“植物细胞工程”实验教学的改革与探索
摘要：“植物细胞工程”是生物工程专业的核心课程，实验教学是课程的重要环节。经多年教学研究与探索，将教学内容“开放化、多样化”，操作要点“视频化”，实验报告“论文化”，课外延伸“项目化”，取得了较好效果。
关键词：植物细胞工程;实验教学改革;自主选材;微课;课外延伸
Key words：Plant Cell Engineering;reform of experimental teaching;independent selection of materials;micro-lecture;extracurricular extension
“植物细胞工程”是生物工程专业的核心课程，该课程以植物细胞为研究对象，通过生物学原理和工程手段，按照人们的意愿对细胞进行定向改造或生产细胞产品的一门应用性很强的课程，在生物医药、农业、食品、生物资源环保、新物种构建等领域发挥着越来越重要的作用[1-2]。实验教学是植物细胞工程的一个重要环节，相比略显枯燥的理论课，大多数学生对实验课充满期待。
传统的实验教学内容是固定的、单一的，学生只能按照既定模式进行操作，丧失了探索的可能，也从一定程度上影响了学习的积极性。另外，细胞工程实验的无菌操作要求高，污染会导致彻底的失败。怎样保证实验的成功率，怎样使实验课的教学效果更好，怎样使每位学生在整个实验过程中始终保持着较浓厚的学习兴趣，怎样使学生的自主学习能力得到加强?已成为“植物细胞工程”教学过程中必须思考和探索的问题。
1 传统“植物细胞工程”实验教学方法的不足
改革前，学校生物工程专业“植物细胞工程”课程共48学时，其中实验16学时，实验内容包括MS培养基的配置、胡萝卜愈伤组织的诱导、继代或分化，实验所用培养基及激素成分是固定的，属于验证性实验。教学中，超净工作台数量有限，学生需轮流操作。在教师做演示实验时，由于学生站位角度问题，不少学生难以领会操作要领，不能很好地掌握组培的无菌操作技术，加之使用的胡萝卜可能带有内生菌，因而整个实验的污染率较高。
在传统的“植物细胞工程”实验教学中，学生只是完成整个实验的部分步骤：在培养基配制与灭菌实验的传统教学中，通常情况是实验教师提前准备好各种母液，上课时学生按照教师提供的配方集中进行培养基的配制;培养基灭菌结束后，超净工作台中物品的摆放通常由每个小组的个别学生和教师一起完成;接种完成后，材料放入组培室的过程也是由小组部分学生完成，很多学生不知道材料培养的具体环境条件。这种走流程轻过程、重接受轻参与的做法，导致很多学生对于实验整个流程的了解比较模糊，特别是实验细节不注意，最终影响到实验效果，不利于学生实践能力的培养。
“植物细胞工程”实验内容虽然具有一定的连续性，但也是分小实验完成的，传统的教学过程中，学生做完一次实验，提交一次实验报告，书写格式为实验目的、实验原理、方法步骤、结果与分析，大部分报告内容在实验指导书上都有，学生之间所能体现不同的仅有“结果与分析”，导致学生在完成实验报告的过程中不思考，只流于形式，甚至個别学生出现了抄袭的现象。
2 应对方法和措施
基于上述情况，笔者在10余年的教学过程中不断思考、不断探索，以提高“植物细胞工程”实验的教学效果。
2.1 教学内容“开放化、多样化”
在教学中发现，很多学生对植物组织培养非常感兴趣，经常咨询不同材料的组培问题，为了充分调动积极性，教师将实验内容“开放化、多样化”，在实验开课前1个月，把实验课的形式及要求告知学生，并鼓励大家选择感兴趣的材料，自由分组，查阅资料，设计实验，经过组内充分讨论后，跟指导教师一起敲定实验方案。到目前为止，经学生自主设计并完成实验的内容有月季芽的无菌培养及生根培养、多肉植物愈伤组织的诱导及继代、银杏叶片愈伤组织的诱导及继代、胡萝卜愈伤组织的诱导及悬浮细胞系的建立、不同类型的培养基对胡萝卜愈伤组织诱导及分化的影响等。
对于未进行自主选材的学生，可以研究激素种类、浓度及配比对胡萝卜愈伤组织诱导及分化的影响。在胡萝卜愈伤组织诱导及分化的过程中，激素起着至关重要的作用，特别是两类激素：生长素和细胞分裂素，为了让学生更好地理解这2种激素在组织培养中的作用，设计了不同的激素浓度梯度和配比，要求不同小组按照不同激素浓度配置培养基，培养结束后将所有梯度进行横向比较，这样就证明了激素对生长效果的影响。尽管这种设计是相对固定的，但“哪个梯度更好”的疑问常常使得学生们更有兴趣去完成该实验。
2.2 将微课思想引入到实验课堂
植物细胞工程实验成功率的保证主要包括2个方面，一方面是实验设计的合理与否，另一方面是实验过程中的无菌操作是否过关。很多学生实验污染率高的主要原因就是无菌操作不过关，针对这种情况，在课前录制了无菌操作的示范视频，提前发放给学生观看，再统一在课前强调操作的关键点，这样可以保证每位学生都清晰地看到教师的演示，清楚地了解无菌操作的注意点，从而保证实验的成功率。
除了无菌操作演示实验视频外，教师还录制了超净工作台的摆放规则视频，培养物的培养环境条件控制视频等，帮助学生更清晰地了解实验的整个流程。
2.3 实验报告“论文化”
将传统的分次完成实验报告改成让学生撰写一篇实验论文，包括题目、摘要、关键词、前言、实验材料和方法、实验结果和分析、小结等部分，这样一方面可以让学生更好地理解实验的整个流程，另一方面可以促使学生更深入理解和分析实验结果，同时也可以让学生的科技论文写作能力得到初步锻炼。
2.4 课外延伸
对于学有余力的学生，教师鼓励他们在课程实验的基础上，通过申報大学生科技创新项目、参加综合实训项目等方式，更深入地推进实验，提高学生的动手能力及创新能力。比如，做银杏叶片愈伤组织诱导和继代的实验小组，申请了国家级大学生科技创新项目“银杏组织培养法生产活性黄酮的初步研究”，课题组学生依托该项目发表了北大核心及以上论文3篇[3-5]，完成了1篇省级优秀学士学位论文，项目组学生参加了第三届湖北省生物实验技能竞赛，获得了综合赛三等奖。
3 结语
在“植物细胞工程”实验课的教学过程中，给学生提供自主选材、自主设计并开展相关研究的机会和条件;通过引入微视频，强化实验操作细节，提高了实验成功率;通过实验报告“论文化”锻炼了学生的科技论文写作能力;鼓励学有余力的学生通过大学生科技创新项目更深入地推进实验，培养学生的动手能力及创新能力[6]。
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作者：邓祥宜 李琳 周雪婷 李继伟
摘 要：该文分析了《植物细胞工程实验》教学中存在的问题，总结了改善实验条件、优化教学内容、改变教学形式、开展设计性实验、丰富考核内容等改革措施，达到了提升教学质量和学生综合能力的成效。
关键词：植物细胞工程实验;教学改革;设计性实验
Key words：Plant cell engineering experiment; Teaching reform; Design experiment
20世纪中后期，生物工程这门新兴的综合性学科开始兴起。21世纪，生物工程取得了很多重要的成就[1]，是当今世界上发展最快的学科之一。为适应时代发展的需要，2007年皖西学院开设生物工程专业，此后通过不断创新、优化教学改革，皖西学院生物工程专业已成为了省级特色专业、国家级“专业综合改革试点”[2]。皖西学院生物工程学科包括植物生物技术、植物天然产物开发、微生物发酵工程、蛋白质与酶工程、生物质能源工程、生物工程综合实验等。其目的是使学生们掌握现代化生物技术，具备研发生物类产品的能力，从而能够胜任生物工程领域的工作。
植物细胞工程是生物工程技术的重要组成部分，与植物生理学、遗传学、分子生物学、生物化学、基因工程等[3]紧密联系，是植物生物技术的基础，在生命科学的各个领域均得到了广泛的应用，是科学研究和产业化应用的重要技术手段。植物细胞工程实验以植物细胞为基本单位，通过体外培养技术，使细胞的某些特性得以改變，从而达到按照人们的意愿改良植物品种、创造具有优良性状的新物种、植物快速繁殖或是得到某些重要物质的目的。近几年来，笔者开展了植物细胞工程实验教学改革的探索，提高了学生的创新能力，以期培养出适应未来发展的高素质人才。
1 植物细胞工程实验传统教学中存在的问题
1.1 实验条件较差 2007年，皖西学院开设了生物工程专业，实验课程则是在近几年开设的，尚存在着实验室空间不足、实验器材短缺、实验资源匮乏、实验项目单一等问题，从而在很大程度上制约了实验课的开展。
1.2 教学模式单一，教学效果不理想 皖西学院的植物细胞工程实验传统的教学模式如下[4]：实验课前，学生自主预习并完成预习报告。预习能够使学生提前了解实验，但由于学生并未进行深入思考，导致预习效果不理想。此外，预习报告内容照抄照搬的现象普遍存在。实验课上，教师逐一讲解实验目的、实验原理、实验仪器、试剂及其配制、实验步骤、实验数据处理以及常见问题注意事项等。过于详细的讲解，一方面占用了大量的实验时间，另一方面学生在整个讲解过程中无法完全集中注意力，存在着重要知识点不突出的问题。学生在整个实验过程中根据实验讲义逐步操作，实验虽完成了，但不知道实验数据或实验结果如何，即不能根据实验现象解释实验原理或用实验原理解释实验现象。机械操作，对于一些关键点没有任何印象。传统的教学模式不能引起学生对实验课的重视，缺乏对实验的兴趣，未能达到预期的教学效果。
1.3 教师工作量大 实验课实行所谓“承包制”：实验室的安全、环境卫生、用水用电以及整个实验中所需要的仪器、试剂、耗材等全部由教师负责。教师在实验开始前需要配制出所需试剂并进行预实验，以保证学生实验能够成功进行。实验课上，老师要利用相当长的时间对实验进行详细讲解，由于学生根据实验讲义进行机械操作，在实验过程中仍然会出现大量问题，教师不得不在整个实验过程中为学生解决问题，不断地进行演示和解释。另外，试验过程中教师需要批改预习报告，试验结束后，根据实验结果和数据判断实验是否需要重做，若结果不理想，老师需要对这部分学生再次进行耐心地讲解和反复的强调，然后学生再重新实验。而开设一门实验课，实验课时也许只有16个学时或更少，但材料的准备、提交以及实验课的顺利开设，消耗了教师相当多的精力，教师感觉很疲惫，从而不愿意上实验课。
1.4 学生预习效果差，缺乏学习的主动性 学生在实验前进行预习只是为了完成预习报告的提交。在实验前一天甚至更短时间浏览实验书，把实验目的、实验原理等匆匆抄上去，或是连实验书都不看直接抄袭别的学生预习报告，实验过程中可以明显感觉到学生对于实验原理、实验过程并不熟悉，预习效果差。在整个实验过程中，实验所需试剂教师会提前配制好，实验目的、实验原理、实验步骤、数据处理以及注意事项教师也会详细讲解，可以说教师做的越多学生思考的就越少，即使实验失败也不知其失败原因，并且不会自觉探究失败原因，而是等待教师解释。另外，由于目前皖西学院的教学模式主要是教师提供实验教材或实验讲义，实验技术成熟，实验结果明确，学生直接按照所给的教材或讲义一步一步进行实验。教师提供教材的目的是为了让学生更好地学习，但同时也会使学生过于死板，只会机械地进行实验，不懂得变通，缺乏创新能力[5]。
1.5 实验考核方式不完善 传统植物细胞工程实验课的成绩很大程度上参考学生的实验报告，由于学生实验报告中实验目的、实验原理、实验步骤、实验中注意事项这些内容都是相同的，所以打分依据一般是数据处理分析。一方面，数据处理方式有教师统一教授，处理结果大同小异;同时，学生深知与标准结果更接近就能够获取更高的分数，这就导致了部分学生人为地改动实验数据，失去了实验的意义。另一方面，实验报告并不能够准确的反应出学生在实验过程中对于实验技能的掌握和实验态度。依靠实验报告这一考核手段显得有些单薄，并不能够真实地反映出学生的能力。
