基于SARS-CoV-2核酸检测系统的核酸检测技术发展方向

摘要2020年初至今，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情仍在全球多个国家流行，给全球公共卫生安全造成了严重威胁.中国在应对COVID-19的实践中，最先完成病毒核酸测序并共享序列信息，最早有效控制疫情蔓延、恢复生产，并在病毒作用人体机制研究、疫苗研发、中和性抗体发现等环节均处于世界前沿.其中，针对病毒核酸的检测工作：试剂盒研发、检测配套设备研制、10合1混检策略及相关政策制订有效提高了疫情防控效率、保障了百姓健康.本文就新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测多种方法的原理、优劣势及其配套设备等进行综述.

关键词新型冠状病毒，核酸检测，CRISPR

1核酸检测技术

核酸检测是依托分子生物学等技术对核酸(DNA或RNA)的结构、含量及亚细胞定位等进行定性定量分析，从而帮助临床上对疾病的诊断[6].常用的检测技术主要有聚合酶链式反应、等温扩增、印迹技术、基因测序和基因芯片等.当前，针对SARS-CoV-2主要是通过其ORF1ab基因、N基因和/或E基因片段进行检测[7].

1.1病毒核酸全基因组测序技术

疫情之初，我国武汉病毒研究所石正丽研究员利用下一代测序(NextGenerationSequencing,NGS)技术首次完成了对SARS-CoV-2基因组测序，并共享全球[5].“华大基因”研发了一款基于宏基因组测序技术的试剂盒[8]，能够鉴别诊断出包括SARS-CoV-2在内的多种冠状病毒和呼吸道病毒.测序技术还能够利用采集的咽拭子、鼻拭子、肛拭子等样品中获取的病毒基因组序列信息，来监测病毒变异，如南非突变株

(501Y.V2)、英国突变株(B.1.1.7)及巴西突变株(P.1).同时，在不同地区确诊病例关联分析中也能发挥重要作用.

目前，针对SARS-CoV-2基因组的测序技术主要包括三类[9]：探针捕获测序技术、宏基因组测序技术和多重PCR扩增子测序技术.研究人员通过对8例临床样本进行分析后发现，在针对高病毒载量样本进行检测时，探针捕获测序和多重PCR扩增子测序都有很好的富集效果，而对低病毒载量的样本进行分析时，多重PCR扩增子测序的富集效果是探针捕获测序的10~1000倍.这一结果表明，在低病毒载量的情况下，多重PCR扩增子测序具有更高的灵敏度和更低的漏检率，能够弥补荧光定量PCR准确度的不足，适用于病程初期低病毒载量难以确诊患者或感染后无明显症状的潜伏期患者的确诊检测.

然而测序技术检测成本高，周期长，需要复杂设备和专业的分析，故该方法不适于大规模筛查，仅在疫情初始及难以确诊病例的检测中进行应用.

1.2荧光定量PCR技术

目前，荧光定量PCR技术已作为SARS-CoV-2核酸筛查的主要手段广泛应用[10].在近期多个区域的全民核酸筛查及确诊病例的实验室诊断中发挥了重要作用.该技术利用扩增过程中Taq酶的5’核酸外切酶活性，在子代DNA延伸过程中“切割”与目标序列结合的探针.当探针被降解后，荧光基团“远离”淬灭基团发出荧光.荧光信号强度随每轮DNA复制扩增而增加，通过检测扩增过程中荧光强度的增加来确定初始模板情况[11](图1.(a)).

荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强，可用于诊断较早期感染[12,13]，已成为最重要的SARS-CoV-2核酸检测方法[14].不完全统计，我国国家药品监督管理局(NMPA)已批准了17个基于该技术的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒.其中，部分产品还获得美国FDA紧急使用授权[15].这些产品可针对咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆等多种样品中的SARS-CoV-2核酸片段进行检测，极大增加了采样可及性.限于需要特定的仪器设备，其便携性相对较差，需要特定场所开展检测[16].

荧光定量PCR技术虽被作为SARS-CoV-2核酸检测的“金标准”，但在针对早期感染者的检测时，可能会出现假阴性结果.特别是针对感染者症状较轻且具有相对较长的潜伏期，该方法可能会发生漏检.导致出现漏检的原因包括以下几方面，(1)检测人员进行咽拭子取样时操作不规范，导致拭子携带病毒量过低，达不到核酸检测的灵敏度;(2)RNA易被环境中(操作环境及操作人)或医疗样本内源性的RNase降解，提取过程未特别注意;(3)检测试剂盒质量不达标.为了减少漏检情况的发生，需要检测人员在采样过程中严格规范操作，通过对疑似病人多个部位同时采样或同一部位反复检测，来增加SARS-CoV-2的检出几率.同时，试剂研发人员需实时监控病毒变异情况，以保证与病毒RNA匹配的引物与探针仍能发挥效用.并且检测试剂盒最低检出限的稳定性及病毒扩增的高效性也应纳入考虑范畴.

1.3微滴式数字PCR技术

微滴式数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)技术通过将PCR反应体系分割成数万个小液滴进行定量扩增[17]，配合使用数字PCR分析系统，可以实现对病毒核酸的绝对定量.

研究人员利用ddPCR分析系统对103名疑似病例、75名密切接触者及16名康复期患者进行检测，通过与三种不同的荧光定量PCR试剂盒的检测结果进行比较后，发现ddPCR的灵敏度、特异性及准确率分别达到91%、100%和93%，极大提升了荧光定量PCR的灵敏度[18].ddPCR在检测极限上的表现也十分突出，通过对57例阴性(荧光定量PCR法)的咽拭子样本进行双盲检测后发现，ddPCR较荧光定量PCR的灵敏度最多高500倍，总体灵敏度仍维持在94%左右[19].

ddPCR技术因其灵敏度高、抗干扰能力强，使其定性分析能够满足临床筛检的基本需求，定量分析能够为疾病的研究和诊治提供更多有用信息.特别是对隔离人员和无症状患者检测，该方法能够最大程度解决因病毒载量低所产生的漏检情况，可作为疫情期间疑似病例复核的可靠手段.但ddPCR仍不能完全避免漏检的发生，其潜在漏检因素与荧光定量PCR技术相似.同时，由于其依赖复杂、昂贵的分析系统，成本较高，只有在大规模使用时，检测成本才接近荧光定量PCR方法，故该方法尚未在国内普及.

1.4逆转录环介导等温扩增技术

环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)技术是由日本学者Notomi[20]在2000年开发的一种新型核酸扩增技术.该技术摆脱了传统PCR对温控的特殊要求，通过在目标序列的6个区域设计4种特异性引物，利用链置换DNA聚合酶，在65℃的恒温条件下即可完成扩增.因扩增过程中会产生大量的焦磷酸镁白色沉淀使溶液的浊度增加，故可通过浊度变化来实时监测扩增反应[21].