施氏假单胞菌对玉米根际固氮效果及促生长作用的研究

摘要:非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际，在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌，接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系，利用突变型泌铵固氮菌株(1568/pVA3)和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系，并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析，结果表明:固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照，但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后，植株生物量较施肥处理提高25.5%，全氮含量较不接种对照增加39%，15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8g·株-1;接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%，生物固氮量为0.64g·株-1。研究结果表明，通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量，据估算每公顷可节省化肥约23%，而对照体系为7.5%。

关键词:固氮施氏假单胞菌A1501;氮高效利用玉米;根际联合固氮;生物固氮效率;15N稳定性同位素稀释法

氮素是土壤中的主要养分限制因子之一，氮肥投入是农业高产的必要途径[1]。中国已成为世界上较大的化肥生产国和消费国之一，导致我国氮肥过度使用的一个重要原因是我国农作物氮肥利用效率普遍不高[2]。由于化肥利用率较低，氮肥通过挥发和淋溶等途径损失数量巨大，引起如温室气体排放、水体富营养化等一系列环境问题[3-4]。面对人口压力，中国农业在未来发展中面临着既要保持高产，又要减少农田面源污染的双重挑战，如何提高氮肥利用率并降低农业生产中对氮肥的依赖，对于我国粮食安全和节能减排的可持续发展战略都具有十分重要的意义。

植物根际是宿主植物和微生物相互作用的主要活动区[5]，生存于植物根际的促生菌能直接或间接地促进或调节植物生长[6]。联合固氮菌属于植物促生菌的范畴，广泛存在于非豆科植物(玉米和水稻等)根际，与宿主作物形成一个复杂的根际固氮体系[7-8]。联合固氮菌促进植物生长的机理分为直接作用和间接作用。直接作用通过生物固氮为植物提供氮素、产生植物激素或产生铁载体和各类维他命物质以及通过磷元素的增溶作用来促进植物生长[9]。间接作用是通过诱导植物产生植物激素、改善植物对矿物质的利用率、抑制植物病原体或诱导植物产生拮抗物质等来促进植物生长。因此，通过根际联合固氮作用为农作物提供氮源、部分或完全替代化学氮肥，是农业生产中最经济、最环保和最高效的氮素供应方式。鉴于联合固氮作用在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力，以联合固氮菌为有效菌种并开发研制的微生物肥料已经广泛应用在田间接种。

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501分离自我国南方水稻根际，属于模式根际联合固氮菌，具有高效固氮活力和根际定殖优势[10]。已有研究表明，野生型A1501能够显著促进水稻和玉米的生长，并通过生物固氮为宿主植物提供氮素[11-12]。但是野生型的根际联合固氮受环境因素影响大，具有固氮效率不高和田间接种不稳定等缺陷。针对这些缺陷，可采取如下策略:一方面应用基因工程构建耐铵、泌铵型联合固氮菌，将固定的铵分泌出菌体外;另一方面通过分子遗传学手段获得转基因氮高效利用玉米品系改良作物对铵的吸收效率，通过微生物-植物相互作用建立根际高效固氮体系，进一步探究根际固氮与植物促生效果的相互关系，实现微生物高效固氮和植物高效利用氮。因此，本研究利用转基因氮高效利用玉米和固氮施氏假单胞菌野生型及泌铵工程菌构建高效固氮体系，在温室条件下评价固氮菌株对玉米的促生效果，并利用15N稳定性同位素稀释法测定根际生物固氮量，以期为完善根际高效联合固氮体系构建，促进农田生态系统的良性发展以及微生物肥料开发提供理论依据。

材料与方法

供试菌株及活化固氮施氏假单胞菌A1501具有高效固氮能力，属于革兰氏阴性菌，菌体呈杆状[13];在野生型A1501铵转运载体基因amtB1/amtB2双缺失突变株及固氮酶的正调节基因nifA组成型质粒pVA3集培养过夜的菌株，经0.85%的NaCl溶液洗涤菌体2次，转接至A15培养基中[15]，调整初始OD至0.1，30℃、200r·min-1振荡培养，每隔2h取样基础上，通过三亲接合方法[14]获得泌铵工程菌测定菌株的OD，绘制生长曲线。

1568/pVA3;突变株1502为对照菌株，其敲除了固氮功能基因nifH，丧失固氮能力，以上菌株均为本实验保存。

1.2.2固氮酶活性测定取10mL过夜培养的菌液，6000r·min-1离心10min，再使用0.85%的NaCl溶液悬浮洗涤菌体沉淀2次，取1mLOD600为1.0的菌液转接至装有9mLA15无氮源培养基的三角瓶中，初始OD600为0.1，体积为10mL。盖上胶塞，密封瓶口，充氩气4min用以排出三角养至OD1.0。菌液6000r·min-1离心10min，瓶中的空气。向瓶中注入0.5%的氧气和10%的弃上清液后用等量0.8%生理盐水重悬备用。

供试菌株生理活性测定

菌株培养挑取待测菌株接种于含对应抗生素的LB液体培养基中，30℃、220r·min-1振荡培养过夜。4℃、4000r·min-1离心10min收乙炔。实验设置4个重复，30℃、220r·min-1振荡培养。每隔2h用微量进样器从瓶中抽取250μL气体注入气相色谱仪中(SP-2305型气相色谱仪)检测乙烯含量，记录乙烯峰面积，利用公式计算固氮酶的活性。

