口腔黏膜鳞状细胞癌 (oral squamous cell carcinoma, OSCC) 是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤, 起源于上皮细胞, 口腔癌间质中癌相关成纤维细胞 (Carcinoma-associated fibroblasts, CAFs) 体外增殖、粘附、迁移能力均高于正常间质成纤维细胞。成纤维细胞激活蛋白 (Fibroblast activation protein, FAP) 是新发现的一种在活化的成纤维细胞上特异性表达的分子, 其二聚体具有二肽肽酶 (Dipeptidyl peptidase, DPP) 和胶原酶活性。如果明确在肿瘤中成纤维细胞的表达模式, 将有益于肿瘤临床诊断与治疗。
2010年至2011年间, 在重庆医科大学附属口腔医院收集正常口腔黏膜、口腔扁平苔藓 (oral lichen planus, OLP) 、口腔白斑 (oral leukoplakia, OLK) 及OSCC组织标本共58例。本试验分为OSCC组和对照组。前者有标本42例, 根据病理分级标准, 包括OSCCⅠ级16例、OSCCⅡ级14例、OSCCⅢ级12例;选取正常口腔粘膜及口腔癌前病变 (OLP4例、OLK4例) 各8例。
鼠抗人FAP单克隆抗体 (Santa公司) , 免疫组化染色试剂盒 (迈新公司) , 显色剂DAB (迈新公司) , 其他试剂均为国产分析纯试剂。
所有组织均为新鲜标本, 分切为2块, 一块用液氮速冻, 于-70℃冰箱保存备用;另一块经10%中性福尔马林液固定后常规石蜡包埋, 5μm切片, HE染色, 用于病理诊断。
经-70℃保存的新鲜组织块在冰冻切片机上行4μm连续切片, 4%多聚甲醛固定30min, -20℃冰箱保存, 用于免疫组织化学染色。
冰冻切片恢复至室温后, 用3%过氧化氢孵育25min, 消除内源性过氧化物酶的活性。正常山羊血清 (PBS稀释) 封闭, 37℃孵育20min。滴加适当比例稀释的一抗 (工作浓度FAP1:50, 每切片滴加50μL) ;加适当比例稀释的生物素标记二抗;加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素, 37℃分别孵育60、60、10min;显色剂显色, 苏木素复染, 封片。以表达FAP的乳腺癌标本为阳性对照;以正常乳腺组织作为阴性对照;以PBS代替一抗作为空白对照。
将染色切片上出现棕黄色颗粒的细胞判定为FAP (+) 。
分值法判定FAP染色结果:每张切片在显微镜 (×200) 下选择5个典型视野, 每个视野内随机计数100个成纤维细胞, 计算FAP (+) 细胞百分比 (%) , 阳性细胞数>5%为阳性, <5%为阴性。每张片计数5个视野的平均值。所有结果由两位病理医师独立评定。
FAP染色阳性标本百分率比较采用卡方检验。
正常口腔黏膜及癌前病变粘膜中未见FAP染色阳性细胞 (照片1) 。OSCC组中可观察到FAP阳性成纤维细胞。其中, OSCCⅠ级:FAP染色阳性细胞多位于紧邻癌上皮的间质中 (照片3) 。OSCCⅡ级和Ⅲ级:在紧邻癌上皮的间质中, FAP染色阳性细胞分布较少, 而在癌旁组织的间质中分布较多 (照片4、5) 。
照片1:FAP在正常组织中无表达;照片2:FAP在重度异常增生OLK中的零星表达;照片3:FAP在OSCCⅠ级中的表达, 位于紧邻癌上皮下的间质;照片4:FAP在OSCCⅡ级中的表达, 位于癌巢周围;照片5:FAP在OSCCⅢ级中的表达。
FAP的表达与OSCC不同病理分级即口腔癌的分化程度有关。口腔鳞癌组FAP阳性标本百分率高于对照组, 结果, 见表1 (P<0.01) 。在不同病理分级的OSCC之间, 随细胞分化程度逐渐降低, FAP阳性标本百分率有升高趋势, 结果, 见表2 (P<0.05) 。
肿瘤的发生发展依赖于肿瘤—宿主界面微环境的平衡状态。成纤维细胞在肿瘤发生、发展过程中常有一些物质表达异常, 影响肿瘤细胞的生物学行为。FAP可选择性地表达于90%以上的上皮癌间质, 并不见于癌细胞、正常成纤维细胞或其他正常组织, 本实验结果还显示FAP在OSCC的阳性表达与OSCC病理分级成正相关关系, 因此, 可作为OSCC的辅助诊断和严重程度判定指标之一, 同时为今后的研究奠定了基础。
摘要：本文以各期癌变口腔黏膜为对象, 正常和癌前病变口腔黏膜为对照, 进行FAP免疫组化染色, 并取口腔癌旁组织进行冰冻切片。结果表明, 正常和癌前期病变口腔黏膜中, 成纤维激活蛋白在的间质成纤维细胞中表达阴性;在口腔鳞状细胞癌间质成纤维细胞中阳性表达, 证实了在口腔鳞状细胞癌组织中有FAP的表达且FAP染色分值与OSCC不同病理分级存在正相关关系。
关键词：口腔鳞状细胞癌,癌相关成纤维细胞,成纤维激活蛋白
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