鲍曼不动杆菌 (Ab) 属于一种非发酵型葡萄糖、革兰染色呈阴性且无动力型的双球菌或者球杆菌, 广泛的存在于人体与自然界当中[1]。鲍曼不动杆菌是一种重要的院内感染病原菌, 可导致院内感染流行性爆发[2]。为积极预防流行性感染及临床合理用药, 本院对Ab耐药性及其基因特征进行深入分析, 现将详细情况总结如下。
本次研究所用鲍曼不动杆菌为2011年1—12月间从本院临床血液、痰液、尿液等标本中分离获取的非重复菌株, 挑选其中的30株。标准菌株为铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 与大肠杆菌 (ATCC25922) 。
采用法国梅里埃公司的VITEK TWO细菌鉴定系统, 专用试剂, MH、血培养基Oxoid公司出品, 药敏纸片使用英国Oxoid公司产品, PCR检测使用美国PE公司出品的PCR仪, 电泳使用Bio-Rad公司出品电泳仪, 成像系统采用英国UVI凝胶成像分析系统, Premix Taq酶与DNA Marker DL2000均为Takapa公司产品。引物基因序列设计由引物搜索软件Oligo-6.0完成, 共设计4对引物分别为OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58, 产物长度分别为501 bp、246 bp、353 bp、599 bp, 均由上海英骏生物技术有限公司合成。
Ab标本的采集与分离严格依照第3版《全国临床检验操作规程》执行[3]。
采用K-B纸片扩散法检测耐药性, 试验操作与结果观察均依据美国临床实验室2010年标准化研究所 (CLSI) 制定的相关判断标准执行。取耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的菌株接种于血平皿上, 孵育18～24 h, 取数个菌落入EP管中, 加入150μL灭菌蒸馏水, 煮沸10 min即时于4℃条件下冷却, 以12000 r/min离心5 min后取上清液制备为PCR试验模板, 于-20℃条件下储存备用。以PCR扩增法对碳青霉烯类的OXA基因进行检测, 加入25μL的Premix Taq酶体系, 上下游引物分别1μL, 10μL模板DNA, 以ddH2O定容至50μL, 循环参数设置为94℃、预变性为5 min、94℃变性为45 s、52℃退火45 s后于72℃下延伸1 min, 如此循环35次后于72℃下延伸10 min, 取5μL的PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶行电泳分析。DNA序列分析, 将PCR产物由上海英骏生物公司行纯化与双向测序, 测序结果于GenBank中行blast比对, 采取同源分析确定具体基因类型。
全部菌株中对多黏菌素B耐药率最低为8.2%, 对菌必治与亚胺培南的耐药率最高为100%。见表1。
23株 (79.2%) OXA-23引物的扩增结果呈阳性 (图1) , PCR产物双向测序后确定的OXA-23具体序列号为GQ849192, 99%鲍曼不动杆菌同源;20株 (66.7%) OXA-51引物的扩增结果呈阳性 (图2) , PCR产物双向测序后确定的OXA-51具体序列号为GQ525851, 98%鲍曼不动杆菌同源;30株菌株扩增均未见OXA-24与OXA-58型的基因。
鲍曼不动杆菌是院内感染中一项重要致病病原菌, 目前其在革兰阴性杆菌导致的感染中的分离率已经超过铜绿假单胞菌[4]。近些年来随着广谱抗生素的广泛使用, 鲍曼不动杆菌的耐药性也日益提高, 显现为泛耐药菌株的爆发性流行[5]。碳青霉烯类的抗生素有着更为高效、广谱的抗菌作用。但新型抗菌药物的出现也导致了细菌耐药性的提高。近些年来关于鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的病例日益增多, 且感染后的预后较差。
该研究结果表明鲍曼不动杆菌对于亚胺培南耐药, 并且对其他临床中常用的广谱抗菌药物均有较高的耐药率, 对于庆大霉素、妥布霉素、头孢吡肟、复方新诺明等的耐药率均达到90%以上, 这为临床抗带来了极大的压力。不动杆菌对于碳青霉烯类抗生素耐药的机制十分复杂, 主要是通过生成碳青霉烯酶发挥耐药作用, 碳青霉烯酶是一类能够水解亚胺培南或者美罗培南的β-内酰胺酶, 主要包括Ambler分子中的A、B、D三种酶, D类酶可分为4组, 第1组OXA-23包括23、49、27, 同源性达99%;第2组OXA-24包括25、26、40同源性达98%;第3组OXA-51包括51、69属天然产生;第4组OXA-58与上述3组同源性达50%。该研究结果表明OXA-23类基因的检出率高达79.2%, OXA-51类基因的检出率达66.7%, 未见OXA-24与OXA-58类基因。
综上所述, 鲍曼不动杆菌对临床中多数常用的碳青霉烯类抗生素均有较高的耐药性, 因此对鲍曼不动杆菌进行定期耐药监测并据此选用抗生素对临床抗菌治疗具有重要意义。
摘要：目的 探讨分析鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其基因特征, 为临床合理应用抗生素提供科学依据。方法 使用法国梅里埃公司的VITEK TWO细菌鉴定系统进行菌株鉴定, 以K-B法行耐药试验, 使用碳青霉烯酶的4种基因特异型引物对鲍曼不动杆菌行基因型分析及聚合酶链反应 (PCR) 扩增, 通过GenBank比对确认编码酶基因的具体类型。结果全部菌株中对多黏菌素B耐药率最低为8.2%, 对菌必治与亚胺培南的耐药率最高为100%。结论 耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌对于多黏菌素的耐药性最低, 其次对丁胺卡那霉素的耐药性较低;主要携带OXA-23型的碳青霉烯酶基因, 应提请临床广泛关注。
关键词：鲍曼不动杆菌,碳青霉烯类抗生素,耐药性,基因
[1] 张玲玲, 胡俊锋, 李峰, 等.多耐药鲍曼不动杆菌耐药性分析和部分耐药基因检测[J].中华临床医师杂志 (电子版) , 2012, 6 (15) :116-119.
[2] 侯明玖, 曾明, 侯玲俐, 等.多重耐药鲍曼不动杆菌耐消毒剂、灭菌剂基因研究[J].长江大学学报自然科学版:医学卷, 2012, 9 (4) :62-64.
[3] 严冰, 韩艳萍, 张代惠, 等.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌医院感染监测分析[J].实验与检验医学, 2012, 30 (4) :327-329.
[4] 佘婷婷, 沈继录, 徐无宏, 等.广泛耐药鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素膜蛋白机制研究[J].中国感染与化疗杂志, 2012, 12 (4) :280-284.
[5] 杨均均, 黄文祥, 史芳静, 等.耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌流行特征及耐药基因分析[J].中国抗生素杂志, 2012, 37 (5) :343-347, 391.
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