2 植物细胞工程实验课程改革措施
2.1 改善实验条件 植物细胞工程课程组教师通过各种平台申请实验项目，获得实验经费，以改善实验室条件，目前植物细胞工程实验室硬件设施更加齐全。植物细胞工程实验室位于植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，现有准备室、接种室、培养室以及分析处理室等，购买了新的超净工作台、臭氧发生器、离心机、破碎机、高压蒸汽锅、培养瓶以及培养架等实验器材。植物细胞工程实验大都是在无菌环境下进行，因此，在实验开始前以及结束后都会对实验室进行无菌消毒处理，一般是采用臭氧消毒;定期会对实验室进行全面消毒。同时，对于实验室的管理也更加严格，学生进入实验室时必须更换工作服、戴无菌帽、口罩、鞋套等，保持实验室的整洁卫生，共同维护实验室的环境。
2.2 优化教学内容 植物细胞工程课程组教师经过不断探索，最终决定植物细胞工程实验安排如下内容：(1)植物组培实验室设计和实验设备、实验用品认知;(2)MS培养基母液的配制;(3)MS培养基配制、灭菌与分装;(4)外植体分化生长的诱导培养;(5)外植体脱分化生长的诱导培养;(6)组培苗的炼苗。通过这6个实验，学生由最初认识实验设备到独自配制培养基并对培养基进行分装、灭菌再到获取愈伤组织并对其进行脱分化处理最后到炼苗，学生由浅入深逐渐掌握了完整的实验技能，与此同时也更深一步地了解了植物细胞的全能性、分化、脱分化、再分化等概念，真正将书本上的知识具现化，用于生产实践中。此外，皖西学院有诸多的产研学合作基地，教师会安排课时让学生去产业基地实地参观，将书本和实验中所学到的技能用于生产实践中，进一步加深同学们的理解。
2.3 改变教学形式 在了解到传统教学的弊端后，皖西学院教师决定对原有的教学形式进行改革，不再只是简单的让学生预习书本上的实验目的、实验原理、实验步骤等，而是采用多媒体教学。教师建立一个微信公众号，微信公众号里有实验视频，学生可自行观看实验视频进行学习。实验视频一方面是让学生了解到本课程的重要性以及本课程在生产实践中的重要作用，以此提升学生对于本课程的兴趣;另一方面，则是每一节课涉及的实验技能学习，学生通过观看视频了解到基本的安全教育、仪器操作、无菌操作等技能。上实验课时，教师需要对学生的预习情况进行简单的考核，将讲解的机会移交给学生。通过学生的讲解，一方面，能够加深其自己对本节知识的理解;另一方面，学生对学生进行讲解，他们的思维更相近，更容易使对方明白。毫无疑问，教师需要对实验进行补充讲解，使学生了解得更加透彻[6]。
2.4 学生轮流做实验助理 实验课所需的试剂不再由教师配制，而是由教师安排实验助理配制，预实验也是由实验助理完成，预实验中遇到的问题可由学生自行讨论解决，再与教师商讨。实验助理的安排可依据学号来分组，一组的人数由每个班级人数和实验课时共同決定，要让每一位同学都亲自参与到预实验中。通过安排实验助理，一方面，极大地减轻了教师的工作量，让教师有更多的精力去设计实验课程以及申请实验项目来获得资金以此完善实验室设备，形成良性循环;另一方面，让学生完整地参与到实验的每一步，预实验能否顺利完成取决于学生是否认真对待本实验以及是否规范操作，在预实验中遇到的问题很大程度上由学生相互讨论解决，既加深了学生对于实验的理解，也锻炼了其独立思考的能力。
2.5 开展设计性实验，培养学生的创新能力 传统的实验课主要是由教师指定实验项目以及实验内容，这禁锢了学生的思维，不能充分发挥学生作为实验主体的主观能动性，因此可开展设计性实验[7]，培养学生的创新能力。首先，将班级同学分为几个小组，每个小组的人数不宜过多，过多会使某些学生不能够完全参与到实验中，也不能过少，过少会使学生任务繁重，所以4～5人最为适宜;其次，由教师给出1个总的研究方向;再次，学生自由选择自己所感兴趣的实验材料，通过万方、维普或是中国知网等查阅相关资料，自行撰写实验可行性分析报告、实验方案等，所制定的实验方案要交给教师审阅，由教师指出其中的不足并最终确定实验是否可行。实验方案一旦完善后，学生可自由安排时间去做实验，实验器材、试剂由学校提供，需要的材料由学生自行购买，实验最后所得成果需要交给教师检查，最终成绩评定由教师和学生共同评定。通过设计性实验的开展，发现学生对于自主设计非常感兴趣，从开始到结束完全由自己把握，学生做实验的热情高涨。这一举措充分调动了学生的积极性，自主设计实验加强了同学们查阅资料、寻找信息、独立思考的能力，培养了他们的创新能力。
2.6 丰富考核内容，使考核更加全面 传统的考核多依赖于实验报告，并不能够全面反映学生能力，现决定更改考核方式，使考核的内容更加全面，更改后的考核由实验技能考核、平时成绩、实验报告组成。实验技能考核是在课程结束后进行测试，分为笔试(20%)和实验操作(30%)，笔试考察了学生对于实验的基本知识、基本理论的掌握情况，实验操作则重点在于检查学生实验课是否认真参与、是否规范操作以及在实验过程中的应变能力。平时成绩以学生在实验课回答问题的情况为依据，重点在于考察学生是否认真预习以及查阅资料的能力。实验报告注重书写情况以及实验数据的准确性，考察的则是学生对于实验课的态度。总成绩=实验技能考核×50%+平时成绩×30%+实验报告×20%。通过这样的考核方式，使学生重视实验课、重视实验操作，并获得了良好的实验技能、学会寻找问题和分析问题，极大地提高了学生的综合能力。
3 小结
通过改善实验室环境、优化教学内容、改变教学形式、开展设计性试验、丰富考核内容等一系列措施，极大地提高了学生对实验课的兴趣，充分发挥了其作为实验主体的主观能动性。在整个实验过程中，学生全程参与，从依赖老师变为学会发现问题并独立解决问题，从不熟悉实验操作到规范操作，这就是对植物细胞工程实验教学改革探索的意义。教学改革的探索是一个长期的过程，并非一朝一夕就能完成。因此，今后需不断改善实验室条件，提高教师自身的综合能力，提高教学质量，提升学生的综合能力[8]。
参考文献
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(责编：张宏民)
作者：何晓梅 刘昌利 詹少华
摘 要：近年来，随着我国中医药事业的持续发展，药用植物次生代谢产物的应用途径逐渐增多，药用价值和经济价值逐年上升，其市场需求量也持续增长，而药用植物野生资源蕴藏量下降、生态环境破坏等问题使得药用植物面临着严重的市场供需矛盾。药用植物人工栽培面临着栽培困难、品种退化、成本高昂等难题。采用植物悬浮细胞培养技术，可快速获得成熟的植物细胞、积累植物中的活性成分，为获得药用植物资源开辟了新途径。简要介绍了悬浮细胞的最优培养条件和方法、大规模生产悬浮细胞的研究以及悬浮细胞培养技术的前景。
关键词：药用植物;悬浮细胞;培养条件;植物生长物质;诱导子
药用植物的次生代谢产物有极高的药用价值，比如柴胡皂苷可抗病毒、甘草甜素有免疫调节作用[1]。此类化合物除药用外也可作为良好的保健品、农药及化妆品原料，需求量与日俱增。而人工栽培药用植物对种子、土壤、气候等条件要求较高，栽培过程中易感染病害、栽培时间长、管理成本高等问题都使药用植物次生代谢产物供需关系紧张。
植物悬浮细胞培养是一种快速获得成熟植物细胞及其代谢产物的新技术，运用悬浮细胞培养技术，可以大量生产药效成分[2]。目前已运用悬浮细胞技术成功获得包括人参、甘草、厚朴[3-5]等大宗药材的次生代谢产物。植物悬浮细胞不仅可用于生产药用活性物质，还能用于遗传多樣性分析、研究转基因植物和探究代谢产物生物合成路径等方面[6]。目前已有200余种植物进行悬浮细胞培养，中国、日本、德国已成功进行人参、紫草等植物的大规模生产，能够满足人参、皂苷等植物次生代谢产物的市场需求[7]。
植物悬浮细胞培养技术可在人工精确设计下获得药用植物细胞及其代谢产物，不仅能缓解药用植物资源紧缺的问题，还能减少对土地资源的占用，是获取药用活性成分、保护药用植物资源的重要手段。尽管国内外已经进行了悬浮细胞培养的初步尝试，但是此技术还需要不断优化和改进。本文将对悬浮细胞的最优培养条件和方法、大规模生产悬浮细胞的研究以及悬浮细胞培养技术的前景进行综述。
1 悬浮细胞制备
获得植物悬浮细胞的操作流程如图1所示，建立良好的悬浮细胞培养体系受多方面因素影响，确定各因素的最佳条件是成功建立及优化悬浮细胞培养体系的关键。
悬浮细胞的制备是建立良好的悬浮细胞体系的基础，制备流程主要包括选择外植体、选择最佳诱导愈伤部位、选择最佳愈伤状态、悬浮细胞的筛选和继代4个方面。
外植体的选择能够影响细胞的生长，适宜的外植体可诱导出胚性愈伤率和再生率较高的体系，更容易建立起高频再生的悬浮细胞系[8-18]。部分植物的最佳外植体诱导部位见表1，说明不同的植物对诱导部位的选择差异较大。
而同一植物的不同部位所诱导的愈伤组织状态也不同，祖恩凡等[19]研究发现金银花的嫩茎能诱导出活力最佳的愈伤组织，因此选择合适的外植体部位才能诱导出生长良好的愈伤组织，从而构建良好的悬浮细胞培养体系。
试验所得的愈伤组织通常有3种类型：Ⅰ型为质地坚硬、块状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织;Ⅱ型为质地疏松、易分散、不分泌黏液的颗粒状胚性愈伤组织，外观往往呈现淡黄绿色;Ⅲ型为柔软、水渍、形状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织。悬浮细胞系的建立通常选择Ⅱ型愈伤组织作为建立悬浮细胞系的材料。在培养朱砂根、印楝、何首乌、油棕、相思树等[20-24]植物的悬浮细胞时，均使用到质地疏松、分散、不分泌黏液的颗粒状胚性愈伤组织进行悬浮细胞的培养。愈伤组织的细胞结构随着继代次数的增加逐渐变得疏松，且细胞体积增大，畸形细胞明显增加。这表明，愈伤组织中的细胞逐渐由胚性愈伤组织转化为非胚性愈伤组织。张静等人对山西野葛悬浮细胞的研究显示，选用继代第三次的愈伤组织进行悬浮细胞培养的野葛[25-26]总黄酮含量最高。
为得到均一性、分散性良好且生长旺盛的悬浮细胞系，在继代时需对悬浮细胞进行筛选，得到均一性、良好的细胞系。目前主要操作的方法有小细胞团筛选法、直接倾倒法和移液管接种法[27]。小细胞团筛选法指用不锈钢网或尼龙网[28]筛选细胞团，收集小细胞进行继代培养。在对刺山柑[29]研究中发现，随细胞团直径增加，细胞中总黄酮含量下降[30-31]。
悬浮细胞的生长曲线为S型，分为延滞期、对数生长期、稳定期及衰亡期4个阶段。3种植物的生长周期见表2，对数生长期后，由于培养基中的营养物质减少，细胞开始代谢积累有害物质，使细胞生长速度减慢。不同植物的悬浮细胞生长周期不同，但继代培养都应选择在对数生长的末期或稳定期进行。
2 培养条件
对悬浮细胞中次生代谢物的产生影响较大的是悬浮细胞的培养条件，主要包括两个方面，一个是培养基的选择，另一个是外部条件的控制，包括pH值、溶氧水平等。
2.1 培养基的选择
培养基成分主要包括基础培养基、大量元素、植物生长物质、前体物质和诱导子。目前，建立或优化植物悬浮细胞培养体系时，多就植物生长物质和诱导子的种类和浓度进行研究。