1.2.3固氮菌株泌铵能力测定挑取待测菌株接种于含对应抗生素的LB液体培养基中过夜培养，菌株离心收集后转至10mLA15液体培养基中，调整初始OD600为0.1。菌液在固氮条件下培养72h后收集上清液利用酶标仪(MolecularDevicesFlexstaion3，美国)测定铵离子浓度[16]。实验设置4个重复。

玉米品系

转基因氮高效利用玉米品系与对照普通玉米品系的种子由吉林省农业科学院提供。转基因氮高效利用玉米品系通过转ZmAMT1.1基因改良铵盐高效吸收过程，提高玉米植株对氮素的吸收效率[17]。将编码氨转运蛋白的目的基因ZmAMT1.1和抗除草剂草铵膦筛选基因bar构建到pCAMBIA3300-ZmAMT1.1-bar表达载体上，以玉米Hill为受体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化法获得转基因玉米。利用除草剂筛选、PCR、RT-PCR、Southernblot等技术验证目的基因插入玉米基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。该玉米品系进入农业部中间试验阶段，中间试验批文号为农基安办报告字(2019)第122号。

菌株接种

试验在吉林省农业科学院温室(公主岭)进行。接种固氮菌设置5个处理:泌铵工程菌1568/pVA3、野生型菌株A1501、nifH基因突变菌株1502以及50mgN·kg-1土施氮处理和不接种处理对照，接种和不接种对照均不施加氮肥;玉米品种包括2个处理(转基因高效利用品系和对照品系);试验设置8个重复。

将玉米种子在无菌水中浸泡清洗30min后转移至5%NaClO溶液中浸泡1min，在75%乙醇中处理2min，最后用无菌水清洗5次。表面消毒后的种子分别放入准备好的菌悬液以及灭菌的野生型悬浮液(不接种对照)浸泡30min。将浸泡后的玉米种子放入装有2.5kg土壤基质(Klasmann-Deilmann)的塑料盆中(内径20cm、高20cm)，每盆4颗种子，每组8个重复。玉米出苗后间苗至2颗·盆-1，玉米生长周期内按照正常管理。种植60d后分别测定玉米地上和地下部生长量。

生物固氮量测定

试验开始前两周将15N稳定性同位素标记的硫酸铵(浓度为50mgN·kg-1土壤，丰度为10%)加入土壤中并充分混合待用。经菌液浸泡后的玉米种子放入盆装土壤中。栽培60d后取部分根系及茎叶烘干至恒重，研磨过100目筛后，经稳定性同位素质谱(同位素分析仪-稳定性同位素质谱仪联用，中国农业科学院农业环境与可持续发。

1.6数据与分析

正常施氮量(187.5kgN·hm-2)试验数据包括玉米的株高、株重、根重及稳定性同位素分析数值处理均利用SPSS20.0软件(IBM，美国)进行统计分析。

结果与分析

固氮菌株生长曲线分析

三株待测菌株的生长曲线(图1)表明，固氮施氏假单胞菌野生型A1501、泌铵菌1568/pVA3和nifH基因突变株1502在LB培养基中长势基本一致，均在2h后进入对数生长期，在8～10h时到达平台期。

固氮菌对玉米生长的影响

玉米生长第60d采集地上和地下部测定植物生物量，包括株高、株重和根系重量，结果表明，固氮施氏假单胞菌接种显著提高了玉米的生物量(表1，图4)。固氮施氏假单胞菌接种氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照。在氮高效利用玉米联合固氮体系中，接种1568/pVA3菌株的植株生物量较施肥处理提高25.5%，较不接种对照提高36.4%;接种A1501菌株的植株生物量较施肥处理提高24.8%，较不接种对照提高35.6%。在对照玉米联合固氮体系中，接种1568/pVA3菌株的植株生物量较不接种增加17.6%，接种A1501菌株后植株生物量较不接种增加20.7%。但是，固氮菌接种处理对氮高效利用玉米和对照玉米植株的总生物量没有显著影响。

接种固氮菌后，氮高效利用和对照玉米品系的株高都显著高于不接种对照(P<0.05)，接种固氮菌后氮高效利用玉米品系的平均株高显著(P<0.05)高于对照玉米品系。对于氮高效利用玉米品系，接种野生型A1501和泌铵菌1568/pVA3后玉米平均株高分别达到131和126cm，而接种nifH突变株1502和施氮处理的玉米平均株高约124cm，均显著高于不接种处理(P<0.05)。对于普通玉米品系，接种固氮菌株和施氮处理的玉米株高约为122cm，也均显著(P<0.05)高于不接种处理。

玉米根系发育结果(表1)显示，两个玉米品系在相同处理条件下接种野生型A1501、泌铵菌1568/pVA3和nifH突变株1502的玉米植株根系重量均显著高于不接种对照。

15N稀释法测定固氮菌株对玉米根际固氮量影响利用15N稀释法对接种至玉米根际固氮菌的固氮能力进行评价，结果(表2)表明，野生型和泌铵固氮菌接种都显著提高了玉米植株的全氮含量(N%)、植株15N原子百分超、固氮百分率和固氮量。