基于肠道菌群调节的六堡茶改善痰湿质功效评价及祛湿机理研究

摘要：痰湿质是代谢疾病发生的“土壤”，肠道菌群失调是其主要病因之一。及早改善痰湿质，有助于代谢疾病的“异病同治”。为研究六堡茶调理亚健康状态痰湿体质的有效性，并探究其作用机制，本研究以六堡茶新茶和五年陈化茶(10g,200mL沸水浸泡2mm口服，每日2次)作为干预手段，纳入亚健康状态痰湿质人群进行随机、对照的临床试验，进行90天的标准化干预，记录干预前后与痰湿质有关的中医诊断指标、血液生化指标，并重点分析肠道菌群的变化。结果显示，六堡茶新茶干预组和陈茶干预组在干预后痰湿质转化分均有下降趋势，其中六堡茶新茶干预组在干预前中后三个时间点痰湿质转化分差异有显著性

(P<0.05)。六堡茶新茶及五年陈茶干预均有助于痰湿质体质改善，其中新茶起效较快。生化结果显示，六堡茶陈茶和新茶均具有降低胆红素的作用，陈茶作用较为明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。肠道菌群分析显示，六堡茶改变肠道菌群中的厚壁菌门和拟杆菌门的相对比例，促进嗜胆菌增殖。与代谢疾病、能量代谢有关的萨特氏菌属(Sutterella)、Izimaplasmatales菌和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的相对丰度水平发生改变，因此六堡茶可能通过调节肠道微生态，改善痰湿质等亚健康人群的代谢状态。关键词：六堡茶，痰湿质，痰湿质转化分，胆红素，肠道菌群

痰湿质是一种病理体质，由于水液内停而痰湿凝聚所致，主要特征为黏滞重浊[1]。流行病学调查显示，我国一般人群中痰湿体质所占比例为7.32%[2]。痰湿质是代谢综合征形成的风险因素，与其发展预后有着密切关系[3-6]。“痰湿体质土壤论”认为，通过调节痰湿质状态，可以达到高血脂、高血糖、高血压等代谢类疾病的“异病同防”[7-9]。痰湿质还与特定人群肝内胆汁淤积症相关[10]，因此，应用清热利湿方剂有助于改善痰湿质人群的胆汁淤积症[11]。油腻饮食与痰湿质的形成相关，多食过量导致脾胃运化不及易形成痰湿[12];反之，痰湿质之人体内痰湿之邪盛，易困阻脾阳，脾再生湿，相互影响，导致脾系亚健康状态的出现[13-18]。现代研究认为，肠道菌群紊乱影响消化功能，是脾虚湿困的重要病理因素[19]。与平和质相比，痰湿质中老年人肠道菌群的丰度及多样性均显著降低，拟杆菌门相对丰度较低，而厚壁菌门相对丰度较高，双歧杆菌等厌氧菌减少[20]。

中医体质学说认为“体质可调”，其调节方式包括心理、运动、饮食调整及适当的中药、针灸等方法[21-22]。薏苡仁、莲子、山药、陈皮、冬瓜、山楂等食药同源食物具有健脾祛湿的作用，在药理学上表现为抗菌、降脂、利尿、改善血管功能、调节肠道菌群、调节免疫力等作用[23-25]。六堡茶是黑茶的一种，产自广西壮族自治区梧州市苍梧县六堡镇，其品质成分的形成与渥堆、窖藏等环节的微生物转化紧密相关。随着陈化时间延长，六堡陈茶中茶褐素和茶多糖增加，茶黄酮和酚酸进一步发生转化，形成新结构的化合物[26]六堡茶具有抗氧化、调节糖脂代谢、保护肝脏、增强免疫功能、促消化、抗凝血、促进胃排空和小肠推进作用[27-30]，与健脾祛湿类食药同源物品有相似的药理作用特点，特别是对于高脂饮食大鼠体现为抑制乙酸分泌、促进丙酸和丁酸分泌的作用[31];促进双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌和肠球菌等厌氧菌的生长，并抑制需氧菌生长[32]。因此，民间所说六堡茶具有“祛湿”作用，可能与调节肠道菌群、促进代谢健康相关。但是，六堡茶的祛湿作用尚未得到论证，其可能的机制也尚未进行阐述。

