环境监测现代生物技术论文提纲

论文题目：基于信号放大策略构建的疾病标志物的传感研究

摘要：多年来,蛋白质及核酸等疾病标志物一直严重威胁着人类健康,给生物体的遗传、变异及新陈代谢等生命活动造成了重大影响。因此,致力于对这些生物分子的不断研究,将会对食品安全、环境监测、药物递送和疾病诊断等各个方面产生重要意义。随着生物医学和分析化学的快速发展,科学家们已经建立了一系列行之有效的方法来监测这些疾病标志物,但由于待测样品浓度低、干扰物多等局限性的存在,完善和推动更加灵敏、简单、精确、实时的分析方法已成为现代生物分析领域的重点。近年来,荧光信号放大技术因其具有灵敏度高、选择性好、响应速度快和检测成本低等优势而广受关注。本论文基于多种信号放大技术,以尿嘧啶糖基化酶（UDG）、凝血酶和microRNA-21为主要研究对象,结合滚环扩增、DNA自组装及活细胞成像等分子生物学技术手段分别构建了三种荧光生物传感器,实现了对生物分子的灵敏检测及实时分析。1.基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测作为一种重要的DNA修复酶,尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）可以用来识别和切除双链DNA中的尿嘧啶碱基,以驱动碱基切除修复（BER）过程,这在维持基因组完整性方面发挥着关键作用。因此,在基础生物分析和临床医学应用中进行UDG活性的研究是至关重要的。在这里,我们提出了一种基于滚环扩增辅助的免标记荧光法用于UDG的灵敏检测。在这项工作中,已设计好的用尿嘧啶碱基修饰的杂交三链DNA复合物被用于UDG的识别。在UDG的作用下,尿嘧啶碱基可以被特异性识别并从脱氧核糖磷酸骨架上切除以产生无碱基位点,这成功地导致杂交三链DNA复合物的解离和环状DNA的形成。环状体通过T4连接酶的连接后,可引发RCA反应并产生大量重复的G-四链体单元,可以与原卟啉IX（PPIX）相互作用以产生增强的荧光响应用于UDG活性的放大检测。该方法不仅可以成功区分UDG与其他非特异性生物分子,而且可以用于UDG抑制剂的筛选,实现了高灵敏度和高选择性,使检测限低至0.00014 U/mL。这些结果表明,这种简单、灵敏和经济的检测策略在UDG相关研究和相关的临床诊断中具有很大的应用潜力。2.适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测通过将一种适配体临位识别引发链迁移的策略与催化发夹组装（CHA）相结合进行信号放大的方式,我们构建了一种简单而灵敏的方法来检测人体血清样品中的凝血酶。首先,两条含有凝血酶适配体序列的探针能够同时结合到目标物凝血酶上以显著增加两条探针的局部浓度。其次,通过toehold引发的链置换来促进ssDNA从一条探针迁移到另一条探针上。这种链迁移使得其中一条适体序列产生一个单链引发端,由此通过CHA将两个荧光猝灭的发夹组装成许多双链DNA。DNA双链体的形成会促使大量的荧光恢复,从而达到放大检测凝血酶的目的,而其检测限也可降至8.3 pmol/L。由于采用双重识别模式,该方法对于凝血酶靶标区别于其他干扰蛋白具有高度的选择性,并可用于人体血清样品的检测。它所具有的简单、灵敏及选择性好的优点,可以为检测其他蛋白质分子提供一个通用的无酶、无纳米材料的放大传感平台。3.可生物降解的二氧化锰（MnO2）纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测细胞内microRNA（miRNA）的监测对研究活细胞的生物学功能具有重要意义。但由于miRNA的体积小、浓度低且序列相似,这给细胞内低表达miRNA的检测带来了巨大挑战。为解决这一问题,我们报道了一种细胞内信号放大方法,基于可生物降解的MnO2纳米片介导的HCR自组装来检测活细胞中低表达的miRNA。该体系中,MnO2纳米片可以吸附由染料标记的发夹探针并对其表现出良好的猝灭效果。此外,由于其具有可生物降解性,MnO2纳米片对靶细胞的毒性明显降低。当探针复合物进入细胞后,纳米片表面吸附的发夹可通过其他蛋白质或核酸的置换反应以及细胞内GSH对MnO2纳米片的降解作用而释放出来。随后细胞内的目标探针miRNA-21可触发两个发夹级联组装成长的dsDNA聚合物,使荧光FAM（供体）和TMR（受体）紧密接近以产生显著放大的FRET信号,用于高灵敏检测活细胞中的少量miRNA-21。通过改变发夹序列,此方法可以为监测活细胞中其他低表达的微量miRNA靶标提供机会。

关键词：荧光生物传感器;疾病标志物;信号放大策略;活细胞成像

学科专业：分析化学

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 荧光生物传感器的简介

1.1.1 荧光产生的原理

1.1.2 荧光生物传感器的分类及特点

1.2 荧光信号放大策略

1.2.1 基于酶辅助的信号放大策略

1.2.2 基于DNA自组装的信号放大策略

1.2.3 基于纳米材料的信号放大策略

1.3 本文研究思路

第二章 基于滚环扩增辅助的免标记荧光生物传感器用于UDG的灵敏检测

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂及材料

2.2.2 滚环扩增辅助的UDG活性检测

2.2.3 UDG抑制剂活性的检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 UDG的检测原理图

2.3.2 UDG检测的可行性分析

2.3.3 UDG检测的性能研究

2.3.4 UDG检测的选择性研究

2.3.5 UDG抑制剂(UGI)的性能研究

2.4 结论

第三章 适配体临位识别引发的链迁移和CHA诱导的无酶放大策略进行凝血酶的检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和材料

3.2.2 凝血酶识别探针的制备

3.2.3 荧光放大法检测凝血酶

3.3 结果与讨论

3.3.1 荧光放大法检测凝血酶的原理

3.3.2 Apt15的结构优化

3.3.3 检测凝血酶的可行性分析

3.3.4 反应时间的优化

3.3.5 该方法分析性能的研究

3.3.6 该方法选择性的研究

3.3.7 实际样品中凝血酶的检测

3.4 结论

第四章 可生物降解的二氧化锰(MnO_2)纳米片介导的HCR信号放大策略实现活细胞内低表达的MicroRNA的灵敏检测

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 材料及试剂

4.2.2 实验仪器

4.2.3 二氧化锰纳米片的合成与表征

4.2.4 荧光猝灭和恢复实验

4.2.5 HCR体外扩增的FRET检测

4.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

4.2.7 细胞培养和共聚焦荧光成像

4.2.8 HeLa细胞对miRNA-21抑制剂的孵育

4.2.9 细胞毒性测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 细胞内放大检测miRNA-21的原理图

4.3.2 MnO_2纳米片的表征

4.3.3 纳米片的荧光猝灭能力分析

4.3.4 传感器的可行性分析

4.3.5 纳米片对细胞活性的影响分析

4.3.6 细胞孵育不同时间的成像分析

4.3.7 细胞孵育不同探针的成像分析

4.3.8 不同细胞孵育不同探针的成像分析

4.4 结论

参考文献

致谢