常见的培养基种类有B5、MS、White、N6等，郭紫娟[32]发现，三七的悬浮细胞细胞干重增长量在B5培养基中比在MS培养基中高1.25 g/L。因此选择合适的基础培养基有助于提高次生代谢产物的含量。植物培养基中的大量元素包括碳、氮、磷等，碳源是植物细胞生长过程中主要的营养物质来源。氮源在细胞生长过程中主要用于合成蛋白质与核酸等细胞物质。磷是组成生物遗传因子与诸多代谢相关辅酶的重要元素。为更好地促进悬浮细胞的生长和代谢，应当注意大量元素的使用浓度。蔗糖不仅是培养液中碳源的主要来源，还能够维持培养基渗透压。糖的浓度过高易导致细胞失水，产生褐化反应[33]。研究发现，培养基中蔗糖的浓度在28 g/L时，三七幼叶的悬浮细胞干重增长量达到最高[34]。
常用的植物生长物质有6-苯甲基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)，萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)，激动素(Kinetin，KT)等，选用不同的生长物质，对悬浮细胞影响不同。在MS培养基中添加6-BA和2，4-D时，白木香悬浮细胞的生长情况最好，而添加NAA的培养基中，白木香的悬浮细胞出现了褐化现象，细胞鲜重出现负增长[35]。此外，同一生长物质的不同浓度对悬浮细胞的生长也有影响，如紫苏悬浮细胞的干重及迷迭香酸的含量随6-BA的使用浓度先增加后减少[36]。目前研究发现，植物生长物质对悬浮细胞生长代谢的影响有以下两种情况：①低浓度促进悬浮细胞的生长代谢，高浓度抑制悬浮细胞的生长代谢。②在各个浓度下均抑制悬浮细胞的生长代谢。值得注意的是，植物生长调节剂有一定毒性。NAA能够抑制小鼠肝细胞增殖并促进肝细胞凋亡，使小鼠体重减轻[37]。2，4-D是一种常用的除草剂，能降低小鼠精子质量，引起生殖毒性损伤[38]。因此在提取悬浮细胞内代谢产物时，必须洗净悬浮细胞上的液体培养基。在筛选植物生长物质的使用浓度时，可进行正交试验，这样在降低试验成本的同时可研究各激素之间的协同或拮抗作用。
诱导子可以促使植物抗毒素信号形成，将诱导子应用于植物细胞培养可提高目标代谢产物的含量，是国内外研究的热点之一。诱导子主要分为生物诱导子和非生物诱导子。常见的非生物诱导子[39-45]有茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)、水杨酸(Salicylic acid，SA)、重金属盐、稀土元素等，目前国内外对MeJA和SA的研究比较多。段永波等研究发现蜀葵的悬浮细胞内总黄酮的含量随MeJA使用浓度的增加呈先增加后减少的趋势。MeJA和SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中的累积，150 μmol/L的MeJA和50 μmol/L的SA分别处理可以使半夏生物碱含量为对照组的3.6倍和2.5倍。适当浓度的金属离子可激活一些次生代谢过程中相关酶的活性，增加植物次生代谢产物的积累。范寰等人在培养长春花的悬浮细胞时，发现加入低浓度的Ce4+可增加细胞H2O2的产生和长春质碱的合成，此作用可能是通过激活长春花中的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)途径来实现的。生物诱导子包括真菌、细菌、病毒等，目前对植物内生真菌的研究较多。内生真菌可能是道地药材形成的原因之一，内生真菌可能通过参与细胞代谢途径调节悬浮细胞的生长。在对宜宾当地油樟悬浮细胞的研究发现，其内生真菌可通过影响H2O2通路来调节挥发油的代谢，在添加40 mg/L内生真菌后，悬浮细胞中挥发油的含量约为对照组的2.0倍。
前体物质[46-48]是合成次生代谢产物的前提条件，在植物懸浮细胞培养过程中加入不同种类、浓度的前体物质，会对目标次生代谢产物的合成产生不同的影响。紫杉醇合成的前体物质苯丙氨酸、苯甲酸钠及乙酸钠对红豆杉悬浮细胞的紫杉醇产量有显著影响。当在培养基中分别加入15 mg/L苯丙氨酸及30 mg/L苯甲酸钠时，红豆杉悬浮细胞中的紫杉醇产量分别提高了21.76%和26.14%。
2.2 外部条件的控制
制备生长状态良好的悬浮细胞，选择最适培养基是进行悬浮细胞培养的重要准备工作，而控制合适的外部条件也是悬浮细胞长期生长和次生代谢产物积累的必要条件。外部条件主要包括培养液的pH值和溶氧水平、温度及光照条件。
一般药用植物细胞生长最适pH值范围为5.8～6.0。培养基的pH值对悬浮细胞的影响很大，过酸或过碱的环境都会加剧悬浮细胞的褐化甚至引起悬浮细胞死亡，因此在配制悬浮细胞的培养液时应调节其酸碱度，使其适合悬浮细胞生长。剑麻及南方红豆杉[49-50]悬浮细胞在pH值为5.8时长势最好。也有一些细胞的最适pH值偏大，Malik等[51]研究发现，适合紫草细胞生长及紫草宁衍生物形成的pH值为7.25～9.50。除了pH值之外，培养液的溶氧量也影响悬浮细胞的生长。在培养悬浮细胞时，通常通过改变摇床转速和培养液体积调节溶氧量。液体培养基的溶氧量和细胞分散度与转速呈正相关，最适的转速在100～150 r/min范围内。徐薯[52-53]的悬浮细胞对转速敏感，当摇床转速为100 r/min时，徐薯悬浮细胞的生长速度最快。适宜的装液量有利于在离心力的作用下使悬浮细胞分散，从而促进细胞生长，能够为悬浮细胞提供足够的生长空间和溶氧量。程玉鹏等[54]在建立柴胡悬浮细胞的培养体系时发现，固定接种量(2 g)和培养瓶容积(250 mL)，将培养基体积从50 mL逐步增加至100 mL时，细胞增重量明显增加，若持续增加培养基体积，细胞增重量则明显下降;当固定转速，愈伤组织接种量在2.0 g，培养液体积占容器的2/5时，细胞鲜重增至最大。
培养植物悬浮细胞时，次级代谢产物合成的最佳温度为20～28 ℃。当培养温度与植物细胞正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应，或对次级代谢产物积累产生激活作用。不同植物对温度的需求不同，部分植物悬浮细胞生长所需的最佳温度和悬浮细胞代谢所需的最佳温度不同，是因为温度对植物细胞生物合成途径中相关基因表达和调节物质有影响。对葡萄悬浮细胞[55]的研究表明，在38 ℃时，葡萄悬浮细胞中褪黑素生物合成的相关基因色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC)，血清素N-乙酰基转移酶(Serotonin N-acetyltransferase，SNAT)和N-乙酰基-5-羟基色胺-甲基转移酶(N-acetyl-5-hydroxytryptamine-methyl transferase，ASMT)的表达量有明显上调。牛晓娟等[56]研究不同温度对石斛悬浮细胞的影响，发现在31 ℃条件下培养的石斛悬浮细胞的增殖系数最小;而当温度为25 ℃时，随着培养天数的增加，石斛悬浮细胞的增殖系数增大。除温度外，药用植物细胞在悬浮培养时可通过调节光照时间[57]的长短、光质和光的强度来增加次生代谢产物的积累。在光照时间12 h/d、光照1 200 lx时，仙茅悬浮细胞干重和仙茅苷含量均处于较高水平，分别是黑暗组的1.85倍和2.18倍。光照对悬浮细胞的影响可能与光信号转录因子引起的基因调控有关。李汉生等[58]的研究发现，蓝光照射培养的龙眼悬浮细胞比黑暗培养的龙眼悬浮细胞生长及代谢更加旺盛，蓝光照射组干重比黑暗组多0.28 g/L，比类黄酮含量多0.77 mg/g。光照对悬浮细胞的影响也可能与植物本身的习性有关，因此在进行相关研究时可与原植物对光照的需求进行对比，以得到最适合悬浮细胞生长的光照条件。
3 大规模生产悬浮细胞
为实现植物细胞大规模培养、进行次生代谢产物工业化生产，需选用合适的生物反应器，以便于控制物理和化学条件。目前常用的生物反应器类型及其性能对比如表3所示[59-61]。工业大规模生产在选用生物反应器的类型时，需综合考虑剪切力、混合能力及溶氧能力，剪切力过大会导致细胞褐化甚至死亡;混合能力不足则营养物质不能均匀分布、悬浮细胞分散性差;溶氧能力差则细胞不能与氧气充分接触，细胞生长受限。
4 讨论与展望
植物离体培养技术除细胞悬浮培养外还有愈伤组织培养、不定芽、毛状根培养等。相较于愈伤组织，悬浮细胞培养使细胞能够与培养基充分接触，避免有毒物质在局部大量聚集而影响细胞生长，同时摇培使空气进入培养基，使细胞更容易生长。与不定芽、毛状根的培养相比，悬浮细胞的制备则更加简便。以快速、大量获取植物活性成分为目的时，悬浮细胞培养技术有较大的优势。目前这项技术为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
悬浮细胞培养存在比较大的问题是褐化反应，褐化反应使细胞破损，次生代谢产物减少，主要发生在悬浮培养初期。王佳琦等的研究显示，甘草细胞的褐化主要由酶促反应引起，其主要机理是植物细胞从固体培养基转移到液体培养基产生机械损伤，使细胞内多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性增加，细胞内外酚类化合物含量增多，发生氧化反应生成棕色醌类化合物。褐化过程主要受培养体系转速及渗透压影响，细胞褐化的程度与转速正相关，当培养基中不含蔗糖时，细胞不发生褐化反应，但生长缓慢，因此在大规模生产时，可考虑梯度增加蔗糖的浓度和转速，以避免培养初期的褐化。工业大规模培养时也可适当添加防褐化剂，避免褐化反应。
工业化培养悬浮细胞时还可以用两步培养法：将悬浮细胞的培养分为两个阶段，第一阶段初期在适合细胞生长的培养基中培养悬浮细胞避免褐化反应，第二阶段将对数生长末期的悬浮细胞转移至能够促进次生代谢产物生成的培养基中生长，这样能够有效提高悬浮细胞的次生代谢产物含量[62-63]。
目前建立悬浮细胞培养体系的技术已经非常成熟，对悬浮细胞的研究可将重点放在以下3个方面。
(1)工业化生产方面，优化培养体系，提高次生代谢产物合成量，为工业化生产奠定基础，以此缓解药用植物资源紧缺的问题。
(2)代谢途径研究方面，以悬浮細胞为基础研究材料，构建转基因悬浮细胞系，再经诱导转化成植株，研究植物细胞代谢途径上相关关键酶基因和转录因子的功能。
(3)优选作物和资源保护方面，悬浮细胞可通过激素诱导培养成人工种子，进行转基因植物的研究，筛选出具有抗干旱、抗盐、可大量繁殖的植物品种，濒危植物也可以通过建立其悬浮细胞培养体系进行品种保存。
总而言之，悬浮细胞培养技术在药用植物生产研究中的应用，一方面可以缓解目前药材资源紧张的情况，另一方面也为药用植物的代谢途径研究提供了基础，最重要的是，利用悬浮细胞技术进行组织培养有利于作物优选和资源保护。
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作者：胡珊群 梁汝黛 李彤 王晨 刘长利
开放课题申报指南
(2018)
一、总则
植物细胞与染色体工程国家重点实验室(以下简称实验室)作为我国农业生物学领域的一个应用基础研究实验室，面对国家需求，致力于为我国农业科技发展做出应有的贡献。实验室在李振声院士提出的“少投入、多产出，护环境，可持续发展”的总体研究思路的指导下，面向国家粮食安全和农业可持续发展的重大战略需求，瞄准植物科学国际前沿，聚焦小麦、水稻、大豆、玉米等主要农作物遗传育种的重大关键科学问题，开展基础与应用基础研究。尊照国家重点实验室“开放、流动、联合、竞争”的原则，特设置开放课题基金。开放课题的设定和管理规定遵照《国家重点实验室建设与运行管理办法》(国科发基【2008】539号)、《国家重点实验室专项经费管理办法》(财教【2008】531号)文件精神制定。