本研究纳入亚健康状态痰湿质人群进行随机、对照的临床试验，考察六堡茶改善痰湿质的作用，以及重点围绕肠道菌群对其可能的机制进行探讨，为其合理应用和推广提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

供试样本，毛茶经筛选、拼配、渥堆、蒸、压制成型、陈化(相对湿度在75%至90%、温度在23°C至28°C)等工艺制成新茶成品。转至清洁、阴凉、干爽、无异杂味的仓库中继续陈化五年后，制得六堡茶五年陈茶样品，梧州中茶茶业有限公司;空腹血糖(FBG,己糖激酶法)、总胆红素与直接胆红素(TBIL、DBIL,氧化酶法)、丙氨酸氨基转移酶(ALT,丙氨酸底物法)、天冬氨酸氨基转移酶(AST，天门冬氨酸底物法)、总胆固醇(TC,CHOD-PAP法)、甘油三酯(TG,GPO-PAP法)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,直接法-选择抑制法)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,直接法-表面活性剂清除法)试剂盒中生北控生物科技股份有限公司;DNA分离提取(MOBIOPowerSoilDNAIsolation)试剂盒深圳市安必胜科技有限公司,微生物16S基因靶向测序由深圳谱元科技有限公司完成。

多功能高速冷冻离心机ALLEGRAX-25R美国贝克曼库尔特有限公司;ThermoForma5995超低温冰箱赛默飞世尔科技(中国、有限公司;Milli-QReference纯水仪德国默克集团有限公司。

1.2实验方法

1.2.1研究对象的选择标准及分组

依据《中医体质分类与判定表》和人群亚健康调查问卷，选择18~30周岁健康平和体质及痰湿质体质人群作为研究对象,其中平和质以体态适中、面色红润、精力充沛、脏腑功能状态强健壮实为主要特征,痰湿质以体型肥胖、腹部肥满、口黏苔腻等痰湿表现为主要特征[33]。

采用人群随机对照研究,共纳入健康平和质42人,痰湿质70人。在干预期间,将所有人群分为4组，健康平和质人群为平和质对照组(PH),痰湿质人群分为痰湿质对照组(TSControl,27人)、六堡茶新茶干预组(Tea,24人)、六堡茶陈茶干预组(AgedTea,19人)，进行两疗程(45天/疗程,共90天)的标准化干预及评价,干预方式见1.2.2。本研究经中国注册临床试验伦理审查委员会伦理审查，文号：ChiECRCT20190168,中国临床试验注册中心临床研究注册号码：ChiCTR1900026342。

1.2.2六堡茶干预物制备

平和质对照组(PH)、痰湿质对照组(TSControl)给予生活方式指导，包括膳食营养指导、体力活动指导、睡眠指导[22]o六堡茶新茶干预组(Tea)、六堡茶陈茶干预组(AgedTea)除生活方式指导外,分别给予六堡茶新茶、六堡茶五年陈茶干预,每次1袋(10g),200mL沸水浸泡2min口服，每日2次，服用两个疗程(45d/疗程)。

1.2.3体质转化分计算

体质得分(转化分)采用中医体质调查表对体质的转化进行评价,按照《中医体质分类与判定表》评分[33],每一问题按5级评分,每个条目原始最低分是1分,最高分是5分,计算原始分及转化分,依标准判定体质类型。原始分=各个条目的分相加。痰湿质转化分数=[(原始分-条目数)/(条目数x4)]xlOO,按照公式计算干预0d、25d、45d和90d体质转化分数。平和质转化分大于等于60分且其他八种体质转化分均小于30分,记为平和体质。痰湿质转化分大于等于40分且平和质转化分小于60分、其他七种体质转化分不高于40分,记为痰湿质。

1.2.4生化指标测定

试验第0d、25d和45d上午10点抽取静脉血5mL于EP管中,血浆样品静置2h后,3500r/min、4C条件下离心10min取上清液，严格按照试剂盒要求进行血清FBG、TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL的测定。

1.2.5肠道微生物16S基因靶向测序分析

试验第0d、25d和45d留取粪便样品3〜5g于取样管中(内含裂解液和稳定液)，由深圳谱元科技有限公司完成肠道微生物16S基因靶向测序分析[34]。

1.3数据处理

实验结果通过SPSS20.0统计软件进行统计分析，采用平均数±标准差，各组比较应用ANOVA分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果与分析

