基于荧光成像的生命科学论文

由于光学衍射极限，远场光学显微镜的分辨率仅能达到光波长的一半左右。在可见光波段，这一极限大约为200纳米。而对于生命科学研究，往往需要数十纳米甚至更高的分辨率，以获取组织或活细胞内部精细结构的信息。2014年度的诺贝尔化学奖获得者解决了这一世纪难题。下面是小编整理的《基于荧光成像的生命科学论文 (精选3篇)》的相关内容，希望能给你带来帮助!

基于荧光成像的生命科学论文 篇1：

激光扫描共聚焦显微镜在植物学中的应用

摘要：激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)是20世纪80年代发展起来的一种新型高精度显微镜系统，是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一，但在其他领域的应用较少。共聚焦显微镜成像技术由于具有高分辨率和层析成像等独特优势，已成为生物学、医学、材料等领域的重要研究工具之一。但是，由于大规模仪器的价格高、维护费用高和操作相对复杂，大多数国立大学都委托进行抽样。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜;植物学;应用

引言

激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)是一种在传统荧光显微镜上加装激光扫描的新型成像仪器。通过对待测样品进行快速地逐点激发扫描，待测样品内荧光物质经激发后会发出荧光，产生的荧光由入射光路返回分光计并聚焦，通过光电倍增管收集信号后在计算机上进行图像呈现，从而对所测样品进行成像分析。目前，CLSM以其高分辨、实时成像等优点被广泛应用于活细胞及组织中离子交换、信号传递等实时细胞代谢分析，是生物医学研究领域不可缺少的重要仪器之一。

一、CLSM的工作原理

CLSM由激光器、扫描头、荧光显微镜、光学系统和计算机系统组成，由激光器发射特定波长的激发光，经照明针孔聚焦于样品上，样品受到激发后发出的荧光通过探测针孔聚焦后，被光电倍增管(PMT)探测收集，而非焦平面的信号无法透过针孔，信号输送到计算机经过软件重建成像。CLSM排除了非焦平面的信号干扰，极大提高了图像的信噪比和成像质量，实现厚样品的光学切片和三维重构。对于不透光的石笋样品，将观测面抛光后倒置于CLSM的载物台上，即可对样品的观测面进行聚焦成像。

二、激光扫描共聚焦显微镜教学应用现状

随着科学研究项目的逐步增加和科学研究的深入，激光共焦技术越来越多地用于生命科学、医学和材料科学。但是，这种技术只在医学课程中引入了仪器的原理和应用，而没有相应的实验课程。学生不学习样品的制备过程，更不用说实际使用仪器了，这导致他们所学知识过于抽象，学生也不能真正掌握仪器的基本功能和实验方法。这不仅使潜在的共焦显微镜应用的发展出现赤字，而且也不能有效满足科研过程中学生的实际需要。考虑到这种情况，总结了近年来培训经验和显微镜试验服务的两个原因：(1)目前课堂上的理论知识缺乏相关性和实际意义，学生很难将教师所讲的理论与(2)共焦显微镜本身——其结构复杂，仪器昂贵。目前，这种可靠的抽样测量方式使学生难以自行操作，无法掌握仪器的使用条件。目前对仪器的需求量很大，委托的正常测试时间不能充分满足师生的科研需要学生很难在教学过程中作为研究者发挥主导作用，不能根据自己的研究方向和实际需要设计矛盾的实验，不利于培养学生的实践能力和创新能力。因此，特别有必要开设面向学生科学研究需求的共焦显微镜实验课程，这也是实现大规模仪器公开共享及其自身价值的关键步骤。

