摘要：将药物的合成与结构鉴定结合起来，设计了那格列奈的合成与鉴定综合实验。通过缩合、水解反应制备得到那格列奈，利用数字熔点仪、紫外光谱仪、红外光谱仪、核磁共振仪、高分辨质谱仪等仪器对那格列奈的结构进行了解析与鉴定。该实验项目涵盖知识点较多，有利于培养学生的综合科研实验素质，能够为今后的毕业设计及后续的科学研究工作创造条件。
关键词：那格列奈;药物合成;药物鉴别;药学综合实验设计
“药学综合实验”是我院制药工程专业重要的综合性实验课程。为丰富实验内容，对现有陈旧实验教材内容进行更新，使之更符合专业培养方案对新颖性和实用性的要求，我们选取“那格列奈的合成与鉴定”作为本课程的实验项目，目的是将基础实验与科研项目和新技术有机结合，将药物合成反应、药物化学、仪器分析、波谱分析等学科内容，以综合性、系统性、一体化实验形式体现出来，使本科实验教学从以验证性为主过渡到以设计性、应用性和综合性为主，使学生在解决复杂问题过程中提升分析和解决问题的能力[1-3]。
那格列奈是一种促胰岛素分泌剂，主要用于II型糖尿病治疗，具有结构新颖、作用机理独特、降糖作用明显等特点，在国内外受到广泛关注[4-5]。目前，国内外文献专利[6-7]报道的那格列奈合成方法大多以对异丙基苯甲酸为起始原料，经过催化氢化[8]、酰氯化，再与D-苯丙氨酸缩合及碱水解后得到终产品。催化氢化的催化剂成本较高[9-10]，且有时需要在高温高压下进行，对于本科实验教学的安全性及环保性是巨大挑战。本文探索了较温和的合成路线[11-12]，在增强实验安全性的同时提高了实验的成功率。此外，由于受基础本科教学实验室仪器资源的限制，对此类合成反应的产物一般只做熔点测定以确认合成结果，欠缺关于其结构主要表征的实验内容。本文依托我院的大型精密仪器检测平台，对终产物的红外光谱、紫外光谱、高分辨质谱、核磁共振氢谱等进行了分析测定，锻炼了学生对大型精密仪器的操作技能，使学生掌握了各种分析方法的基本原理和谱图特征，培养并提高了学生的识谱能力，能够为后续毕业设计及科研工作奠定良好基础。
实验原理
那格列奈为苯丙氨酸衍生物，作为一种新型血糖调节剂，可在口服后迅速达到降糖作用，适用于Ⅱ型糖尿病病人改善餐后血糖水平。因其作用持续时间短，可避免在两餐之间发生低血糖反应。相对于第一代产品瑞格列奈，那格列奈起效更快，作用时间更短，副作用更低，效果更优。
本实验以D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐与反式-4-异丙基环己基甲酸为反应原料，以二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂进行缩合反应，然后在碱性条件下水解得到那格列奈(见图1)。
实验方案
试剂与仪器
D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(98%)、反式-4-异丙基环己基甲酸(98%)、二环己基碳二亚胺(98%)，均购自阿拉丁公司;二氯甲烷、氢氧化钠、无水硫酸镁、丙酮、盐酸、甲醇、乙醇、溴化钾、氘代氯仿、乙腈，均为分析纯，均购自国药集团化学试剂。
磁力搅拌器(DF-101S，郑州长城科工贸有限公司);旋转蒸发仪(RE-52A，上海亚荣生化仪器厂);数字熔点仪(WRS-1B，上海仪电物理光学仪器有限公司);紫外分光光度计(UV-3600Plus，日本岛津公司);傅里叶变换红外光谱仪(IRAffinity-1S，日本岛津公司);核磁共振仪(AVⅢ-400MHz，德国布鲁克公司);离子阱飞行质谱仪(XevoG2，美国沃特世公司)。
那格列奈的合成中间体3的制备。在磁力搅拌器上，安装配有温度计、恒压滴液漏斗、磁性搅拌子的三颈瓶
(250mL)，投入D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(原料1，12.9g，0.06mol)和二氯甲烷(60mL)，搅拌状态下加入三乙胺(8.3mL，0.06mol)，冰浴冷却至0℃，随后一次性加入反式-4-异丙基环己基甲酸(原料2，10.3g，0.06mol)，冰浴继续搅拌15min。将DCC(15g，0.07mol)溶于二氯甲烷(30mL)，由恒压滴液漏斗逐滴加入，维持反应温度在5℃以下，加料完毕后，继续在5℃以下反应20min。移走冰浴，在室温继续反应4h后，抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤(30mL，2次)，合并滤液及洗液，所得溶液用10%NaOH溶液洗涤(300mL，3次)，有机相再用水洗至水相呈中性。有机相用无水MgSO4干燥，旋转蒸发仪浓缩得到固体，即为中间体3。