2.1六堡茶干预后痰湿质改善情况

六堡茶干预后痰湿质改善结果如图1所示，六堡茶陈茶干预组和新茶干预组在干预25d、45d两个时间点的痰湿质转化分均有下降趋势，六堡茶陈茶干预组痰湿质转化分从38.97±7.10下降到25d的36.57±5.68和45天的33.72±3.12,六堡茶新茶干预组由40.76±7.95

(0d)下降到30.86±4.87(25d)和29.76±5.42(45d)。六堡茶新茶干预组在干预25d、45d和90d的痰湿质转化分均与痰湿质对照组有显著差异(P<0.05)，六堡茶陈茶干预组痰湿质转化在干预90d时，与痰湿质对照组有显著差异(卩<0.05)。

2.2六堡茶干预对血液生化指标的影响

本试验分别对干预前(0d)、第一疗程中期(25d)和第一疗程干预末期(45d)三个时间节点的空腹血糖(FBG)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG,)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行检测，结果如图2、图3、图4和图5所示。

2.2.1六堡茶干预对空腹血糖的影响

实验干预45天后，平和质对照组空腹血糖水平为(4.74±0.37)mmol/L、痰湿质对照组为(4.67±0.29)mmol/L，六堡茶新茶干预组和六堡茶陈茶干预组空腹血糖分别为(4.78±0.32)mmol/L、(4.74±0.26)mmol/L，与对照组相比，六堡茶新茶干预和陈茶干预对空腹血糖无显著影响。

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2.2.2六堡茶干预对血脂水平的影响

六堡茶陈茶和新茶干预后，总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白均有一定程度的下降趋势，六堡茶陈茶干预组总胆固醇由0d的(4.58±0.97)mmol/L下降为45d的(4.44±0.83)mmol/L，高密度脂蛋白由(1.53±0.38)mmol/L(0d)下降至(1.44±0.34)mmol/L(45d)，低密度脂蛋白由(2.62±0.94)mmol/L(0d)下降至(2.51±0.82)mmol/L(45d);六堡茶新茶干预组总胆固醇由(4.64±0.81)mmol/L(0d)下降至(4.41±0.70)mmol/L(45d)，高密度脂蛋白由(1.54±0.29)mmol/L(0d)下降至(1.47±0.34)mmol/L(45d)，低密度脂蛋白由(2.68±0.72)mmol/L(0d)下降至(2.51±0.66)mmol/L(45d)，但与对照组相比，变化没有显著性差异，且下降后的值在正常范围内，说明本试验中六堡茶的干预对正常范围内的血脂水平没有显著影响。

Fig.3Thetotalcholesterol,triglycerides,high-densitylipoproteinandlow-densitylipoproteinofeachgroup

2.2.3六堡茶干预对胆红素的影响

六堡茶陈茶和新茶干预后，六堡茶陈茶干预组的总胆红素由(14.31±8.42)gmol/L(0d)、下降至(8.24±3.72)gmol/L(45d),六堡茶新茶干预后，总胆红素由0d的(11.25±5.30)gmol/L下降至45d的(8.34±3.70)gmol/L。六堡茶陈茶干预组直接胆红素由(5.79±3.44>mol/L(0d)下降为(3.52±1.58)gmol/L(45d),六堡茶新茶干预组直接胆红素由0d的(4.34±2.00)gmol/L变化为45d的(3.43±1.41)gmol/L。即六堡茶陈茶和新茶均具有降低胆红素(总胆红素和直

2.2.4六堡茶干预对肝功的影响

丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)是反应肝功的重要指标，常用于肝脏或消化系统性疾病的诊断以及评估[35]，各组检测结果见图5。结果显示，在整个干预期内，ALT及AST均保持在正常水平，即40U/L以下。各组ALT及AST均岀现一定的下降趋势，六堡茶陈茶干预后，ALT由(33.53±27.85)U/L(0d)下降为(29.10±25.43)U/L(45d),AST由0d的(21.26±11.88)U/L下降为45d的(17.00±6.76)U/L;六堡茶新茶干预组，ALT由(18.67±9.54)U/L(0d)下降至(16.09±11.22)U/L(45d),AST由(16.30±5.76)U/L(0d)下降为(14.17±5.52)U/L(45d)。与对照组相比，变化无显著性差异，六堡茶饮茶干预对于ALT和AST影响不大。研究显示，若肝主疏泄的功能存在缺陷，进而影响脾运，无以正常升清，津液输布不畅，聚浊酿痰[36]。