三、结果与讨论

不同激发波长对实验结果的影响本次实验所用的荧光染料罗丹明激发波长在555nm左右，根据仪器所配置的激发光源：405，488，560，640nm，需要选用560nm波长激发光，发射波长范围在580～630nm。学生实验小组自行操作仪器，由图3所示，当个别小组选用488nm波长激发光作为激发光源时，即使在后续对焦等操作步骤中无任何失误，细胞仍没有荧光出现(图1A)。与之相对，选用560nm激发光并收集580～630nm发射光，细胞呈现明显红色荧光(图1B)，说明合适波长的激发光对细胞成像至关重要。对焦是激光扫描共聚焦显微镜操作中最为重要的一步，准确对焦可实现对目标物准确、清晰的成像。学生在操作过程中，控制目镜缓慢上下移动，以求寻找准确焦点。由图2A可看出，当定焦位置处于焦点下方时，由荧光场看出细胞呈现较弱红色荧光，但从明场可看出细胞边缘模糊，整体不清晰，同样叠加后成像效果较差。当通过调节目镜准确對焦后，红色荧光明显增强(图2B)，细胞清晰，整体成像效果较好。进一步调整焦距后，红色荧光减弱至难以捕获，且细胞清晰度降低(图2C)。从三组对比可得出结论：焦距影响细胞荧光成像效果，准确对焦才能进行良好的荧光成像实验。在获取细胞荧光成像图后，可利用三维荧光重构的方法进一步验证荧光源自于细胞内部，即荧光染料已进入细胞内部而非黏附于细胞表面。设置0.5m/张扫描频率沿细胞Z轴自-3m开始，随着扫描深度逐渐增加，荧光强度逐渐增强(图3A)。进一步增加扫描深度，Z轴方向染料浓度降低导致细胞内荧光强度降低(图3B)。利用软件进行三维重构后可看出，荧光呈现块状分布(图3C荧光场)，且从叠加场更明显看出荧光来自于细胞内部，从而证明了染料已进入细胞内部。

结束语

共焦实验教学注重培养学生实践能力和培养创新意识的理念，有机地将实验课程的研究与研究生的研究方向相结合。目的是提高实验教学活动的高层次、创新性和挑战性，建立开放式实验教学课程，使实验教学时间灵活，建立共焦开放式资源共享平台，为大型仪器的实验教学开辟新途径。创新实验教学模式，让学生在整个过程中参与共焦实验，有利于学生更好地掌握仪器应用，提高实验技能，将实验课程研究用于科研项目，充分发挥学生的学习主动性和积极性，培养学生的实践能力和创新能力。

参考文献：

[1]王玉花，程超，杨革.LSCM880NLO激光扫描共聚焦显微镜的操作技能及应用[J].分析仪器，2019(06)：118-123.

[2]张彦丽，代亚丽，陈亚兰，靳娇，潘勋，王文娟.利用转盘共聚焦显微镜进行快速实验的新方法[J].现代生物医学进展，2019，19(19)：3784-3788.

[3]檀玲，郭林霞，陈博文，张昭寰，王敬敬，刘海泉，潘迎捷，赵勇.基于高通量共聚焦激光扫描显微镜方法定量分析副溶血性弧菌生物被膜结构[J].微生物学报，2020，60(04)：715-726.

[4]林曼娜，向承林，李建军，徐江平，程玉芳.LSM880withAiryscan激光扫描共聚焦显微镜高级功能和管理[J].电子显微学报，2019，38(03)：271-275.

作者：黄云

基于荧光成像的生命科学论文 篇2：

突破光学衍射极限：实现远场纳米级分辨的光学显微镜

由于光学衍射极限，远场光学显微镜的分辨率仅能达到光波长的一半左右。在可见光波段，这一极限大约为200纳米。而对于生命科学研究，往往需要数十纳米甚至更高的分辨率，以获取组织或活细胞内部精细结构的信息。2014年度的诺贝尔化学奖获得者解决了这一世纪难题。

2014年度的诺贝尔化学奖授予在超分辨光学显微镜领域做出开创性贡献的三位科学家：贝齐格(E.Betzig)、黑尔(S.W.Hell)和莫纳(W.E.Moerner)。对于很多同行而言，这件事既在意料之中，却也颇显意外。

西方人有一句谚语：“Seeing is believing(眼见为实)。”因此，成像与观测领域的重大突破一直为诺贝尔奖所青睐。300余年前，当荷兰科学家列文虎克(A.van Leeuwenhoek)利用自己搭建的显微镜观察水珠时，他意外地发现了悬浮在水滴中的细小浮游微生物，从此向世人打开了进入微观世界的大门。从几何光学角度看，通过合理设计光学成像系统，光学显微镜具备实现任意放大倍率的能力。然而，人们身处的世界在本质上是量子世界，最终一切物质都必须用“波”的概念来描述，对光自然也不例外。因此，当人们利用光波来进行显微观测时，量子力学中的不确定性原理为光学显微镜的分辨率设置了一道屏障，即光学衍射极限。