那格列奈粗品的制备。将中间体3溶于50%丙酮水溶液(300mL)中，冰浴冷却，由恒压滴液漏斗滴加4%NaOH溶液(55mL)，维持反应温度在10℃以下，滴加完毕后移走冰浴，室温反应16h。抽滤，除去不溶物，在搅拌状态下滴加7.3%的盐酸，调pH至2，冰浴冷却1h，抽滤，滤饼水洗至中性，得那格列奈粗品。那格列奈的精制。将那格列奈粗品用5倍量甲醇水溶液(甲醇/水=4/1，V/V)重结晶得精品，将精品转移至培养皿中，干燥后称重并计算产量和产率。
那格列奈的结构确认
熔点的测定。取那格列奈精制品适量，烘干，研磨，紧实填装于熔点毛细管内，用数字熔点仪测定样品在初熔至全熔时的温度，升温速率为1.0~1.5℃/min，重复测定3次，取其平均值，即得那格列奈的熔点。
紫外光谱分析。取那格列奈精制品适量，加乙醇制成每1mL中约含1mg的溶液，用紫外分光光度计测定在200~400nm的紫外吸收，得那格列奈的紫外光谱图。
红外光谱分析。取那格列奈精制品适量，烘干，将1mg那格列奈与129mg溴化钾置于玛瑙研钵中充分研磨，填装入压片模具中制备溴化钾样片。上述操作过程应于红外灯下进行，以防止样品回潮影响测定结果。将制备好的溴化钾样片置于红外光谱仪样品室，测定得到范围在400~4000cm–1的红外光谱图。
核磁共振分析。取烘干的那格列奈样品10mg，加入1mL氘代氯仿溶解得澄清溶液，将溶液转移至核磁共振测试管中，用核磁共振仪进行氢谱(1H-NMR)测试。
高分辨质谱分析。取那格列奈精制品适量，用乙腈制成10μg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，滤液用高分辨质谱仪检测精确分子量，以确认分子式。
实验结果与分析
熔点
使用WRS-1B型数字熔点仪对制备的那格列奈样品测定初熔及终熔时的温度(见图2)。设定升温速率为1℃/min，平行测定三次，取平均值，熔点为138.1~138.7℃，熔距为0.6℃，符合2015版中国药典要求[13]。说明用该方法合成得到的样品纯度良好，学生在测定熔点时的烘干、研磨及填装操作符合规范。
红外光谱
使用日本岛津IRAffinity-1S傅里叶变换红外光谱仪对制备的那格列奈样品进行400~4000cm–1范围扫描得到红外光谱图(见图4)。从图中可以看出，3300cm–1是酰胺的N-H键的伸缩振动，1651cm–1是酰胺的C==O双键的伸缩振动，1213cm–1是酰胺的C—N键的伸缩振动，说明结构中有酰胺基。3300~2860cm–1是羧酸的O—H键的伸缩振动，1712cm–1是羧酸的C==O双键的伸缩振动，1423cm–1是羧酸的C—O键的伸缩振动，说明结构中有羧酸基。1541cm–1是芳环的骨架振动，700cm–1是芳环的5个氢的C—H面外变角振动，说明结构中有芳环单取代。2929cm–1、2860cm–1为甲基、亚甲基的C—H键的伸缩振动，说明该化合物具有酰胺基、羧基、单取代芳环等，符合那格列奈结构的特征基团，且与药典对照红外光谱图一致[14]。
使用日本岛津UV-3600Plus紫外分光光度计对那格列奈样品在波长为200~400nm的区间内扫描得到紫外光谱图(见图3)。取乙醇溶液进行空白基线扫描，待基线平稳后，将配制的1mg/mL的那格列奈溶液进行测定。由图可见，在252nm、258nm与264nm波长处有特征吸收峰，与2015版药典描述的那格列奈的特征吸收峰相符[13]。
使用德国BrukerAVⅢ-400MHz核磁共振仪对制备的那格列奈样品进行测试，得到那格列奈结构和1H-NMR图谱(见图5和图6)。其中，化学位移δ7.26ppm为氘代氯仿的溶剂峰;δ0.84ppm为一组双重峰(耦合常数为4Hz)，对应8位、9位的六个质子;δ0.90~1.04ppm为一组多重峰，对应1位、2位、6位的三个质子;δ1.35~1.41ppm为一组多重峰，对应3位、5位、7位的三个质子;δ1.75~1.89ppm为一组多重峰，对应2位、3位、5位、6位的四个质子;δ1.99~2.05ppm为一组多重峰，对应4位的一个质子;
