论文题目：血卟啉单甲醚光动力治疗鲜红斑痣的临床研究及3D皮肤等效物疾病模型的构建
摘要：第一部分影响血卟啉单甲醚光动力治疗鲜红斑痣有效性和安全性的临床因素分析背景:鲜红斑痣（Port-Wine Stain,PWS）的治疗对皮肤科医生来说是一个挑战,在大多数情况下,脉冲染料激光治疗并不能完全清除皮损。目前血管靶向的血卟啉单甲醚光动力疗法（HMME-PDT）已成为一种很有前景的治疗鲜红斑痣的替代方案。目的:分析性别、年龄、皮损类型和Fitzpatrick皮肤分型等临床因素与HMME-PDT治疗鲜红斑痣的有效性和安全性之间的相关性,为临床治疗提供一定的依据和参考。方法:回顾性分析我科2017年3月～2020年6月接受HMME-PDT的239例PWS病例资料,均随访6月。所有患者静脉泵入HMME（5 mg/kg）,遮盖正常皮肤,药物输入10分钟后将皮损暴露于532 nm LED绿光下,照射功率密度80-100 m W/cm~2。每个光斑（10×10 cm~2）照射20-25分钟,由皮肤科医生根据患者治疗前与随访后经VISIA照片对比评价临床疗效,疗效按照基愈、显效、好转和无效进行评判。疼痛评分采用视觉模拟评分法（Visual Analogue Score,简称VAS）:0分（无疼痛）;1-3分（轻度疼痛）;4-6分（中度疼痛）;7-10分（重度疼痛）,并记录术后的不良反应（包括厚痂、薄痂、色素沉着、色素减退、光毒性反应等）。根据患者性别、年龄、皮损类型、Fitzpatrick皮肤分型、皮损部位、皮损面积、既往有无PDL治疗、术后即刻反应进行分类,通过Pearsonχ~2test和Fisher’s exact test统计学方法分析上述临床因素对疗效、疼痛评分和不良反应的影响。结果:（1）疗效:基愈50例（20.9%）,显效111例（46.4%）好转48例（20.1%）,无效30例（12.6%）,总有效病例数（基愈+显效+好转）为209例（87.4%）;与疗效良好相关的临床因素包括女性、粉红型和紫红型皮损类型、Fitzpatrick皮肤分型Ⅲ型、皮损位于头颈部、皮损面积≤40cm~2以及术后即刻出现苍白水肿和紫癜现象（p＜0.05）。（2）疼痛评分:重度97例（40.6%）,中度65例（27.2%）,轻度50例（20.9%）,无疼痛27例（11.3%）;与重度疼痛相关的临床因素包括男性、年龄5岁以上、皮损位于头颈部、皮损面积＞40cm~2以及术后即刻出现颜色加深变暗（p＜0.05）。（3）不良反应:出现不良反应46例（19.2%）,未出现不良反应193例（80.8%）;不良反应包括厚痂8例,薄痂30例,色素沉着5例,色素减退1例,光毒性反应2例,均在治疗后3-6月内恢复正常;与不良反应发生相关的临床因素包括粉红型和增厚结节型皮损类型以及既往有治疗史（p＜0.05）。结论:HMME-PDT治疗鲜红斑痣是安全有效的,同时,其有效性和安全性受多种临床因素的影响,该研究结果为PWS患者的合理化和个体化治疗提供了依据,有利于实现最安全的体验和最优化的疗效。第二部分皮肤镜血管模式与血卟啉单甲醚光动力治疗鲜红斑痣疗效的关系背景:HMME-PDT是一种新颖且有效的PWS治疗策略,同时,其有效性和安全性受多种临床因素的影响,为PWS患者的合理化和个体化治疗提供了参考。但是考虑到PDT的治疗经济成本高等缺点,如何精准筛选出符合HMME-PDT治疗适应症的PWS候选人一直是临床问题,为患者提供无创皮肤镜检测,来预判疗效是很重要的,但目前关于皮肤镜的PWS血管模式预测光动力疗效的报道较少。目的:分析皮肤镜的PWS血管模式分型在预测HMME-PDT的疗效中的作用。方法:我们在2019年1月10日至2019年12月11日期间开展了一项前瞻性研究,纳入我院皮肤科门诊诊断为PWS的163例患者,均接受2次HMME-PDT,治疗间隔为两个月,治疗全部结束后随访6个月。3名皮肤科医生预先设立8种PWS皮肤镜的血管模式分型,由同一位研究人员分别在患者治疗前后采集图像,使用皮肤镜和VISIA系统记录PWS血管模式和皮损图像。由另外4名皮肤科医生通过VISIA图片评估治疗前后的疗效,并分析皮肤镜的血管模式与HMME-PDT疗效的关系。结果:皮肤镜观察PWS患者的血管模式分型发现,HMME-PDT对具有点球状（25例,15.3%）、短棒状（30例,18.4%）以及弯曲状（21例,12.9%）,这三种血管模式的患者疗效最佳;在血管模式为围绕褐色点的苍白圈（13例8.0%）和树枝状（16例,9.8%）的患者中HMME-PDT治疗PWS的疗效中等;而具有混合型（21例,12.9%）、灰白幕（19例,11.7%）以及网状（18例,11.0%）这三种血管模式的患者接受HMME-PDT后疗效差或无效（p＜0.05）。结论:HMME-PDT治疗PWS的疗效和皮肤镜血管模式有明确的相关性,因此在PDT治疗PWS前,皮肤镜检查可提供非常有用的临床信息。皮肤镜不仅呈现了PWS的血管模式,还有助于预测HMME-PDT的疗效,有效地管理患者的期望值。