自从1873年德国科学家阿贝(E.Abbe)首次提出光学衍射极限的概念开始，直到20世纪末，人们一直认为光学显微镜所能够看清的物体的最小尺寸大约为光波长的一半左右(对于可见光而言，这一极限尺寸大约在200纳米)。这意味着科学家们可以辨别完整细胞，以及其中一些被称为细胞器的组成部分。然而，他们却无法分辨一个正常大小的病毒或者单个蛋白质。在这样的背景下，即便对于很多一流的光学科学家，他们也已形成了一个思维定势，认为突破光学衍射极限在理论上是一件不可能的事情。正是得益于今年的诺贝尔化学奖获奖者提出的开创性成像新概念，这一状况才得以被奇迹般地终结。

值得注意的是，阿贝的光学衍射极限概念是基于光波自身的波动本性所得到的，而当代很多的先进光学显微技术往往借助于光与物质相互作用中产生的各种奇特效应来实现，这为突破光学衍射极限打开了缺口。迄今为止，成功实现超分辨的途径可以分成两类。一类是对激发光进行整形，再结合材料对光的非线性响应来减小光斑，例如受激发射损耗方法(stimulated-emission-depletion，STED)和结构光照明显微镜(structured illumination microscopy，SIM);另一类就是借助单分子成像技术，光激活定位显微镜(photoactivated localization microscopy，PALM)和随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)是其中的代表。

受激发射损耗

黑尔自1990年在海德堡大学获博士学位后，就一直在寻找突破衍射极限难题的方法。1994年，黑尔发表了一篇论文阐述了利用受激发射来操控荧光分子的想法。在他设想的技术方案中，显微镜(也称STED显微镜)利用荧光分子作为成像对象的标记物。荧光分子的特性是可以被一束波长较短(即光子能量较高)的光束激发，然后发射出波长较长的荧光。正如人们感觉黑夜中穿着荧光衣的人特别显眼，荧光标记使得感兴趣的观测对象在复杂的生物结构中脱颖而出。

黑尔的方法是通过扫描一束激光聚焦焦斑来对样品进行逐点成像，成像的分辨率取决于焦斑内所能够激发的荧光分子占据的体积。因此，为了缩小荧光激发体积，他采用了两束组合激光，即一束光被聚焦成正常的衍射极限焦斑，将焦斑内的荧光分子抽运到激发态;而第二束光则选取在荧光分子的发射波长范围，并被聚焦成一个中心与第一束光的焦斑中心完全重合但却是中空的环状焦斑。第二束光可以将被第一束激发光抽运到激发态上去的荧光分子从激发态淬灭到基态，因此也被称作淬灭光束。由于淬灭光束的光强分布仅在几何焦点处为零，因此从原理上讲，只要淬灭光足够强，由第一束光激发的荧光分子所占据的体积几乎可以被无限制地压缩到几何焦点附近极小范围内。目前，利用该方法可将光学显微成像的分辨率推进到数十纳米的尺度，远远突破了光学衍射极限的限制。相比传统的共聚焦显微成像，STED成像技术提供了高得多的光学分辨率，将神经元的细节清晰地显示出来。

相对于其他光学超分辨成像技术，STED技术最大优点是可以较快速地观察活细胞内实时变化过程，这对于生命科学中很多实际问题的研究十分关键。2008年，黑尔等人在美国《科学》上发表文章，报道了以视频速度(28帧/秒)来采集记录神经细胞内突触小泡的高分辨率图像(62纳米)。2012年，他们又利用STED显微成像法记录了活体老鼠脑细胞内神经细胞间的突触运动，该项工作有助于理解突触的运动机制，并可能促进针对突触内的精神治疗药物研究获得突破。

黑尔是首位不仅从理论上，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。但黑尔早期的文章在当时并没有引起足够的轰动，即使是非常著名的显微领域科学家仍然对此抱怀疑态度。如德国科学家施特尔策(E.H.K.Stelzer)于2002年在英国《自然》上发表文章，对黑尔发明的STED技术是否从本质上突破了衍射极限表示怀疑。并用坚定的口气写道：“眼下有一件事仍然是对的：海森伯(的不确定性原理)是正确的，阿贝极限肯定不会突破。”从这一点上也可以看出，由于100多年光学衍射极限理论的统治地位，人们在思想上已经形成了很深的思维定式。