开放课题基金面向国内外从事基础理论研究和应用基础研究的大学、研究所等单位。凡具备申请条件的研究人员均可提出申请。申请应符合实验室当年发布的课题申请指南，依照“公平竞争、择优支持”的原则，经过同行专家评审后确定。
二、资助范围
围绕植物细胞与染色体工程国家重点实验研究方向的领域，以小麦、水稻、大豆、玉米等作物为主要研究对象的研究，包括以下几个研究方向：
1. 作物基因组学研究 2. 植物养分及光能高效利用 3. 植物抗病分子机制 4. 株型与光合产物的有效分配
5. 作物的品质性状形成的分子机制及改良 6. 染色体工程及作物品种的分子设计
开放课题应与实验室目前从事的研究项目相结合。并与实验室现有课题组形成合作研究。开放课题基金优先资助学术思想新颖，立论根据充分，研究目标明确、研究内容具体的项目。
三、申请条件
凡申请者请首先确定与植物细胞与染色体工程国家重点实验室的研究组合作，联合提出申请报告，并须具备下列条件：
1. 需在与重点实验室研究组建立合作关系的基础上提出申请; 2. 在所申请的相关领域有相当的理论和技术积累; 3. 具有副高级(含副高级)以上专业技术职称; 4. 研究内容必须符合开放课题基金的资助范围; 5. 应得到所在单位或部门的同意;
6. 按时提交申请，手续完备，所需资料齐全。
四、申报程序
申请开放课题基金必须按规定的格式实事求是地填写(植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题基金申请书)。
申请者所在单位应签署意见，单位领导在申请书上签字并加盖单位公章，向植物细胞与染色体工程国家重点实验室报送《申请书》一式2份，同时须提交电子版(PDF文件)申请书至：brzhang@genetics.ac.cn(邮件需抄送合作研究组组长)
开放课题基金的受理申请时间为3月15日—4月15日(以邮戳或者email发件日期为准)。
五、审批程序
开放课题基金的评审按同行专家评阅决定的程序进行。
植物细胞与染色体工程国家重点实验室负责开放课题基金的申请受理工作。
六、课题及成果管理
开放课题资助年限一般为2年。
重点实验室对每项开放课题根据申请者要求，确定一位实验室的课题组长作为该项开放课题的项目合作者，并负责开放课题基金的实施管理。管理内容包括：
1.在课题研究过程中，如研究计划有较大变动，须经重点实验室审批。 2.经费管理
(1)每项课题经费将直接下达到重点实验室内部申请者的合作研究组，不外拨。
(2)开放基金是重点实验室为开放课题投入的专项经费，必须专款专用。 (3)开放课题经费使用范围：主要用于课题研究所需要的材料费、分析测试费、仪器设备租用费等;国内外学术会议和国内外刊物的论文发表费以及客座研究人员来重点实验室工作的津贴、补助、交通费和住宿费。
(4)课题结束后，课题研究人员应及时作出经费使用决算。 3.课题监督
实验室主任和实验室学术委员会主任负责监督和检查课题进展及执行情况，发现问题时，有权调整或中止项目及资助。
4.课题验收
课题结束后2个月内，申请人员应认真填写《课题总结报告》。报告内容应包括工作总结、课题完成情况、成果目录和论文目录等。报告经项目合作者审查签署意见后，交由重点实验室验收。逾期不按要求提交总结报告者，取消其今后申请植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题基金的资格，并通报其工作单位。
课题实施结束后完成既定要求，达到预定目标的，若需继续深入研究，可向本重点实验室提出申请，并其研究课题确有重大研究价值需继续追加资金的，报学术委员会同意后方可追加资金予以支持。
5.成果说明
申请人员在开放课题基金资助下取得的成果(包括专利、学术论文的知识产权等)，归研究者个人与植物细胞与染色体工程国家重点实验室共享。开放课题研究成果发表论文时，按研究者实际工作量确定署名顺序，并必须在论文中注明受中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室开放课题项目基金资助。
七、经费下拨
每项开放课题总经费为10万元人民币。
项目经费下拨时间为课题被批准后的1个月内一次拨付。
注：上述规定最终解释权归中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室所有。
……………………………………………………………………………………………………… 通讯地址：北京市朝阳区北辰西路1号院2号，100101
中国科学院遗传与发育生物学研究所
植物细胞与染色体工程国家重点实验室
联 系 人： 张佰茹(010-64806537，brzhang@genetics.ac.cn)
一、教学目标
1、细胞的全能性(理解)
2、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。(知道)
二、教学重点和难点 1.教学重点
(1) 植物组织培养的原理和过程。 (2) 植物体细胞杂交的原理。 2.教学难点 植物体细胞杂交
三、教学过程 导入：
我们已经所学及疑问
1、有性生殖中，受精卵经分裂、分化形成各种组织、器官，最后形成个体。 三倍体如何繁殖后代?
2、细胞的全能性
体细胞具有全能性的原因是什么?
各种细胞表达全能性的能力是否一样?
在生物体内，体细胞有没有表达全能性，为什么? 体细胞在什么条件下才会表达全能性?
(一)植物组织培养
1、概念
2、植物组织培养的过程。(如下)
脱分化 再分化
外植体 → 愈伤组织 → 根、芽 →植物体
3、条件
4、证明：
(二)植物体细胞杂交
1、 过程 植物细胞A 植物细胞B ↓ 去壁
↓
原生质体 A 原生质体B
↓
↓
原生质体融合
↓ 再生细胞壁
杂种细胞
2、优点： 克服远源杂交不亲和障碍，培育作物新品种。 ↓ 细胞分裂
愈伤组织
↓细胞分化
杂种植株
绪论
1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水
平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。动物细胞工程包括细胞培养技术(包括组织培养、器官培养)，细胞融合技术，胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等)，克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆)。植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。
2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操 作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称… 植物细胞工程的应用：
1， 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 2， 利用培养变异，筛选优良的突变体。 3， 倍性育种，缩短育种年限。
4, 离体种质保存。 5,
细胞培养生产有用的物质。 第二章
一， 实验室设置及内部设备
实验室建设应考虑的问题：
1、实验的性质
2、实验室的规模
细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 贮藏室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 温室
1、准备室
完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、 配制、培养基分装及高压灭菌;器皿、材料的洗涤等工作。
主要设备
纯水器 工作台 药品厨 天平 电磁炉 冰箱 玻璃器皿 酸度计 高压灭菌锅 干燥箱等
2、无菌操作室 (接种室)
用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。
接种室主要设备
超净工作台 ：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。
无菌操作用具： 离心机 细胞融合仪
3、培养室
用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。 控制：温度、光照、湿度。
培养室主要设备：培养架 空调 时控器 自动开灯、关灯温度自动记录仪 摇床 二 ，培养基
1，培养基的种类
1 培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下： (1) MS培养基：富盐平衡培养基(还有LS、BL、ER)
特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液;②微量元素种类齐全; ③营养丰富 。
(2)B5培养基 ：高硝态氮培养基(还有N6和SH培养基)
特点: ①硝酸钾含量高; ②氨态氮含量低; ③ VB1含量较高。 (3)N6培养基：高硝态氮培养基
特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。
(4)White培养基：低盐培养基(还有WS、HE、改良Nitsch等 特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。 (5)KM-8P培养基：
特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 培养基成分：水 无机盐 有机成分 植物激素 培养物支持材料 辅助性物质 2，植物激素的应用规律
①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。容易产生多倍体细胞(核分裂和胞壁形成不同步所至)， cks有利于胞壁形成。
②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用) ③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。 Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。
高 有利根分化，抑制芽形成; Aux / CKs 适中 促进愈伤组织生长;
低 有利芽分化，抑制根形成;
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：
1、确定配方
2、移母液
3、定容
4、称蔗糖
5、调PH值(用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8)
6、培养基熬制(加琼脂)
7、分装(100ml的三角瓶约装入30-40ml, 30瓶/L)
8、扎口
9、灭菌
10、接种 三，植物材料灭菌
灭菌方法 ①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌
②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 电热石英砂灭菌器 ④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌
⑤.接种室灭菌 ：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。 ⑥.培养室灭菌 : 新建培养室用前要彻底熏蒸1次。
隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
⑦.物体表面灭菌: 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手 消毒剂：70%酒精;1-2%来苏水;1%新洁尔灭等。
⑧.接种材料消毒: A, 取材 营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等
生殖器官：胚胎(胚、胚珠、胚乳等)和花药 等
外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 外植体灭菌
用化学灭菌剂灭菌
2 消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。 ③无菌水冲洗3-5次。注：灭菌液要浸没材料 第三章 植物细胞全能性与形态发生
一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。
细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。
愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。多在外植体切面上产生。
愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。
植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。
生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应
(细胞)或(组织)与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。 在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。
静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。
细胞脱分化的三个阶段 ：1，启动阶段 细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。 2，演变阶段 细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。
细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。
极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志(即细胞分化的标志)。 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。 植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：
①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽 ③根芽同长 植物细胞经再分化形成植株有2条途径：(在离体培养条件下)器官发生 体细胞胚胎发生 体细胞胚(胚状体、体胚)：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
胚状体有以下几方面的界定：
①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚;②体 3 细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚;③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。
经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段： ①诱导外植体形成愈伤组织;②诱导愈伤组织胚性化 ，③体细胞胚形成。 体细胞胚的结构与发育特点
1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征： ①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的;
②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。
③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。 人工种子：(狭义)植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
(广义)在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。 第四章 离体培养下的遗传与变异
离体培养中的遗传与变异特点：
1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中; 变异发生在各种植物的培养中;变异发生与培养类型有关。
2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。
3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。 体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。 第五章植物主要的组织培养技术 第一节快繁
无性繁殖途径：
1、无融合生殖：即不经过减数分裂和受精而形成种子。
2、营养繁殖：即由母株的营养体部分再生出新的植株 植物离体快速无性繁殖：利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法，这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系
初代培养 ：芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。即接种某种外植体后，最初的几代培养。
生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程 植物快繁常见问题及对策：
(一)污染的原因及预防：原因：细菌、真菌为病源菌;污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。 预防措施：(1)防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体;春秋组培;材料预培养。(2)严格外植体灭菌(3)接种用具灭菌彻底(4)严守无菌操作规程(5)保持培养室清洁
(二)褐变的原因及预防原因(1)植物品种(基因型)(2)生理状态(3)培养条件(4)材料转接季节 防止措施(1)选择适宜的外植体(2)连续转接3)先液体培养再固体培养(4)加抗氧化剂(5)选择合适的培养条件加活性炭或 暗处培养。
(三)玻璃化的原因及预防原因：
(1)激素浓度(尤其CTK)高(2)琼脂浓度低(3)光照弱(4)温度高(5)通风条件不好(6)培养基离子种类及比例不适宜 预防措施：(1)适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。(2)适当降低CTK的浓度。考虑加入适当的脱落酸。(3)增加自然光照;增加容器通气，控制温度。(4)加入活性炭、多效唑或CCC等物质。 第二节、植物脱毒快繁技术 1热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。
2、热处理脱毒方法：(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内(35-40℃)处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统;二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。
2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。
3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。
4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。
第三节 花药和花粉的培养
花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。(器官培养) 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。(细胞培养)
单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。
单倍体植物3个明显特点：
1、体细胞染色体数减半
2、生长发育弱，体形小
3、雌雄配子严重不育
花药、花粉培养的意义
1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限
2、获得育种中间材料
3、突变体选育
4、体细胞融合
5、遗传研究
6、获得染色体异附加系和代换系
7、遗传工程受体 花粉植株再生途径：
1、经由成愈伤组织再生植株
2、经由胚状体再生植株 花粉分离收集：
由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1)花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2)人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。
5 3)机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。
释放的花粉粒→ 尼龙网(孔径20—60um)过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。
花药培养过程中花药为什么要经过低温处理 低温处理的作用机理：
1)预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子(花粉粒)第一次有丝分裂的轴向发育(正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒)，进而形成愈伤组织或胚状体。 2)提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。
3)引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度激素?
蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。
激素 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。 第四节 胚胎培养
胚胎培养类型 胚培养 胚乳培养 子房培养 胚珠培养
胚培养概念：无菌条件下，把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在培养基上进一步生长发育形成幼苗的过程。
成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育
成熟胚培养意义：克服发芽障碍;打破种子休眠，缩短育种周期等。 幼胚培养：胚龄处于原胚期、球形胚、心形期、早鱼雷期的培养。
幼胚培养意义：
1、克服远缘杂交不育
2、克服珠心胚干扰，提高育种效率
3、幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。
4、为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种?各有何特点?
① 胚性发育：幼胚的离体培养，仍按在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株
② 早熟萌发：离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
③愈伤组织：在许多情况下，幼胚的离体培养首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 胚乳按发育初期是否形成细胞壁分为①核型胚乳②细胞型胚乳③沼生目型胚乳 试管受精：培养未受精的胚珠或子房并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。 未授粉胚珠子房培养与授粉后胚珠子房培养有何不同?
根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。(1)未受精的胚珠的培养,目的是为试管受精提供雌配子体。(2)受精后胚珠的培养,胚珠内胚的发育处于早期阶段,从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。
6 第六章 植物细胞培养及次生产物代谢生产
植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其 增殖的技术. 培养方法：培养规模:小规模培养 大批量培养
培养方式:悬浮培养 平板培养 看护培养 产物不同:诱变培养 次生产物培养
培养方式：悬浮培养、单细胞培养、植物细胞的规模化培养及有用物质生产
悬浮培养(cell suspension culture)悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。
悬浮细胞培养的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。(植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。)
细胞同步化的方法：①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。
单细胞培养
1、平板培养
2、看护培养
3、微室培养
4、双层滤纸培养 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
植物细胞大规模培养的技术要求：从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。
2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。
3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 固定化培养系统--固定化培养技术的优点在于：
1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节;
2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成;
3、由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用;
4、正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。
7 利用细胞培养生产有用物质的一般程序
1、选材 应注意条件：①药效肯定②对其有效成分有充分的了解④市场短缺或价格昂贵;③有测定有效成分和药理的可靠方法⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。
2、细胞株系建立
3、大量培养
4、产品提取与纯化 第七章 原生质体培养与融合 原生质体(Protoplast)：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体(cytoplast)：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
原生质体材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度;降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。 原生质体纯化方法有：
离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。
接口法 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。 原生质体培养方法
1、固体包埋培养(原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖(37C左右)混合，培养于培养皿中。)
2、固体平板培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点: 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
3、液体浅层培养(将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。) 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
4、固、液培养 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
5、共培养法(将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合)
6、琼脂糖珠培养
7、饲养层培养
原生质体再生：再生细胞壁、细胞分裂和生长、植株再生(愈伤组织形成)
原生质体融合又称体细胞杂交是指将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 融合方法
1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合 8 在一起 不足：诱导频率不高。
2、高pH-高Ca离子法 优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用
3、PEG法 特点：融合频率高、可重复性强、诱发融合无特异性、毒性较低
4、电融合法 特点 不存在对细胞毒害的问题、融合效率高、融合技术操作简便 原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近; 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合;3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞质融合;
细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。 第九章后
1, 超低温通常是指-80℃以下的低温。常用的保存介质或容器有：超低温冰箱(-80～-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。
2, 用于离体超低温保存的植物材料一般有愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等。 3, 细胞内外水的冻结状态时细胞冻存技术的关键。
4, 种质超低温保存的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。在降温过程中必须使细胞发生适当程度的保护性脱水，使细胞内外的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程中防止细胞内次生结冰。因此针对不同种类的植物材料，筛选合适的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。
5, 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价及植株再生等几个步骤。
6, 降温方法从降温方式来看，有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法等。 7, 玻璃化：是指液体转变为非晶体的固化过程。使溶液玻璃化得两条途径：大幅度提高冷却速率和增加溶液的浓度。
8, 玻璃化溶液(PVS1),其中包含了20.5%的DMSO、15.5%的乙酰胺、10%的1,2-丙二醇以及6%的聚乙二醇，他们分别起到冰冻保护、毒性中和、强化玻璃化和非渗透聚合的作用。 9, 超低温保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、预培养法、预培养-干燥法和包埋脱水法。
10, 包埋脱水法的三个步骤：先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度(或梯度浓度)蔗糖的培养基上预培养，最后侵入液氮。
11, 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。
12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。 13, 冰冻保护剂具有的特点：易溶于水、对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在：增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高容液的粘滞性，阻止冰晶生长。
教学目标分析(结合课程标准说明本节课学习完成后所要达到的具体目标)：
1、知识目标
(1)掌握作物脱毒、人工种子的制备过程和意义 (2)了解单倍体育种和突变体的利用 (3)了解细胞产物的例子
2、能力目标
搜集有关细胞工程研究进展和应用方面的资料，进行整理、分析和交流。
3、情感目标
(1)认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系 (2)关注细胞工程研究的发展和应用前景。
学习者特征分析(结合实际情况，从学生的学习习惯、心理特征、知识结构等方面进行描述)：
本节教材内容对学生来说，第一课时已经学习了植物细胞工程的基本技术知识，这节课学习起来有一定的基础。教师可以采用学案导学、让学生理解记忆为主结合讨论的方法。但是，本节内容都是前沿科技，学生难以亲身体会，教师可以用多媒体相关图片等资料，增强学生的感性认识。
教学方法设计(结合教学重点与难点和学生情况描述所选择的具体方法)：
本节教学重点是知道植物繁殖的新途径及细胞产物的工业化发展，这部分内容通过学生自学基本能够掌握;教学难点是作物新品种的培育，这部分内容与必修二的知识联系较紧密，需要教师引领学生回忆单倍体的概念、特点等相关知识，还可以通过多媒体展示单倍体育种与杂交育种的图解，比较各自的优缺点，使抽象的知识清晰、明了。
教学过程(按照教学步骤和相应的活动序列进行描述，要注意说明各教学活动中所需的具体资源及环境)：
【旧知复习、导入新课】
1、回忆植物组织培养技术的基本原理和过程
2、思考利用这项技术能做哪些工作。 [学生]思考回答问题。
[设计意图]对前面的已学知识进行复习巩固，为后面的知识做铺垫。 【教学内容】
一、植物繁殖的新途径
[教师]课件展示以下问题，指导学生根据问题阅读课本，找到问题的答案。
1、微型繁殖技术的概念是什么?
2、微型繁殖的原理是什么?
3、微型繁殖的优点是什么?
4、作物脱毒的原因、材料、方法、结果、优点分别是什么?
5、人工种子的概念、结构?
6、培育人工种子的技术、原理?
7、人工种子有哪些优点?
[学生]阅读教材，解决问题并回答问题：
1、概念：应用植物组织培养技术，快速繁殖优良品种植物(也叫快速繁殖技术)。
2、原理：植物细胞的全能性
3、优点：①繁殖速度快;②保持优良品种的遗传特性(因为是无性繁殖)
4、原因：长期进行无性繁殖的作物，易积累感染病毒，导致产量降低，品质变差。
材料：分生区(如茎尖)的细胞
方法：植物组织培养
结果：获得脱毒苗
优点：提高作物的产量和品质
5、概念：以植物组培技术得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。
结构：人工种皮+胚状体(或不定芽、顶芽、腋芽)
6、技术：植物组织培养
原理：植物细胞的全能性
7、优点：①后代无性状分离，保留优良特性;
②不受气候,季节和地域限制;
③贮藏、运输方便。 [设计意图]教师指导学生自己对以上知识点进行概括和梳理，便于知识的理解和掌握，使知识条理化，便于复习和记忆。
二 、作物新品种的培育 [师生活动] [教师]引导学生复习旧知识
传统方法——杂交育种依据的原理是什么?优点和缺点分别是什么? [学生]思考回答问题。 原理：基因重组。
优点：优良的基因通过基因重组，把两亲本的优良性状组合在同一后代中。 缺点：要不断进行(多年)纯化和选择，才能得到符合理想要求的新品种。 [教师]进一步追问：用什么方法可以弥补杂交育种的缺点呢? [学生]思考回答问题。 单倍体育种
[教师]引导学生复习旧知识
1、单倍体定义?
2、单倍体是如何形成的?
3、单倍体植株的特点? [学生]思考回答问题。
1、体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。
2、由配子不经过受精作用而直接发育成的个体。例：蜜蜂中的雄蜂。
3、植株弱小，而且高度不育。 [设计意图] 联系旧知识，使学生认识到新技术的必要性，引发学习兴趣。
[教师]课件展示以下问题，指导学生根据问题阅读课本，找到问题的答案。
1、单倍体育种的方法、技术、原理和优点分别是什么?
2、突变体是如何产生的?其依据的遗传学原理是? [学生]阅读教材，解决问题并回答问题：
1、方法：花药离体培养获得单倍体植株，再用秋水仙素处理使染色体数目加倍。 技术：植物组织培养
原理：染色体变异
优点：明显缩短了育种年限
2、产生：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断地分生状态，易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变。
遗传学原理：基因突变
[设计意图]教师指导学生自己对以上知识点进行概括和梳理，便于知识的理解和掌握，使知识条理化，便于复习和记忆。
三、细胞产物的工业化发展 [师生活动] [教师]引导学生完成以下问题：
1、细胞产物种类有哪些?
