三种皂甙R1对氧化低密度脂蛋白引起的血管内皮细胞凋亡具有保护作用

【摘要】目的探讨三七皂苷R1(NGR1)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用及其机制。方法将体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为对照组、损伤组(ox-LDL组)和4种浓度NGR1治疗组(ox-LDL+不同浓度NGR1组);采用CCK-8法检测NGR1的药物毒性以及各组HUVECs的增殖活性，采用Westernblot法检测Bcl-2、Bax及Cleaved-caspase-3凋亡相关蛋白表达情况，免疫荧光染色检测Cleaved-caspase-3凋亡情况，钙黄绿素细胞膜标记染色检测细胞黏附能力，Transwell迁移试验检测细胞迁移能力。结果与对照组比较，损伤组HUVECs的凋亡率和Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，并且HUVECs的增殖活性、细胞黏附能力和迁移能力均显著降低(均P<0.05)。与损伤组比较，NGR1治疗组HUVECs的凋亡率和Cleaved-caspase-3表达水平均随着NGR1浓度的增加而逐渐下降，HUVECs的增殖活性、细胞黏附能力和迁移能力均随着NGR1浓度的增加而逐渐升高(均P<0.05)。结论NGR1通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞增殖活性降低、Cleaved-caspase-3表达上调而引起的细胞凋亡增多、细胞黏附和迁移数量减少，从而发挥其对ox-LDL损伤的血管内皮细胞的保护作用。

【关键词】三七皂苷R1人脐静脉内皮细胞细胞凋亡细胞黏附细胞迁移

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的特征是血管内皮细胞内脂质斑块堆积[1]。血管内皮损伤是AS的始发事件和致病因素，主要由氧化型低密度脂蛋白(oxi-dizedlow-densitylipoprotein,ox-LDL)引起[2]。ox-LDL破坏血管内皮细胞氧化还原平衡，导致内皮损伤，从而诱导内皮细胞凋亡[3]。氧化应激通过增加超氧阴离子促进血管壁的低密度脂蛋白(low-densitylipopro-tein,LDL)氧化，而大量的ox-LDL进一步损害血管内皮细胞[4]。内皮细胞因损伤发生凋亡是AS发展过程中最初但可逆的步骤[5]。因此，预防内皮损伤及细胞凋亡已成为逆转AS的一种治疗策略。研究表明，传统中药三七对血液和心血管系统具有良好的调节作用[6-7]。三七皂苷R1(notoginsenosideR1,NGR1)是三七中起主要生物学作用的成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[8-9]。然而，目前关于NGR1是否可以预防ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡以及增强内皮细胞的黏附和迁移能力尚未明确。本研究通过ox-LDL建立AS的体外细胞实验模型，诱导血管内皮细胞凋亡，并且探讨NGR1整为1×104个/ml的细胞悬液待用。将NGR1粉剂(10mg)溶于DMSO(357.2μl)中，配成30mmol/L的母液保存于-20℃冰箱待用。将体外培养HUVECs分为对照组、损伤组(ox-LDL组)和4种浓度NGR1治疗组(ox-LDL+不同浓度NGR1组)。

1.2.2NGR1药物毒性及其对HUVECs增殖活性影响检测将上述细胞悬液接种于96孔板中(100μl/孔)。将培养板放在37℃、5%CO2条件下的恒温培养箱中培养24h，待细胞完全贴壁后，分别将不同浓度的NGR1(7.5、15、30、60μmol/L)溶液加入对应的96孔板中，再放入细胞培养箱预处理48h。用于药物毒性测试的细胞，将每孔中的药物洗净后，加入10μlCCK-8溶液;用于增殖活性检测的细胞将每孔中的药物洗净后，加入ox-LDL50mg/L刺激24h，再加入10μlCCK-8溶液。空白组为100μlPBS，再加入10μlCCK-8溶液。将加入CCK-8溶液的培养板移入培养箱中避光孵育1h，随后取出培养板，用全自动酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为450nm，并计算细胞对ox-LDL损伤的血管内皮细胞保护作用及其机制，增殖活性，细胞增殖活性=([实验组吸光度-空白组吸为NGR1防治心血管疾病提供参考依据。

材料和方法

材料人脐静脉内皮细胞系(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs,h055)购于南京BERKEbiology公司。钙黄绿色(CalceinAM,C2012)购于上海Beyotime公司。NGR1(HY-N0615)购于美国MedChem-Express公司。结晶紫(HT90132)、二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO,D2650)购于美国Sigma公司。CCK-8(CK04)购于日本DOJINDO公司。Transwell小室(3422)购于美国康宁公司。兔抗人B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2，#3498)、Bcl-2相关X蛋白(Bax，#14796)多克隆抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，#4083)购于美国CST公司。兔抗人Cleaved-caspase-3(ab49822)多克隆抗体以及Dylight594驴抗兔二抗(ab96921)均购于美国Abcam公司。

方法

细胞培养、处理以及分组HUVECs使用高糖完全培养基(含10%FBS以及100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)培养，待细胞密度长至80%～90%时，用PBS将细胞培养液清洗干净后，加入含0.02%EDTA的胰酶消化细胞。待细胞全部脱壁漂浮后，加入3倍体积的完全培养基中和胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清液，用完全培养基重悬HUVECs，将细胞浓度调样品每次含有3个复孔，实验重复3次。

