药学结构分析论文提纲

论文题目：灰盖鬼伞几丁质脱乙酰基酶Cda3和几丁质酶ChiE2的研究

摘要：担子菌Coprinopsis cinerea子实体生长发育的过程中,在极短的时间内菌柄迅速伸长生长,细胞壁发生重构。细胞壁重构的过程中既需要足够的刚性又需要足够的可塑性,保证细胞在扩张的过程中仍能维持细胞的形状。因此,研究真菌细胞壁重要成分,几丁质的水解酶,具有重要意义。几丁质水解酶主要包括两大类,断裂糖苷键的几丁质酶和脱去几丁质乙酰基的几丁质脱乙酰基酶。本文分别各研究了一个,初步探索其酶学性质,为研究真菌细胞壁的扩张机制提供基础。本研究利用实验室保存的Cda3真核表达菌株,成功获得了几丁质脱乙酰基酶Cda3。来自C.cinerea的几丁质脱乙酰基酶Cda3可以作用于聚合度（dp）≥2的几丁质寡糖。由于Cda3首先脱去（Glc NAc）4内部的乙酰基,因此这是一个内切几丁质脱乙酰基酶。不同于过去报道的脱乙酰基酶的脱乙酰基模式,Cda3既可以在（Glc NAc）2的还原端,又可以在非还原端脱去一个乙酰基;Cda3可以在（Glc NAc）3的任意位点包括中间和两端,脱去乙酰基;Cda3脱去（Glc NAc）4内部的一个乙酰基后,可以进一步在任意位点,包括（Glc NAc）4的中间、还原端和非还原端脱去乙酰基。3D结构分析显示,Cda3在催化活性位点的-1和+1位点都具有较多的芳香族氨基酸,这可能是Cda3具有如此特殊的脱乙酰基模式的原因。进一步研究其酶学性质,Cda3可以作用于微晶体几丁质类底物,其脱乙酰基活性随着几丁质类底物乙酰度（DA）的降低而增加,并且对C.cinerea菌柄基部细胞壁有较高的活性,菌柄基部细胞壁Glc N/Glc NAc的摩尔比高于菌柄顶部细胞壁。Cda3具有独特的脱乙酰基模式和酶学性质,在C.cinerea子实体成熟过程中有重要的作用,并且可能在利用担子菌菌糠制备壳聚糖,应用于食品、化妆品、药学领域等具有重要的潜在价值。为了获得几丁质酶Chi E2,构建了Chi E2的重组表达菌株,虽然未获得纯的Chi E2蛋白,但是通过液质联用的方法证明了发酵液中确实包含重组蛋白Chi E2。通过简单的盐析沉淀的方法浓缩发酵液中的Chi E2蛋白,检测其底物特异性,发现Chi E2对不溶的几丁质粉末没有水解活性。3D结构分析发现在Chi E2的底物结合沟槽附近有一个凸起结构,可能阻碍不溶性底物与Chi E2的结合。Chi E2在C.cinerea子实体伸长生长过程中不起主要作用。

关键词：灰盖鬼伞;菌柄伸长生长;几丁质;几丁质脱乙酰基酶;几丁质酶

学科专业：微生物学

摘要

Abstract

第一章 绪论

1 几丁质和壳聚糖

1.1 几丁质

1.2 壳聚糖

2 几丁质/壳聚糖水解酶

2.1 几丁质酶

2.1.1 几丁质酶的分类

2.1.2 真菌几丁质酶的三维结构

2.1.3 真菌几丁质酶的功能

2.1.4 C.cinerea中的几丁质酶

2.2 几丁质脱乙酰基酶(几丁质修饰酶)

2.2.1 几丁质脱乙酰基酶的底物特异性

2.2.2 几丁质脱乙酰基酶的催化机制

2.2.3 几丁质脱乙酰基酶的结构

2.2.4 真菌几丁质脱乙酰基酶的功能

3 本论文的研究目的和意义

第二章 灰盖鬼伞中的几丁质脱乙酰基酶Cda3酶学性质和功能的研究

第一节 重组Cda3的诱导表达、纯化及鉴定

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 试剂与仪器

1.3 培养基和常规溶液的配制

1.4 C.cinerea子实体的培养

1.5 C.cinerea子实体菌柄不同区域细胞壁的提取

1.6 Cda3的诱导表达及分离纯化

1.7 重组蛋白Cda3的SDS-PAGE检测及质谱鉴定

1.8 考马斯亮蓝法测定蛋白含量

2 结果

2.1 Cda3的诱导表达、分离纯化及鉴定

第二节 Cda3酶学性质的测定

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.2 几丁质脱乙酰基酶活性的测定方法

1.3 pH、温度和金属离子对Cda3脱乙酰基活性的影响

1.4 Cda3的底物特异性

2 结果

2.1 pH、温度和金属离子对Cda3脱乙酰基活性的影响

2.2 Cda3的底物特异性

2.3 Cda3的酶促反应动力学

2.4 Cda3对菌柄细胞壁几丁质的脱乙酰作用

第三节 Cda3脱乙酰基模式研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 试剂与仪器

1.3 Cda3脱乙酰基模式实验的样品准备

1.4 MS和 MS/MS分析

2 结果

2.1 Cda3对几丁质寡糖脱乙酰基模式分析

第四节 Cda3蛋白质序列和结构分析

1 材料与方法

2 结果

第五节 讨论

第三章 灰盖鬼伞几丁质酶ChiE2的异源重组表达及酶学性质和重构细胞壁伸长性质的研究

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 试剂与仪器

1.3 培养基的配置

1.4 主要溶液配置

1.5 PCR引物的设计

1.6 ChiE2基因的扩增和扩增产物的检测与回收

1.7 质粒p PICZαA 的提取和双酶切

1.8 E.coli-DH10B感受态细胞的制备

1.9 pPICZαA-Chi E2 重组质粒的构建及转化

1.10 阳性克隆的筛选

1.11 pPICZαA-Chi E2 重组质粒的提取和线性化

1.12 pPICZαA-Chi E2 重组质粒转化P.pastoris

1.13 阳性转化子的筛选

1.14 ChiE2的诱导表达

1.15 ChiE2初步纯化

1.16 Chi E2的SDS-PAGE检测及鉴定

1.17 ChiE2水解活性的测定

1.18 ChiE2蛋白质三维结构预测分析

1.19 几丁质酶ChiE2重组热灭活菌柄细胞壁伸长活性的检测

2.结果

2.1 PCR产物的鉴定与纯化

2.2 pPICZαA-ChiE2 重组质粒的构建

2.3 E.coli阳性转化子的验证

2.4 P.pastoris阳性转化子的验证

2.5 ChiE2的诱导表达及蛋白浓缩

2.6 Chi E2的SDS-PAGE检测及鉴定

2.7 ChiE2的底物特异性测定

2.8 ChiE2的蛋白质三维结构预测分析

2.9 几丁质酶ChiE2重构热灭活菌柄细胞壁伸长活性

3 讨论

第四章 全文总结

参考文献

致谢