单分子技术与光激活定位显微镜

莫纳在1989年任职于美国IBM研究中心时，首次在凝聚态相中实现了单个分子的光吸收测量，这项工作吸引了大量化学家将注意力转向单分子研究。两年之后，他与另外一个博士后安布罗斯(W.P.Ambrose)利用荧光实现了单分子成像。1997年，他与因绿色荧光蛋白的发现而获2008年诺贝尔化学奖的钱永健合作，发现了绿色荧光蛋白的光转化效应。这一发现使得控制荧光探针的发光成为可能。以光激活荧光蛋白分子为例，当受到波长488纳米的光激发时，该荧光蛋白开始发出波长更长的绿色荧光，直至被淬灭(淬灭的荧光分子将不再有发射荧光的能力)。如果此时利用一束405纳米的激光照射该荧光蛋白分子，可以将该分子再次激活。激活之后的荧光蛋白如果被488纳米的激光照射，又能恢复发射荧光能力。简言之，利用488纳米和405纳米两种波长的激光，可以交替实现这些荧光蛋白分子的“开”和“关”状态。

这一发现对贝齐格至关重要。贝齐格注意到光学衍射原理虽然不允许人们同时分辨间距小于大约激发光波长的两个荧光分子，但一旦两个分子的间隔增大，从光学上讲，它们都分别可以无限高的空间精度被定位。早在1995年，贝齐格就发表文章提出用不同颜色荧光分子来绕开衍射极限。但由于分子合成与标记等方面的实际操作困难，无法从实验上加以验证和实现。2006年，他意识到，其实不需要不同颜色的光，只需借助莫纳的单分子技术，让荧光分子在不同的时间发光，就可以实现超分辨成像。于是当时赋闲在家的贝齐格和赫斯(H.F.Hess)利用一部在自家客厅组装的光学显微镜搭建出这样一套显微系统，称之为光激活定位显微镜(PALM)。他们使用微弱的光脉冲激发荧光分子，使其中极小部分的荧光分子能够发出荧光。因为这些荧光分子很稀疏，相距较远，所以它们的位置能够被精确定位。等到这些分子光致褪色后，再继续用微弱的光脉冲激活另外一小部分荧光分子，让它们发出荧光。通过分别记录多幅图像，使不同图像中的荧光分子所成点像不再相互干扰，从而能够对每个荧光分子逐个进行定位。在全部荧光标记分子的定位完成后，一幅超越衍射极限的图像即已形成。随后他们和美国国立卫生研究院及佛罗里达州立大学的科学家合作，利用该新技术对生物样品进行成像，在每平方微米塞满高达十万个分子的细胞样品中，成功分辨出相距仅2～25纳米的分子，在细胞片足(lamellipodium)内的肌动蛋白(actin)、黏着斑蛋白(vinculin)、细胞膜上的反转录病毒(retroviral)蛋白Gag等方面取得高清晰成像。

2008年，贝齐格等人将PALM显微技术应用于活细胞成像来记录细胞黏附蛋白的动力学过程。2010年，赫斯小组将PALM技术与光的干涉原理结合起来，发展成干涉测量光激活定位显微技术(iPALM)，将三维的分辨率提高到20纳米以内，在纳米尺度上观测到了黏着斑(focal adhesion)的蛋白组织方式，为分析蛋白功能提供了新的信息。

随机光学重建显微技术

作为第一位获美国麦克阿瑟基金会“天才奖”的华人女科学家，庄小威在生物物理显微成像领域做出了许多重要的成果。几乎与贝齐格提出PALM概念同时，庄小威也提出了原理相似的随机光学重建显微技术(STORM)。STORM与PALM不仅是同年提出，原理也极其相似，都是通过反复激活一猝灭荧光分子，使显微镜每次只记录相距远的几个荧光分子，从而对它们进行精确定位，通过光一化学手段，以时间换空间方式获取了超分辨。与PALM不同的是，庄小威使用的是有机荧光分子对，而非光激活蛋白。他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色的633纳米激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光。之后，用绿色的532纳米激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离。因此，当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。

2007年，庄小威研究团队进一步发展了多色随机光学重建显微方法，并以20～30纳米级别的分辨率演示了DNA模式样品和哺乳动物细胞的多色成像，研究结果公布在《科学》周刊上。2008年，他们在《科学》周刊上展示了用3D STORM成像技术拍摄的肾细胞内微管结构图和其他的分子结构图。2011年，庄小威与另一位华人科学家谢晓亮，利用超分辨率荧光显微镜对活体大肠杆菌细胞内的拟核相关蛋白(NAPs)进行了跟踪观察，并由此揭示了细菌遗传物质组织机制。2012年，庄小威小组对STORM进行了改进，通过双物镜STORM，在生物成像中获得了小于10纳米的横向分辨率，以及小于20纳米的纵向分辨率。采用这种方法，他们对细胞中的微丝进行了成像，揭示了这种重要细胞骨架的超微结构(微丝是由肌动蛋白组成的直径约为8纳米的纤维结构)。2013年，他们又利用STORM的技术优势，分析了神经细胞中肌动蛋白、血影蛋白(spectrin)等相关蛋白的组织结构，提出了关于细胞骨架结构的新假说。