2.2.5体质与血生化指标相关性分析

通过将血生化检测指标与平和质转化分、痰湿质转化分相关性分析发现(图6)，痰湿质转化分与丙氨酸氨基转移酶呈正相关(P<0.05,相关系数为0.131)，与总胆红素呈负相关(P<0.05,相关系数为-0.139)、与直接胆红素呈负相关(P<0.01,相关系数为-0.141),与其他生化指标相关性不显著(P>0.05)。庄耀东等[37]指岀代谢综合征与中医的“痰浊”或“痰湿”关系密切，研究结果为痰湿质转化分与直接胆红素呈负相关，与本实验结论一致。同时痰湿质转化分与胆固醇和甘油三酯呈正相关，而本实验结果显示痰湿质转化分与胆固醇和甘油三酯相关性不显著，其原因可能是由于本实验所招募人群年龄普遍较轻，存在高血脂的人群占比较小，有待后续进一步进行证实。

2.3六堡茶干预对肠道菌群的影响

采用干预后(45d)的肠道菌群丰度数据分析肠道菌群a-多样性及门属水平变化情况，多样性分析包含丰富度(Obeserved_OTUs，反映样品中含有的物种数目，数值越高表明样品物种丰富度越高)和均匀度(Shannon指数，评估样本中物种组成的丰富度和均匀度，值越大表示该环境的物种越丰富，各物种分配越均匀)。

从结果图7A可以看岀，平和对照组、痰湿对照组与六堡茶新茶干预组的Obeserved_OTUs值相差不大，而六堡茶陈茶干预组的Obeserved_OTUs值低于其他三组，说明六堡茶新茶对肠道菌群物种丰富度影响较小，而六堡茶陈茶对肠道菌群物种丰富度影响大于新茶，其物种丰富度稍小于其他各组。

从肠道菌群门水平变化来看(如图8所示)，痰湿质人群的拟杆菌门(Bacterioidetes)水平下降，相对丰度由平和质人群的0.52±0.28变化为0.51±0.06，厚壁菌门(Firmicutes)水平有所上升，由平和质人群的0.39±0.14变化为0.41±0.13;饮茶后这一变化更为显著，痰湿质新茶干预组拟杆菌门(Bacterioidetes)水平下降为0.49±0.17-厚壁菌门(Firmicutes)水平上升至0.42±0.23，痰湿质陈茶干预组拟杆菌门(Bacterioidetes)水平下降为0.48±0.35、厚壁菌门(Firmicutes)水平上升至0.45±0.08，以六堡茶陈茶干预变化更为明显。

Fig.8Changesofgutmicrobiotainthelevelofphylum从肠道菌群属水平变化来看(如图9所示)，痰湿质人群的需氧菌大肠杆菌/志贺菌(Escherichia-Shigella，需氧菌)的相对丰度为0.013±0.026，略高于平和质人群(丰度为0.010±0.016)，饮茶后下降，六堡茶新茶干预组相对丰度为0.009±0.012，六堡茶陈茶干预组相对丰度为0.005±0.034，以六堡茶陈茶干预后下降更为明显，提示肠道健康情况得到改善。痰湿质人群的拟杆菌属(Bacteroides)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的相对丰度(分别为0.29±0.16、0.034±0.021)比平和质高(分别为0.26±0.18、0.030±0.028)，六堡茶新茶干预使得拟杆菌属(Bacteroides)和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的相对丰度降低，分别为0.24±0.17、0.027±0.013。痰湿质人群的粪杆菌属(Faecalibacterium)相对丰度(0.091±0.059)比平和质略低(0.094±0.057)，新茶和陈茶干预均使得粪杆菌属(Faecalibacterium)的相对丰度略有升高(0.092±0.025、0.094±0.041)，粪杆菌属与丁酸代谢等密切相关，和丁酸与肠道屏障改善、炎症改善等密切相关。与平和质人群相比，痰湿质人群嗜胆菌(Bilophila)的相对丰度升高，由0.0019±0.0020上升为0.0021±0.0022，与摄入油腻饮食的菌群变化现象一致[12]。嗜胆菌的作用可能是降低动物性饮食带来的心血管风险[38]，饮用六堡茶后，嗜胆菌(Bilophila)的相对丰度提高至六堡茶新茶干预组的0.0024±0.0013和六堡茶陈茶干预组的0.0022±0.0034，以六堡茶新茶干预组升高更为明显，表明饮用六堡茶后胆汁酸分泌进一步增加，可能是解腻、去痰湿的机制之一。