δ3.11~3.28ppm为一组多重峰，对应17位的两个质子;δ4.83~4.88ppm为一组四重峰，对应13位的一个质子;δ5.96~5.98ppm为一组双重峰(耦合常数为8Hz)，对应11位的一个质子;δ7.14~7.32ppm为一组多重峰，对应19位、20位、21位、22位、23位的五个质子。除羧基质子因其活泼性高而没有出峰外，其他质子数量及化学环境均与那格列奈结构相符，通过红外图谱的佐证也可证明羧基的存在。
使用WatersXevoG2TOF离子阱飞行质谱仪对制备的那格列奈进行测试，得到高分辨质谱谱图(图7)，结果以质荷比形式表示。理论计算值为C19H28NO3，[M+H]+=318.2069，而实际测得值为318.2065，在理论计算值的误差范围内，与那格列奈分子式相符。由
实验教学讨论
实验教学安排
本综合实验安排48课时，6天完成，可安排在大四上学期或短学期内集中开设。实验前一周公布实验方案，要求学生根据实验方案查阅相关文献，并完成实验预习报告。每班根据具体人数分组，每组3—4人，具体进度安排如下。
第一天：完成中间体3的制备，并将下一步水解反应投料，室温条件下过夜反应16h。第二天：完成水解反应物的后处理，对所得产物进行精制并烘干。第三天：完成熔点的测定、紫外光谱分析及红外光谱分析。第四天：完成核磁共振分析及高分辨质谱分析。第五天：查阅资料，完成图谱解析比对。第六天：组内讨论，归纳总结实验结果，完成实验报告。
教学效果分析
拓宽科研视野，实现学科交叉融合。促胰岛素分泌剂类抗糖尿病药物在经历了早期的第一、二代磺脲类药物后，发展到以那格列奈为代表的非磺脲类药物。本实验以那格列奈为切入点，在引导学生了解糖尿病的发病机理及分型、抗糖尿病药物的发展历史及分类等基础知识的同时，带领学生认识本专业的前沿现状和发展趋势，使学生能够深入了解专业领域，洞察和发现新问题，开拓创新思路，提出解决问题的思路，找到解决问题的方法。在实验过程中，综合运用了有机化学、药物化学、分析化学、仪器分析、波谱解析等课程的知识点，实现了学科之间的交叉融合，有助于提高学生的科研素养与创新能力。
改革实验模式，丰富实验教学手段。传统的药学综合实验着重于药物的合成过程，由于课时数及仪器条件所限，对于所合成的药物仅通过测定熔点来进行鉴定。但药物结构的确认仅通过熔点测定是不够的，所以对实验结果的分析常常停留在收率分析上，对实验现象的解释和实验结果的影响分析都较欠缺。本实验项目将大型分析仪器引入实验教学，增加了对合成结果的分析指标，使学生可以更明确地对实验成败进行判断，并以实验结果为导向对实验方案及合成过程进行更全面的分析。
理论应用于实践，培养分析问题的能力。本实验可使学生了解多种大型分析仪器的构造、操作及维护方法，熟悉样品预处理的过程，学习分析软件的使用方法，从而将书本上的理论知识与实际操作技能相结合，为今后的科研实验工作奠定基础。例如，在对多种谱图进行解析的过程中，需要用到波谱分析的相关理论知识。学生以往在课堂学习中接触的往往是教材中给出的典型例子，而在实际中通过谱图信息解析确定化合物结构的能力得不到锻炼。通过本实验的学习，学生不仅对分析仪器有了一定了解，对测试过程有了具象的认知，还能够通过谱图解析的过程对化合物结构有全面的判断，从而将理论知识转化为实践能力。
结语
本实验项目将那格列奈的合成与鉴定结合起来，形成一个连贯、系统、综合的实验项目。依托大型精密仪器检测平台，引入紫外分光光度仪、红外分光光度仪、核磁共振仪、高分辨质谱仪等大型精密仪器的实验教学，使学生掌握了大型精密仪器的工作原理和操作步骤，并通过这些仪器分析法的谱图解析，提升了学生对目标化合物结构的认知能力，以及对波谱解析相关知识的运用和分析能力，培养了学生的综合科研实验素质，为今后的毕业设计及后续的科学研究工作奠定了基础。
本项目受到国家级一流本科专业建设项目和江苏省品牌专业建设工程二期项目资助。
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