庄小威研究组利用STORM等技术获得了不少关键分子的结构，为超分辨的发展和推广应用做出了巨大贡献。这次她未获诺贝尔奖，其中的是非曲直，科学界人士各有说法。

结构光照明显微镜

2000年，加利福尼亚大学的物理学家古斯塔夫森(M.Gustafsson)领导的研究团队开发出了结构光照明显微镜(SIM)，并得到了海拉细胞中肌动蛋白细胞骨架的图像，相比传统显微镜的图像来说，在横向上的分辨率提高了2倍。结构光照明显微镜利用调制光源照明样品。将原本不可分辨的高分辨率信息编码入荧光图像中，结合计算解码获取高分辨率信息，其过程可以通过光学莫尔条纹来理解。莫尔条纹是指由两种具有精细结构的图形叠加之后出现的比较粗的干涉条纹。在结构光照明成像中，具有精细结构的样品和调制照明光场都有很高的空间频率，难以直接分辨，但是其叠加产生的粗条纹(莫尔条纹)却具有很低的空间频率，可以直接被分辨。由于调制光场是已知的，通过测量莫尔条纹就可以反推出样品的精细结构。SIM技术同样也生成了许多美丽的高清晰细胞图像。

2005年，古斯塔夫森又利用荧光分子的饱和吸收特性，发展出饱和结构光照明显微技术(SSIM)，将整体分辨率提高了4倍。

结构光学显微镜在宽场成像的基础上提供了一种简单、具有快速获取图像能力的超分辨成像技术，为生物组织纳米结构的活体研究开辟了一条新的途径。遗憾的是，古斯塔夫森于2011年因癌症去世，享年51岁，无缘此次的诺贝尔奖。

展望

由于上述光学先驱的贡献解决了光学显微成像领域中长达一个半世纪之久的难题，并在很短的时间内形成了一个全新的研究领域，其科学意义显而易见。早在十年前，不少同行学者已认为光学超分辨成像领域的几位先驱将有望获诺贝尔奖。事实上，当时人们甚至比现在更为乐观，认为这些技术能很快达到小分子级的成像精度，从而给生命科学研究领域带来根本性变革。然而，随后的研究发现，虽然理论上具备了潜力，但在技术上彻底实现这一目标仍存在诸多挑战。因此，超分辨光学成像领域的后续发展空间仍十分巨大，孕育着新理论、新技术，并有着在生命科学、纳米科学等相关领域获得进一步广泛应用的诸多机会。诺贝尔奖评奖委员会在实现这些美好愿景尚有一段距离的时候，将2014年度的化学奖颁给该领域的科学家，略显意外。简言之，即使该领域在短期内很难被再次授予诺贝尔奖，仍有望产生诺贝尔奖级的研究成果。

长期以来，诺贝尔奖评奖的大致标准还是比较明确的。首先是关注研究成果的原创性，一般都是奖励给一个研究领域中最早的概念提出者或是核心现象的发现者。那些针对后续问题开展跟踪性研究的同行。即使也曾做出卓越的贡献，但往往丧失了获奖机会。其次是关注这些原创成果在人类文明进程中产生的影响力。影响力的产生主要来自于两方面：或者是通过重要科学发现来加深人们对宇宙或自然规律的理解，或者是通过重大技术发明推动人类物质文明的进步。相比于在那些已获认可的热门领域开展跟踪性研究。从事原创性研究面临着更高的风险，并且即使能够成功，短期内其价值也未必能迅速获得认可并产生充分影响。扭转这一状况，促进开展那些可能产生显著影响力的原创研究，可能需要更加包容的氛围。以促进思想和理念的多样化;需要更加宽松的环境，以降低功利的影响并鼓励独立的科学判断;还需要撇弃浮躁的心态，容许科学家长久地专注于那些有挑战性的科学难题。