第三部分3D全层皮肤等效物疾病模型构建及药物作用机制的探索背景:临床中我们发现皮肤镜血管模式对预测疗效有意义,故在体外构建相关疾病模型,探索治疗后PWS血管损伤情况具有重要的研究价值。目前尽管动物和细胞模型为疾病提供研究平台,但物种差异性和缺乏人体皮肤复杂生理的微环境,仍然是PWS疾病研究的瓶颈问题。因此,构建一个能够模拟人体生理条件,与鲜红斑痣特性相似的体外3D模型是十分必要的。目的:基于皮肤组织工程学,在体外构建3D全层皮肤等效物的鲜红斑痣疾病模型,初步探索不同药物治疗后PWS血管损伤和作用机制。方法:将从包皮中分离出来的正常人成纤维细胞（normal human dermal fibroblasts,NHDFs）与正常人毛细血管内皮细胞（human dermal microvascular endothlial cells,HDMECs）以数量比1:1混合均匀后接种到皮肤模型支架上,连续培养28天,得到成熟的3D真皮等效物（dermal equivalent,DE）后,第一部分实验分组如下:空白对照组、PWS模型组。在第二部分实验中,我们将正常人角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes,NHEK）接种到成熟的3D真皮等效物上,并维持气液相培养14天,得到3D全层皮肤等效物模型（full-thickness skin equivalent,SE）后,处理分组如下:空白对照组、PWS模型组、低浓度雷帕霉素（Rapamycin,RA）组、高浓度RA组、低浓度咪喹莫特（Imiquimod,IM）组、高浓度IM组以及DMSO组。其中空白对照组仍使用常规培养基继续培养,致病因子组为加入VEGF-A、FGF、MMP-2、MMP-9（均50 ng/ml）的常规培养基连续培养7天。制作石蜡切片后进行HE染色,在显微镜下观察组织形态,用免疫组化和免疫荧光CD31等特异性染色,研究人毛细血管内皮细胞的p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-JNK表达,以及3D模型中类毛细血管结构的形成情况。结果:（1）DE（3D真皮等效物）免疫组化染色结果表明:与空白对照组相比,PWS模型的人毛细血管内皮细胞p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-JNK表达显著增强（p＜0.05）;DE的CD31免疫荧光染色结果表明:PWS模型组血管密度和血管直径显著高于空白对照组（p＜0.05）。（2）SE（全层皮肤等效物模型）免疫组化染色评分结果表明:与空白组相比,PWS模型组的人毛细血管内皮细胞p-PI3K、p-AKT、p-ERK和p-JNK表达显著增强（p＜0.05）。PWS模型组与RA处理组相比,RA 10μg/ml和RA 20μg/ml处理后p-PI3K、p-AKT表达均降低（p＜0.05）其余组间未见变化（p＞0.05）;PWS模型组与IM处理组相比,IM 10μg/ml和IM 20μg/ml处理后人毛细血管内皮细胞p-JNK表达均降低（p＜0.05）,其余组间无明显差异（p＞0.05）。SE（全层皮肤等效物模型）CD31免疫荧光染色结果表明:PWS模型组血管密度和血管直径高于空白对照组（p＜0.05）。RA 10μg/ml和RA 20μg/ml处理组的血管密度和血管直径均明显低于PWS模型组（p＜0.05）,RA不同浓度组间无差异（p＞0.05）;IM 10μg/ml和IM 20μg/ml处理后,血管密度均明显降低（p＜0.05）,但IM 10μg/ml处理组的血管直径与PWS模型组无显著性差异（p＞0.05）,IM 20μg/ml处理组的血管直径和密度明显低于PWS模型组（p＜0.05）和IM 10μg/ml（p＜0.05）。DMSO处理组的血管密度和血管直径与PWS模型组相比无明显变化（p＞0.05）。结论:本研究在体外成功构建了类鲜红斑痣3D真皮和全层皮肤等效物模型,该模型可作为PWS病理生理和复杂结构的研究平台,该疾病模型构建成功,可为新型药物的测试和治疗技术的筛选带来便利。
关键词：血卟啉单甲醚光动力疗法;鲜红斑痣;有效性;疼痛评分;安全性;临床因素;血管模式;光动力疗法;疗效;皮肤镜;3D皮肤等效物;雷帕霉素;咪喹莫特
学科专业：皮肤病与性病学
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ABSTRACT
前言
第一部分 影响血卟啉单甲醚光动力治疗鲜红斑痣有效性和安全性的临床因素分析
引言
材料与方法
结果
讨论
第二部分 皮肤镜血管模式与血卟啉单甲醚光动力治疗鲜红斑痣疗效的关系
引言
材料与方法
结果
讨论
第三部分 3D全层皮肤等效物疾病模型构建及药物作用机制的探索
引言
实验材料与方法
结果
讨论
不足与展望
全文结论
参考文献
综述 无创检测技术在鲜红斑痣治疗中的应用现状
参考文献
附图表
附录三:血卟啉单甲醚光动力疗法鲜红斑痣的临床研究受--试者知情同意书
致谢