细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3)表达检测采用Westernblot法。各组HUVECs用RIPA裂解液裂解后，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度并配平每组蛋白的上样量。配制蛋白样品时保证20μl样品中含30μg蛋白;12%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，用5%脱脂牛奶常温封闭2h。随后将PVDF膜放入相应的抗体孵育盒中(Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3抗体按1∶1000的比例稀释)，在4℃摇床上孵育过夜;一抗孵育结束之后，将PVDF膜用TBST漂洗3次，5min/次，再将PVDF膜转入HRP结合的二抗孵育盒，放于摇床上，室温孵育2h后再用TBST漂洗3次，5min/次;二抗孵育结束之后，将ECL显色液均匀敷在膜上，在凝胶成像仪上曝光成像，并用ImageJ软件分析计算各组蛋白条带的灰度值。

细胞凋亡检测采用免疫荧光法。将上述细胞悬液接种于24孔板中(500μl/孔)。待细胞完全贴壁后，向各孔中分别加入15、30μmol/LNGR1预处理48h，然后再用ox-LDL50mg/L刺激24h。随后用4%多聚甲醛固定HUVECs15min，0.1%Triton通透15min，5%山羊血清封闭2h，最后将Cleaved-caspase-3一抗

(1∶200)稀释，加入到各个孔中，4℃冰箱孵育过夜。第天取出24孔板，37℃复温1h后，吸净一抗，并用PBS清洗3次，5min/次，随后加入驴抗兔Dylight594表1不同浓度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比较二抗(1∶300稀释)，37℃孵育1h后，吸净二抗，并用PBS清洗3次，5min/次，最后加入DAPI染核5min，应用抗荧光淬灭剂封固。在荧光显微镜下观察染色的细胞(即凋亡细胞)，通过ImageJ软件分析并计算各组不同视野下的Cleaved-caspase-3的平均荧光强度。

将HUVECs经15、30μmol/LNGR1预处理48h及ox-LDL50mg/L刺激24h后，用胰酶消化并用完培重悬每组细胞。随后每组细胞悬液中加入钙黄绿素染色工作液，37℃孵育30min。孵育结束后，1000r/min离心5min，吸除上清液，缓慢加入37℃预热的培养基重悬细胞。再次以1000r/min离心5min，以充分去除残留的染色液。最后将钙黄绿素标记的HUVECs接种于预包被人纤维连接蛋白1μg/ml的培养板中，37℃孵育30min，然后用PBS清洗3次，5min/次，将未贴壁的HUVECs洗净。在倒置荧光显微镜下观察并计数5个随机视野。

1.3统计学处理采用GraphpadPrism5.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

不同浓度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比较与对照组相比，NGR1治疗组HUVECs的增殖活性逐渐提高，差异有统计学意义(P<0.05);HUVECs的增殖活性随着NGR1浓度的增加而增加，在30μmol/L时达到高峰，随后增加NGR1浓度至60μmol/L时，HUVECs的增殖活性反而出现少许下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

不同浓度NGR1作用后ox-LDL诱导HUVECs增殖活性的比较与对照组相比，损伤组的细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与损伤组相注：NGR1为三七皂苷R1;HUVECs为人脐静脉内皮细胞系;ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白;与对照组比较，*P<0.05;与损伤组比较，△P<0.05;与ox-LDL+15μmol/LNGR1治疗组比较，▲P<0.05各组细胞凋亡相关蛋白表达的比较与对照组比较，损伤组凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase-3的表达明显上升(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达明显下降(均P<0.05);而与损伤组比较，NGR1治疗组中Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著下降(均P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达明显上升(P<0.05)，且凋亡相关蛋白皆呈浓度依赖性，见图1和表3。

各组细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达的比较与对照组比较，损伤组HUVECs内凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达增强，而在NGR1治疗组中，这种情况得到明显改善，凋亡相关蛋白Cleaved-cas-pase-3表达显著减弱，见图2(插页)和表4。

各组细胞迁移能力的比较与对照组比较，损伤组HUVECs的细胞迁移能力显著降低，差异有统计学意义(P<0.05);与损伤组比较，NGR1治疗组HUVECs线粒体途径中发挥了极为重要的调控作用。Bcl-2、Bax蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜的通透性改变的重要调控因素，其过度表达能控制其下游caspase-3蛋白酶的活化，介导细胞的存活或死亡[12]。因此caspase-3被认为是细胞凋亡发病机制中的关键酶。当全长caspase-3(32kD)被激活时，它被切割形成两个成熟亚基：p17(17kD)和p12(12kD);进而Cleaved-caspase-3水平代表活化的caspase-3水平[13-14]。所以，检测内皮细胞的凋亡水平是衡量ox-LDL对细胞影响的有效方法。本研究发现ox-LDL可以显著诱导HUVECs凋亡，而NGR1的干预可以明显缓解其凋亡的发生，并且可以改善内皮细胞的黏附和迁移能力。

三七是五加科植物的一员，作为传统中药已有数千年的历史，特别是根茎常被临床用来维持人体微环境稳态，并用于治疗心血管系统、神经系统以及代谢相关疾病[15-17]。其中NGR1是三七中发挥最主要药理学效益的生物活性物质[16]。近年来，越来越多的证据表明，NGR1具有多种生物活性，包括心血管保护[8]、神经保护[18]和抗肿瘤[19]。本研究选取人正常内皮细胞HUVECs为实验材料，通过ox-LDL诱导建立内皮细胞凋亡模型，通过CCK-8检测初步探讨NGR1是否具有拮抗由ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡的功能。本研究结果表明，NGR1可以发挥抗凋亡的作用，保护内皮细胞，增加其细胞增殖活性，减少caspase-3的激活。为了探索存活下的内皮细胞功能是否完整，本研究进行了细胞迁移和细胞黏附实验，结果显示HUVECs用NGR1治疗后，显著改善了由ox-LDL造成的内皮细胞功能的减退，提高了HUVECs的黏附和迁移能力。