作者：倪洁蕾　程亚

基于荧光成像的生命科学论文 篇3：

量子点纳米材料探针及其在肿瘤影像中的应用

摘 要：针对现有量子点影像探针存在荧光性质不可控、生物毒性强的问题，本研究结合现有的CuInS量子点探针，研究制备出一种掺杂Zn离子可简易合成的ZCIS/ZnS量子点纳米探针，并通过改进其水溶性，得到一种可直接应用于医学肿瘤影像的改进ZCIS/ZnS量子点纳米探针。为提高该量子点纳米探针的靶向性，研究根据EDC偶联的原理，通过将改进ZCIS/ZnS量子点纳米探针与cRGD多肽进行偶联，得到ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针，并从结构形态、细胞毒性和离体荧光3个方面重点评估了该量子点纳米探针，并通过实验论证了其有效性和实用性。实验结果证明，本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针是一种有效的肿瘤靶向探针，可用于实际肿瘤靶向检测。

关键词：CuInS;量子点;纳米材料;荧光成像

Quantum Dot Nanomaterial Probe and Its Application in Tumor Imaging

Sun Pulin

(School of Mechanical Engineering，Shandong University of Technology， Zibo 255000， China )

Key words：CuInS; quantum dots; nanomaterials; fluorescence imaging

量子点作为一种新型纳米材料，由于其优良的光学性质，被广泛应用于生物标记。如刘蓓蓓、曹林(2019)建立了基于量子点的铅镉快速串联检测方法，用于检测肉中的Pb和Cd含量是否超标等[1]。但由于铅镉本身属于重金属，因此基于这两种元素的量子点具有潜在的生物毒性，故限制了它们在荧光活体成像方面的应用。近几年，随着量子点材料的发展，具有较低生物毒性的CuInS量子点材料在荧光活体成像方面得到快速发展，如冯彩萍、單路瑶等(2020)基于Fe3O4&CuInS2核壳结构构建了双模式成像系统，实现了可视化治疗[2]。但这些研究中量子点仍然存在荧光性质不可控的问题。为解决该问题，本研究结合现有的CuInS量子点探针与EDC偶联的原理，制备出一种荧光性质稳定，且生物毒性较低的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本研究实验主要使用到的仪器及其型号和生产厂家如表1所示，实验中使用到的试剂和生产厂家如表2所示，试剂规格均为分析纯。

1.2 实验过程

1.2.1 量子点探针制备

(1)ZCIS量子点制备。步骤1：称取76.8mg碘化亚铜、117.2mg醋酸铟、126.4mg硬脂酸锌依次加入含冷凝管的100ml四口烧瓶中，并加入16ml十八烯、0.2ml油酸、2ml巯基十二烷混合。在氩气环境中使用磁力搅拌将反应体系加热到100℃。同时，利用真空泵持续对反应体系抽真空30min，每间隔8min回充和置换一次氩气。步骤2：持续加热反应体系至240℃，并维持该温度到一定时间，可以观察到反应溶液随时间延长，颜色逐渐由淡黄色变成黄色、橙色、红色、棕红色直到黑色。为后续测试反应溶液的表征，在反应体系加热过程中，每间隔5min需借助注射器从反应液中抽取少量溶液，并快速稀释冷却置于环己烷中。步骤3：维持加热温度240℃持续加热70min后，将反应溶液置于自然条件下冷却至室温，并向溶液中加入3倍体积的过量乙醇/环己烷混合溶剂。采用8000g离心处理混合溶液20min，去除多余的副产物和反应前体，可得到纯化的ZCIS量子点。

(2)改进ZCIS/ZnS量子点制备。步骤1：称取32mg硫粉，在超声波的条件下，将硫粉溶解于8ml十八烯与2ml油胺的混合溶液中，得到棕红色硫前体液。称取380mg硬脂酸锌，在超声波的条件下使其溶解于6ml的十八烯溶液中，得到白色浑浊状态的锌前体液;步骤2：将不进行任何处理的ZCIS量子点的反应溶液温度降低到150℃。依次向溶液中加入4ml硫前体液和6ml锌前体液，并将混合溶液加热到220℃，并保持温度使混合溶液持续反应1h后，将反应溶液置于自然条件下冷却至室温;步骤3：采用8000g离心处理混合溶液20min，去除多余的副产物和反应前体，可得到纯化的ZCI/ZnS量子点，将其保存在三氯甲烷中;步骤4：向上述制备得到的含有20nmol ZCIS/ZnS量子点的三氯甲烷溶液中加入8mg的PMAO，将混合溶液在室温条件下使用磁力搅拌剧烈搅拌3h。加入40μl的乙醇胺并继续搅拌30min，再加入4ml硼酸缓冲液，利用旋转蒸发完全去除溶液中的三氯甲烷，得到含有量子点的澄清透明水溶液;步骤5：采用100000g离心对含有量子点水溶液进行超速离心处理30min，重复3次，去除溶液中的多余反应物以及三氯甲烷。将改进后的ZCIS/ZnS量子点溶解于400μl的PBS中，以便用作后续实验。