2、细胞产物运用的技术是什么? [学生]阅读教材，解决问题并回答问题：
1、种类：蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。
2、技术：植物的组织培养—愈伤组织培养
[设计意图]培养学生阅读、观察和分析问题的能力。
【课堂小结】
[师生互动]引导学生一起总结本节知识，构建知识网络。 [设计意图]形成知识结构，使知识系统化、结构化。
【巩固练习】课件展示当堂练习，规定时间让学生完成。
[设计意图]对所学知识及时巩固。
板书设计
植物细胞工程的实际应用
一、植物繁殖的新途径
1、微型繁殖
2、作物脱毒
3、神奇的人工种子
二、作物新品种的培育
1、单倍体育种
2、突变体的利用
三、细胞产物的工业化发展
技术应用(说明在教学中使用了哪些相关的软硬件)： 多媒体与黑板有机结合
资源应用(说明在教学中资源应用的思路、制作或搜集方法)：
1、通过百度文库整理制作预习学案，学生课前预习。
2、通过百度搜索、百度文库下载相关资料，并结合教参制作课件，以展示问题、图片、知识网络和当堂检测题。 资料引用(说明所引用资料来源出处)：
百度搜索、百度文库、人教版高中生物《现代生物科技专题》教参
评价方法或工具(说明在教学过程中将用到哪些评价工具，如何评价以及目的是什么)：
1、个人评价: 对积极发言的同学给与鼓励性评价，如果学生能正确回答问题，教师应及时给与表扬，若回答欠准确或思路不对，教师也不能批评或指责学生，而应该作出提示，引导学生得出正确答案，以免打消学生的积极性。这样通过课堂观察，教师便能及时了解学生的情况，从而作出积极反馈，正确的给予鼓励和强化，错误的给予指导与矫正，使他们不断品尝成功的喜悦，多鼓励，尤其是对中下学生，以促成其良性循环。
2、小组评价：以学习小组为单位进行，评价标准如下：
优：组内成员人人积极思考，踊跃参与讨论，互相学习与纠错，共同顺利完成本节课的学习任务。
良：组内成员大部分积极参与，较好地完成了本节课的学习任务。
差：组内成员没有合作意识，没有讨论、交流与互评等活动。
通过小组评价，可以增强学生的合作意识，从而增进合作交流技巧，使学生群体的智慧和思维可以共享，相互解释所学知识、能够相互帮助理解和完成作业，取得最佳的学习效果。 教学反思(对整堂课进行总结评价、分析)：
“问题启发式”教学的效果还是很好的，它符合新课程改革的要求，充分体现了学生的主体作用，调动了学生的思维和积极性，学生在积极思考的同时，能够相互讨论，积极发言，同学们在相互借鉴的同时也很好的提升了自己的知识水平，同时这种“问题启发式”教学对培养学生的能力是很有帮助的。
由于时间有限，只有少数的学生发表自己的观点，需要在后面的学习中利用其它形式检验学生的理解情况。
1 教学分析和设计思路
1.1 教材分析
“植物细胞工程的实际应用”是人民教育出版社2011年版《选修3?现代生物科技专题》中的一节内容。“植物细胞工程的基本技术”是学习本节内容的基础，主要包括植物繁殖的新途径(微型繁殖、作物脱毒和人工种子)、作物新品种的培育(单倍体育种和突变体的利用)以及细胞产物的工厂化生产等三方面的内容。在STSE(科学?技术?社会?环境)教育方面，教材以“资料分析”的形式介绍了我国红豆杉惨遭浩劫的例子，引导学生讨论植物细胞工程技术在资源节约、环境保护方面的重要意义。因此，本节课的教学设计应重视渗透STSE教育。
1.2 学情分析
“植物细胞工程的实际应用”作为《选修3?现代生物科技专题》中的一节，学生已具有相应必修内容的学习基础：在《必修1?分子与细胞》中，学生学习了“细胞的分裂和分化”“细胞的全能性”等内容，这些内容能帮助学生进一步加深对植物细胞工程应用的原理的理解;在《必修2?遗传与进化》中，学生学习了“基因突变和诱变育种”“单倍体育种”等内容，这些内容能够帮助学生理解植物细胞工程在育种方面的应用;在《必修3?稳态与环境》中，学生学习了“生态系统”“生物多样性的保护”等内容，这些内容能够帮助学生认识到保护红豆杉的意义和重要性，为学生的学习迁移打下基础。但是，本节课内容涉及较多的基础知识，具有一定的综合性和复杂性。因此，教师可以通过思维导图的方式，引导整理知识脉络、建构知识体系。
1.3 设计思路
基于对教材和学情的分析，本节课的教学思路设计为两条主线。第一条主线为情境主线，以此渗透STSE教育。通过这条主线，本节课将创设“拯救红豆杉”这一问题情景，并围绕这一问题情境，展开教学活动。第二条主线为思维主线，通过活动训练学生的思维，帮助学生梳理新旧知识的关系，构建符合自身认知心理的知识框架，并能运用发散思维应用新知识。这条主线主要包括思维导图和头脑风暴2个课堂活动。
2 教学目标
2.1 知识目标
通过绘制思维导图，列举植物细胞工程的应用。
2.2 能力目标
通过开展头脑风暴活动，进行发散性思维训练。
2.3 情感、态度与价值观目标
以紫杉醇的开发为例，关注植物细胞工程研究的发展和应用前景。
3 教学过程
3.1 创设情境，激发兴趣
教师通过展示红豆杉的图片，向学生介绍红豆杉。请学生阅读教材的“资料分析”栏目资料，了解红豆杉的现状。在此基础上，教师进一步补充相关资料：①因为红豆杉的树皮有抗癌物质――紫杉醇，所以有许多人进入林中来剥树皮，使得红豆杉的数量急剧下降;② 1994年，红豆杉被中国定为一级珍稀濒危保护植物;③紫杉醇是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的最好药物之一，同时对肺癌、食道癌也有显着疗效，是这些病人的希望;④许多人之所以会做出剥红豆杉树皮的违法行为，贫困是主要原因之一。
师生共同通过“资料分析”栏目资料及相关补充资料，梳理以“红豆杉和紫杉醇”所面临的困境，并讨论：如何处理好红豆杉的生态效益、经济价值和社会需求三者之间的关系?能不能通过植物细胞工程技术来解决问题?这样引导学生进一步了解植物组织培养技术的实际应用。
3.2 思维导图，探索新知
理论是指导实践应用的基础。因此，师生共同回顾植物组织培养技术的流程(图1)。
学生以6～7人为一组，在阅读本节教材内容的基础上，通过小组讨论结合所学知识找到新旧知识的连接点，绘制思维导图。在活动之前，教师可以根据需要向学生提供绘制思维导图的指导：离体的植物组织、器官或细胞通过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织经过再分化形成胚状体，胚状体再发育为植株。按照各个阶段，植物组织培养技术的基本产品包括愈伤组织、胚状体和植株。因此，植物组织培养技术的应用本质上就是对这个技术及其基本产物的利用。学生在此基础上，阅读课本内容，分小组讨论植物组织培养技术与课本中出现的这些应用的关系，并以此为主题绘制思维导图。
活动结束后，各个小组通过实物投影仪展示学生的思维导图。最后，师生一起对思维导图进行总结。预设的思维导图如图2所示。
在师生对思维导图进行总结的基础上，教师还应结合书本的实例，对一些细节进行讲解，避免陷入“有框架、无细节”的误区。
(1)从教材中提炼出微型繁殖技术的特点：①繁殖速度快;②“高保真”(因为是无性繁殖);③不受自然生长季节的限制(因为在具有一定人工设施的室内生产)。
(2)介绍长期进行无性繁殖的作物易积累感染的病毒，导致产量降低，品质变差，而植物的分生区一般不会感染病毒，用分生区的细胞进行组织培养，能得到脱毒苗。
(3)天然种子是有性生殖的产物，存在基因重组，可能会造成某些遗传性状的改变，而人工种子则可以完全保持优良品种的遗传特性。天然种子在生产上受季节限制，而人工种子生产上也不受季节的限制。试管苗的大量贮藏和运输也是相当困难的，而人工种子外层是起保护作用的薄膜，类似天然种子的种皮，可以很方便地贮藏和运输。
3.3 头脑风暴，知识应用
学生以6～7人一组，分组围绕“拯救红豆杉”这一主题展开头脑风暴活动。在小组活动中，每人围绕主题说出一项拯救红豆杉的措施，直至结束。由一个小组汇报活动结果，其他小组进行补充，完善方案。
学生可能提出的措施预设：
(1)推广人工种植。可以利用植物组织培养技术生产红豆杉试管苗、人工种子，推广红豆杉的种植。
(2)细胞产物的工厂化生产。研究利用植物细胞培养技术来大量培育红豆杉细胞，利用这种方法来大量生产紫杉醇。
(3)寻找红豆衫的替代物。如红豆杉的非树皮部位提取紫杉醇或寻找产紫杉醇的非红豆杉植物。
(4)化学合成。研究紫杉醇的化学结构，通过化学方法合成紫杉醇。
(5)生物合成。研究红豆杉生物合成途径，用酶工程的手段合成紫杉醇。
(6)基因工程。利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量。
(7)诱变育种。对红豆杉进行诱变育种，以期提高紫杉醇产量。
(8)建立自然保护区。通过建立自然保护区对天然的红豆杉种群进行就地保护。
(9)帮助当地农民脱贫。帮助当地农民通过其他途径脱贫。
(10)法律途径。一方面要加强法制宣传教育，另一方面要加强执法力度。
4 课堂小结，情感升华
通过思维风暴活动，教师要引导学生以小组内活动的形式分享活动心得，进一步探讨科学、技术、社会与环境之间的关系，帮助学生认识到科学技术在社会生产、环境保护和社会发展中的作用，并以此作为本节课的小结。
教师小结预设：我们不仅是社会的一份子，而且还是大自然的一份子。在追求健康、发展经济的同时，应努力找到社会发展与自然和谐的平衡点。科学技术往往能给人们解决问题带来希望。但是，提醒大家的是，科学技术是把“双刃剑”，在科学技术的应用过程中，也可能会带来更多的社会问题、环境问题。例如，癌症患者的数量逐年攀升与工业生产带来的环境恶化密切相关。因此，在利用科学技术生产紫杉醇、拯救红豆杉的过程中，要防止由此可能产生的工业污染。否则，可能得不偿失。
5 教学反思
5.1 重视STSE教育情境的选择
本节课的内容本身属于技术的应用部分，与社会生活也紧密相关。教师通过在课堂中选择“红豆杉”这一环境保护的热点话题，创设情境，使科学、技术、社会、环境四者联系起来。教师对学生的价值观培养，应强调个人价值与社会价值的统
一、科学价值与人文价值的统一。教师通过情境教学，引导学生通过学习、讨论解决情境中的问题，不仅能够调动学生的学习兴趣，还能够让学生更好地理解先进技术的应用价值。
5.2 注重学生思维能力的培养
在本节课中，通过两个课堂活动训练学生的思维能力。发散性思维训练是学生创新能力培养的重要途径。遗憾的是，学生在完成思维导图环节后，大多数小组的思维就被“植物细胞工程的应用”这一知识框架限制住了。只有个别小组能够跳出本节课，想到化学合成、微生物发酵、生物合成等其他方法。显然，发散性思维的培养不是一蹴而就的，教师应通过多种途径增加学生训练的机会。
5.3 关注教学预设与课堂生成
本节课的教学设计作了课堂教学的预设。教学是有目标有计划的活动，预设是教学的基本要求。但是，课堂是充满生机和乐趣的，是在教师与学生、学生与学生互动过程中的生成过程。在教学过程中，学生能积极进行知识探索，同时围绕创设的情景进行讨论，提出各种见解，真正成为课堂的主人。在这个过程中，教师应及时根据课堂生成情况调整教学，使教学回归学生的生活世界，使教学更加充满活力。教师只有关注了教学预设与课堂生成，才能脱离按部就班的桎梏，和学生一道创造人本、个性、开放的高效课堂!