2.4体质与菌群相关性分析

通过《中医体质分类及判定表》所定的人群体质类型，对试验所纳入人群的肠道菌群进行检测，结合平和质转化分、痰湿质转化分，通过平和质转化分、痰湿质转化分与目水平菌群的相关性分析，如图10所示。结果显示痰湿质转化分与Bifidobacteriales菌、Sphingomonadales菌、Izimaplasmatales菌呈显著正相关(P<0.05,相关系数分别为0.130、0.120、0.131),与Synergistales菌呈显著负相关(P<0.01,相关系数为-0.152),且在六堡茶干预后，Bifidobacteriales菌、Sphingomonadales菌、Izimaplasmatales菌的丰度呈下降趋势、Synergistales菌丰度呈上升趋势，即肠道微生物中含有更高丰度的Bifidobacteriales菌、Sphingomonadales菌、Izimaplasmatales菌和更低丰度的Synergistales菌的人群在体质上更偏向痰湿质

3结论与讨论

六堡茶新茶和5年陈茶均具备改善痰湿质状态的作用，在饮茶25天即可看到改善作用，每日饮茶量为10g，200mL沸水浸泡2min口服，每日2次，其中六堡茶新茶的改善作用优于六堡茶陈茶。

将中医体质评分与肠道菌群的丰度进行分析，结果发现痰湿质人群的大肠杆菌/志贺菌

(Escherichia-Shigella)、拟杆菌(Bacteroides)和考拉杆菌(Phascolarctobacterium)、嗜胆菌(Bilophila)等菌丰度高于平和质人群，而粪杆菌(Faecalibacterium)Cloacibacillus菌、溶杆菌(Lysobacter)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)等菌的丰度低于平和质人群，证明肠道菌群紊乱与痰湿质的形成相关。

将受试人群体质与本研究的重要生理指标进行统计学分析，发现痰湿质转化分与总胆红素、间接胆红素水平呈现负相关。胆红素是血红蛋白代谢后的代谢产物，血清中胆红素偏高与肝脏病变或胆管阻塞等异常相关。痰湿症人群较平和质人群更易于发生胆汁淤积，应用清热利湿方剂有助于改善痰湿质人群的胆汁淤积症。本研究发现，饮用六堡茶陈茶和新茶均具有降低胆红素(总胆红素和直接胆红素)的作用，以陈茶更为显著，提示六堡茶特别是陈茶的祛湿机制之一是改善胆红素代谢。肠道菌群分析证实，饮茶促使表达胆盐水解酶的拟杆菌属丰度下降，提示结合型胆汁酸的分解代谢受到抑制，可能通过进一步作用于FXR受体通路，将促使胆固醇转化为胆汁酸。而肠道嗜胆菌的增殖则在饮用新茶组更为明显，嗜胆菌有助于降低动物性饮食带来的心血管风险，是人体保护机体的一个反馈机制。因此，尽管新茶和陈茶均可能通过肠道菌群-胆汁酸代谢通路发挥祛湿作用，但是其机制存在差别，是否与其内含的茶多酚、茶多糖、酚酸等含量和结构的差异有关，有待进一步研究予以论证。

本研究所纳入的人群按体质进行遴选和分组，由于招募人群的年龄普遍较轻，在血液诊断指标上处于糖脂代谢不同阶段的兼而有之，存在高血脂、高血糖、高血压等多种代谢综合征的人群占比较小，因此六堡茶对于空腹血糖、脂代谢的调节作用在统计学上不显著。而饮茶后与代谢疾病、能量代谢有关的萨特氏菌属(Sutterella)、Izimaplasmatales菌和瘤胃球菌属(Ruminococcus、的相对丰度水平均发生改变。本研究提示，通过饮用六堡茶带来祛湿作用，可能有助于在亚健康阶段，实现代谢病的“异病同治”，其机制与调节肠道微生态相关。