(3)ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针制备。ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针的制备方法主要是利用EDC偶联的原理[5]，将改进后的ZCIS/ZnS量子点与cRGD多肽进行偶联，其具体操作如下：

步骤1：将10nmol改进后ZCIS/ZnS量子点和10μmolEDC在400μl的PBS中进行混合，将混合溶液在避光室温条件下进行震荡，震荡时长为15min;步骤2：向混合溶液中加入一定量的粉末状cRGD，并在避光的室温条件下震荡2h;并采用100000g超速离心处理溶液30min，重复2次，去除多余的反应物，得到纯化的ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针。

1.2.2 ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针性能测试

(1)细胞毒性测试。借助MTT实验[6]对白鼠成纤维细胞系NTH-3T3进行表征，以检验ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针的细胞毒性测试。具体操作如下：

步骤1：取含有10%胎牛血清的DMEM培养液与处于对数生长期的NIH-3T3细胞混合配置成细胞悬浮液。向48孔边缘孔为无菌PBS填充的細胞培养板中，加入每孔200μl的细胞悬浮液，种植密度为每孔5000个细胞。在二氧化碳含量为5%，温度为37℃的细胞培养箱中进行培养，培养时长12h;步骤2：向含有细胞悬浮液的孔板中加入不同浓度的ZCIS/ZnS量子点DMEM溶液，并在二氧化碳含量为5%，温度为37℃的细胞培养箱中进行培养，培养时长24h，其中，每个浓度的ZCIS/ZnS量子点DMEM溶液需设置3个复孔;步骤3：向每孔中加入40μl的MTT溶液，培养4h后倒出培养液。加入300μl的二甲基亚砜，在避光低速的摇床上震荡10min，直到结晶物完全溶解。采用酶联免疫检测仪检测每孔的吸光值。

(2)离体荧光信号测试。本研究的荧光活体成像实验是以白鼠脑胶质瘤为例展开的实验[7]，具体操作如下：

步骤1：选择两组7周龄大小、体重为25g左右的雌性裸鼠20只，每组10只，在其右上肩部，采用皮下注射的方式，注射100μl含100万个肿瘤细胞的PBS细胞悬浮液。约3周后，裸鼠体内肿瘤体积增长到5mm×5mm时，即可用于荧光活体成像实验;步骤2：实验前12h，停止喂食待用裸鼠，以尽量减少因食物的荧光造成的干扰。采用尾静脉注射的方式，向第一组裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS量子点PBS溶液，向第二组裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针PBS溶液;步骤3：设置Carestream MSFX PRO荧光活体成像系统CCD的曝光时间为20s，激发波长510nm，发射波长为700nm。在不同时间点，使用该系统对注射量子点探针的老鼠进行荧光成像;步骤4：注射6h后杀死实验老鼠并取出其肝、胃等主要脏器用作荧光成像，并利用成像系统的图像处理软件完成数据采集及分析[8]。

1.3 性能测试

1.3.1 HRTEM结构形貌分析

对稀释在三氯甲烷中的纯化ZCI/ZnS量子点进行超声分散处理，取处理后的溶液10μl置于超薄碳膜的TEM测试铜网上，直到溶剂全部挥发。利用HRTEM对量子点结构和形貌进行表征。

1.3.2 XRD结构分析

取0.1ml分散于三氯甲烷中的纯化后量子点均匀涂抹与晶体硅片上，待溶剂完全挥发，再次涂抹同体积的溶液，重复3次。利用XRD进行量子点晶体结构分析。

2 结果与分析

2.1 ZCIS/ZnS量子点的XRD图

使用XRD对ZCIS和ZCIS/ZnS量子点进行结构表征，得到如图1所示的结果。由图1可知，ZCIS和ZCIS/ZnS量子点在XRD图谱上均存在3个衍射主峰，ZCIS/ZnS的衍射主峰相较于ZCIS出现了一定红移，说明Zn离子成功引入量子点，本研究成功制备了ZCIS/ZnS量子点。