(二)植物组织培养。
问题情境：
1.放映植物组培的录像(发展史、技术过程、应用等)。
2.传看脱毒马铃薯组培苗实验材料。
3.用投影仪打出植物组培过程简图。
丰富、鲜活的感性材料为学生架起了新旧知识联系的桥梁。在学生充分复习、认真预习的基础上，教师引导学生总结出植物组培的过程。
如果到此为止，学生虽抓住了知识的主干，但却错过了深化知识，发展智力等重要环节。所以教师应适时提出启发性问题，引导学生进一步思维探索。例如：
1.植物细胞表现出全能性的必要条件是什么?
2.离体的器官、组织或细胞如果不进行脱分化处理，能否培养成完整植物体?
3.决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么?
4.在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作?
在教师的启发下，学生对问题展开分析、讨论，并给予科学正确的解释。
教师做适度的知识扩展，使学生的思维空间得到自然延伸。例如：
1.影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，而两者不同的浓度配比在再分过程中，分别对诱导根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生;浓度比低时，有利于根的发生。
用心
爱心
专心
6 2.愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根。
3.愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。教材和录像中介绍的均为不定芽方式，而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进而发育成完整植株。
关于植物组培技术的应用，在录像及必修课教材中均有介绍，教师只要对学生容易忽略的问题予以点拨。例如：生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂时进行的是大规模的细胞培养而非组织培养，前者只需培养至愈伤组织即可，后者则需诱导产生完整的植物体。另外，还可以鼓励学生就制造人工种子时，在胚状体和人工种皮之间添加何种胚乳成分展开设计，为学生创造广泛、自由的思维空间，培养学生多方向、多角度、多层次的发散思维能力。
(三)植物体细胞杂交。
问题情境：20世纪60年代，有的科学家提出这样一个设想：让番茄和马铃薯杂交，培育出一种地上结番茄果实，地下结马铃薯块茎的植物。
提出问题：如果要实现这一设想，你认为可以采用哪些方法?
教师鼓励学生自由联想，大胆迁移，使学生在最佳思维状态下进入下一学习环节。
教师明确：植物体细胞杂交是用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新植牧体的方法(强调起止点)。
提出渐进式问题，引导学生进行思维探究，使学生在获取知识的同时，受到科学方法的训练和培养。
1.你认为两个来自不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是什么?
用心
爱心
专心
7 学生一般会想到应该是位于细胞外侧不具生命力的细胞壁。
2.有没有一种温和的去壁方法呢?
据已有的知识积累，学生可联想到酶有专一性，而细胞壁的主要成分是纤维索和果胶，所以用纤维素酶和果胶酶去壁将不会对其内的原生质体造成损伤。
3.如果两个来源不同的原生质体发生了融合，下一部该做何处理?
应该诱导其再生壁，才能成为完善的杂种细胞。
4.如何将杂种细胞培育成杂种植株?
学生可将植物组墙技术迁移运用于此问题的解决。
播放课件：用植物体细胞杂交过程，把以上零散的知识串接起来，使知识条理化、系统化，便于学生的理解和掌握。师生共同归纳植物体细胞杂交的过程。(见“板书设计”)
教师点拨
1.人工诱导原生质体融合有物理法和化学法两大类，物理法是利用离心、振动、电刺激促使原生质体的融合;化学法是用聚乙二醇(PEG)等试剂作为诱导剂诱导融合。
2.在细胞杂交过程中，除了形成AB型融合细胞外，还能形成AA型和BB型两种融合细胞，但只有AB型细胞是植物体细胞杂交所需的杂种细胞。因此，在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。
3.指出植物体细胞杂交过程中已取得的进展和尚未解决的问题，激发学生热爱生物科学的情感和探索生命科学奥秘的兴趣。
用心
爱心
专心 8 总结：在学完三个知识点后，需引导学生清理知识问的脉络(例如：细胞全能性是植物组培的理论基础，而植物组培又是植物体细胞杂交的技术环节之一)，抓住主线，把零散的知识系统化，做到融会贯通。
智能训练：出示“白菜—甘蓝”的投影照片。
设计方案：白菜和甘蓝两种植物之间存在着生殖隔离，不能进行传统的有性杂交。那么，如何才能获得如图这样的“白菜—甘蓝”植株呢?
抓住学生思维的兴奋点，促其联系实际解决问题，不仅巩固强化了所学知识，而且培养了学生运用所学知识分析问题、解决问题的能力，实现知识的正向迁移。 1.植物细胞表现出全能性的必要条件是
A. 给予适宜的营养和外界条件
B. 导入其他植物细胞的基因
C. 脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件 D. 将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞内
1. 将胡萝卜韧皮部细胞培养成幼苗时，下列条件中不需要的是 ( ) A.具有完整细胞核的细胞 B.一定的营养物质和植物激素 C.离体状态 D.导入指定基因
2. 植物体细胞杂交能解决不同种植物之间由于生殖隔离而不能进行有性杂交的问题。植物体细胞杂交过程不涉及 ( ) A.使用限制性内切酶 B.使用纤维素酶和果胶酶
C.诱导两种不同的细胞融合 D.选择有利于杂种细胞分裂和分化的培养基 下列选项中，没有采用植物组织培养技术的一项是( ) A. 花药的离体培养得到单倍体植株
B. 秋水仙素处理萌发的种子或幼苗得到多倍体植株 C. 基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株 D. 细胞工程培育“番茄—马铃薯”杂种植株 植物体细胞杂交尚未解决的问题是( ) A. 去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体 B. 将杂种细胞培育成植株
C. 让杂种植物按照人们的需要表现出亲本的性状 D. 尚未培育出属间杂种植物
用心
爱心
专心 9 3. “白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短和耐储藏等优点。下图是“白菜—甘蓝”的培育过程示意图，他们的基因型分别为aaBB、ccDD，请回答下列问题：
①
白菜细胞
③
④ ⑤
杂种植物幼苗
②
甘蓝细胞
(1)在上述过程中，实现①②过程常用的物质为______________________________。 (2)过程③叫做____________________技术，该过程的诱导方法有物理法和化学法两大类过程。若用化学法，所用化学试剂名称____________________。
(3)过程④是细胞壁的再生过程，与此过程密切相关的细胞器是____________________。
(4)已知白菜细胞中含2M条染色体，甘蓝细胞中含有2N条染色体，则杂种植株体细胞染色体数为____________________。若对白菜和甘蓝采用杂交育种方法能成功的话，得到的后代应含__________条染色体。
(5)通常情况下，白菜和甘蓝有性杂交是不能成功的，原因是____________________。 (6)⑤过程中进行的细胞分裂方式是_______________，该过程先诱导细胞分裂形成_______________，再由它分化形成杂种植物幼苗。
(7)植物体细胞杂交方法的优点是________________________________________。
(1)纤维素酶和果胶酶 (2)原生质体融合 聚乙二醇(PEG) (3)高尔基体
(4)2M+2N M+N (5)存在生殖隔离 (6)有丝分裂 愈伤组织 (7)克服远缘杂交不亲合的障碍，培育作物新品
用心
爱心
专心 10
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