗涤细胞3次,将其置于流式细胞仪中筛选,并将筛选出的阳性细胞株分至96孔细胞培养板中,每孔为单细胞,将培养基血清浓度调整至30%,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。

2.5 杂交瘤细胞株的体外培养及检测

当96孔细胞培养板中细胞生长至单孔的60%时,取细胞培养上清液,采用间接ELISA法检测抗体,筛选出表达量较高的单克隆细胞株。

2.6 免疫杂交鉴定杂交瘤细胞株

对纯化后的重组核蛋白L7/L12-His进行SDS-PAGE电泳,同时点样Marker进行对照;电泳结束后,采用半干法进行转膜,200 m A转膜40 min;将重组核蛋白L7/L12-His转移至硝酸纤维素膜上,用丽春红染色拍照后洗掉,将膜封闭;1 h后弃掉封闭液,以杂交瘤细胞株分泌的细胞上清液作为一抗孵育2 h;洗膜后加入羊抗鼠-HRP二抗孵育,将硝酸纤维素膜放入超敏发光液A和B中,混合均匀,待荧光显色后进行曝光。经显影定影后,将胶片清洗干净,风干,拍照。

2.7 单克隆抗体特异性的检测

对牛型布鲁菌菌体蛋白、重组核蛋白L7/L12-His、含重组表达载体p ET28a-L7/L12的大肠杆菌Rosetta(DE3)(阴性对照)、布鲁菌外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳和转膜,然后分别用筛选出的细胞株上清液进行Western-blot检测。

3 结果与分析

3.1 布鲁菌重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化

重组核蛋白L7/L12-His为可溶性表达,在菌体上清液中,分子质量约为14.0 ku,与预期结果相符。菌体破碎后其上清液经Ni-NTA纯化预装柱纯化,并用紫外分光光度计测定,结果蛋白浓度为1.5 mg/m L。重组核蛋白L7/L12-His的表达及纯化结果见图1。

3.2 免疫小鼠血清效价的检测

通过间接ELISA法测定免疫小鼠血清效价,分别对阴性血清和免疫小鼠血清进行稀释,稀释度为1∶200~1∶12 800,根据(阳性血清-空白对照)/(阴性血清-空白对照),即P/N>2.1为阳性的原则选取血清最佳稀释倍数,根据表1数值计算,血清稀释度为1∶800时P/N呈阴性,其最大值为2.081,以其为血清最佳稀释倍数,测定血清效价为1∶6 400。

3.3 流式细胞仪筛选结果(见图2)

由图2可知,该样品有2个明显的峰值,第2个信号峰即为高效表达L7/L12抗体的细胞。

3.4 单克隆抗体效价的检测结果

通过ELISA检测,对比OD450值选出其中3株表达量较高的杂交瘤细胞株D6、E7、G9,对细胞株上清液进行1∶800,1∶1 600,1∶3 200,1∶6 400,1∶12 800梯度稀释,ELISA检测发现,细胞培养上清液效价均可达到1∶1 600~1∶3 200,将其继续传代3个月以上,并用液氮冻存,复苏后进行ELISA检测,结果这3株杂交瘤细胞均可以高效、稳定分泌L7/L12蛋白抗体。

3.5 杂交瘤细胞株培养上清液的免疫杂交鉴定(结果见图3)

由图3可知,细胞株分泌的单克隆抗体均可以与重组蛋白发生特异性免疫反应,分子质量约为14.0 ku。

3.6 单克隆抗体特异性检测结果

3株单克隆抗体均可以与布鲁菌全蛋白和原核表达的核蛋白L7/L12特异性结合,而不与另外2个样品反应,说明其特异性较好,不存在交叉反应,以D6杂交瘤细胞株Western-blot分析为例,结果见图4。

4 讨论

布鲁菌病主要由布鲁菌引起,可以导致人畜共患病[1]。近年来,全球人与牲畜的发病率呈攀升趋势。目前,主要应用疫苗预防布鲁菌病,广泛使用的疫苗是弱毒疫苗,对机体的保护效果比较好。但此类疫苗也存在两方面缺陷,一方面是不能辨别人畜的抗体产生来源;另一方面是具有返祖现象、毒性较大,会对机体造成伤害。因此,针对布鲁菌病防治的进一步研究极为重要[7,8]。

齐齐哈尔大学动物学实验室应用p ET28a成功地表达了具有免疫原性的核蛋白L7/L12,创新性地应用流式细胞仪筛选出高效表达单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Western-blot检测结果表明,该抗体效价高,免疫特异性较强。与传统方法比较,该方法缩短了筛选时间,节约了人力、物力,而且可以避免传统筛选方法造成的抗体交叉反应现象。

制备单克隆抗体的重要因素之一是制备纯度较高、具有免疫原活性的重组蛋白,本试验优化了菌体培养条件,使其可溶性表达,避免了包涵体的变性及复性等操作,极大地保留了蛋白的天然结构和活性。本试验应用重组核蛋白L7/L12制备单克隆抗体,便于纯化,且分子质量较小,不影响免疫小鼠。

可以确定,经流式细胞仪筛选的杂交瘤细胞株是单克隆细胞株,细胞培养上清液的效价达1∶3 200,Western-blot检测结果表明,分泌的单克隆抗体能与牛型布鲁菌全菌体蛋白和重组核蛋白L7/L12发生特异性免疫反应,因此可应用此单克隆抗体检测布鲁菌,同时也为后续研究基因工程疫苗的机制奠定了基础。

摘要：为了制备牛型布鲁菌核蛋白L7/L12的单克隆抗体,试验采用流式细胞仪与间接ELISA相结合的方法进行单克隆筛选,以及Western-blot分析。结果表明:最终筛选出3株表达量较高的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液的抗体效价可达1∶3 200,3株单克隆抗体均能与核蛋白L7/L12发生特异性结合,无其他交叉反应。

关键词：布鲁菌,核蛋白L7/L12,单克隆抗体,效价,流式细胞仪,杂交瘤

参考文献

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