2.2 改进ZCIS/ZnS量子点光学性质

利用HRTEM对改进ZCIS/ZnS量子点的光学性质进行表征，得到如图2所示的结果。由图2可知，改进的ZCIS/ZnS量子点的荧光性质与ZCIS/ZnS量子点的荧光性质相比，几乎没有发生变化。

2.3 ZCIS/ZnS-cRGD量子点细胞毒性评估

通过MTT实验对ZCIS/ZnS-cRGD量子点细胞毒性进行评估，将不同浓度的ZCIS/ZnS-cRGD量子点与NIH3T-3细胞共同孵育48h，得到如图3所示的结果。由图3可知，当ZCIS/ZnS-cRGD量子点浓度小于0.8μmol时，细胞的存活率维持在87%以上，说明本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点具有较低的毒性，可用于后续医学研究和应用。

2.4 离体荧光信号强度测量

为进一步分析ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针的代谢能力，在注射该探针5h后，解剖第二组裸鼠取出其主要脏器，并对其进行离体荧光成像和半定量分析，得到如图4所示的结果。由图4可知，肝脏、胃的荧光信号最强，其原因是RES能识别并捕获ZCIS/ZnS-cRGD信号，因此肝脏的ZCIS/ZnS-cRGD信号强度最强;胃部残留的食物含有大量的荧光信号，因此胃部的荧光强度相对较高。而相比于其它脏器，肿瘤的荧光强度最强，说明本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针是一种有效的肿瘤靶向探针，可用于实际肿瘤靶向检测。

3 结论

根据上文研究，可以得到以下4点结论：

(1)ZCIS/ZnS量子点在XRD图谱上均存在3个衍射主峰，且相较于ZCIS量子点出现了一定红移，说明本研究成功引入了Zn离子，制备得到了ZCIS/ZnS量子点。

(2)改进ZCIS/ZnS量子点纳米材料具有良好的亲水性和荧光性质，可直接应用于医学影像。

(3)ZCIS/ZnS-cRGD量子点浓度小于0.8μmol时，细胞的存活率维持在87%以上，即本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子點具有较低的毒性。

(4)ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针可明显检测到实验裸鼠的肿瘤部位信号，且随着时间的延长，肿瘤的轮廓更加清晰，即本研究制备的制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针具有良好的肿瘤特异性识别能力，是一种有效的肿瘤靶向量子探针，可用于实际肿瘤靶向的活体成像。

参考文献

[1]刘蓓蓓，曹林.基于量子点建立铅镉快速串联检测方法[J].食品科学，2019，40(18)：335-341.

[2]冯彩萍，单路瑶，王曲玲， 等.基于Fe3O4@CuInS2核壳结构的双模式成像系统的构建[J].纳米技术，2020，10(02)：16-24.

[3]马逸骅，陈琳，杨永珍，等.钆掺杂碳量子点的制备及其双模态成像研究进展[J].影像科学与光化学，2020，38(05)：763-770.

[4]王鑫，韩晓军，陈冠英.基于稀土发光纳米材料的时间分辨成像[J].发光学报，2020，41(09)：1045-1057.

[5]胡国文，乔玉玲.叶酸修饰的碳量子点在体外癌细胞成像中的应用[J].应用化学，2020，37(09)：1003-1009.

[6]张迪，马媛媛，邹文生.富营养化水体中磷酸盐荧光分析材料进展[J].安徽建筑大学学报，2020，28(04)：14-20.

[7]张玉权，黄渊余.聚集诱导发光荧光探针在生物成像中的研究进展[J].生命科学仪器，2020，18(04)：3-11.

[8]杨一唯，胡彬彬，唐瑜.刺激响应型稀土智能发光材料在光学编码及生物医学中的应用[J]. 科学通报，2019，64(35)：3730-3746.

[9]石吉勇，李文亭，胡雪桃，等.新型汞离子CQDs-CuNCs比率荧光探针的构建及在螃蟹中的应用[J].光谱学与光谱分析，2019，39(12)：3925-3931.

[10]陈婷婷，杜民，陈建国，等.上转换发光材料应用进展及其检测系统的研究[J].中国医疗设备，2019，34(12)：151-155.

作者：孙溥临