园林废物木质纤维素分解大型真菌的筛选能力

摘要为获得能够高效降解园林废弃物的大型真菌并研究其降解能力，采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)刚果红水解透明圈法、苯胺蓝培养基褪色法、酶活力比较法进行初筛，以园林废弃物的凋落叶为材料，比较不同大型真菌降解园林凋落叶的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的效率。结果表明：8种大型真菌在CMC-Na刚果红培养基中均能产生透明圈，其中白肉灵芝呈现的透明圈最明显，D/d的比值为2.06，毛头鬼伞在苯胺蓝筛选培养基中褪色的程度最为明显，朱红硫磺菌的滤纸酶活性最高，为10.26U/mL，褐离褶伞与地磷伞的木素过氧化物酶活性最高，均为69.51U/mL，白肉灵芝的纤维素酶活性最高为14.58U/mL，朱红硫磺菌、褐离褶伞以及珊瑚状猴头的锰氧化物酶活性最高，均为46.186U/mL，褐离褶伞的漆酶活性最高，为45.444U/mL。发酵28d后，毛头鬼伞对园林凋落叶中的NDF和ADF的降解率分别达到了23.9%和30.85%。

关键词园林废弃物;木质纤维素;酶活力;固态发酵

随着时代的发展，绿色环保的城市规划理念逐渐被人们所重视，各城市都在努力加大城市绿化面积，但随之而来的是产生了越来越多的园林废弃物，这些园林废弃物如不能得到及时的处理，将产生一系列的负面影响，例如人们为了处理越来越多的园林废弃物，采用焚烧或者填埋等易造成环境污染的方法[1]。根据文献报道，我国每年产生的园林废弃物约1410万t，这些园林废弃物可能会给环境造成不利影响[2]。园林废弃物是在城市绿化美化过程中由植物自然凋落或绿化修剪等产生的植物残体，含杂草、修剪枝条、落花、枯枝落叶等，大多源于植物[3]，其成分主要为纤维素和木质素[4]，如能充分利用起来，这也将是一类非常丰富的资源[5]。

20世纪90年代初，日本提出了《再生资源利用促进法》，要求对园林废弃物进行堆肥处理后作为肥料施用[6]，与国外相比，我国在对园林废弃物处理方面起步较晚，相对落后，主要采用填埋方式，这种方法并未能将园林的废弃物很好且更加经济的实用起来[7]。目前在对园林废弃物降解的研究中，多数以白腐菌为主要对象，目前已有将细菌应用于造纸厂等工厂的废弃污水处理的相关实例[8,9]，但由于真菌对生长环境有一定的要求，故将真菌大规模应用于园林废弃物处理的报道比较少[10]。

本文结合羧甲基纤维素钠(CMC-Na)刚果红水解透明圈法、酶活力比较法及测定固态发酵降解率，以筛选出降解园林废弃物的高效降解菌，为利用大型真菌处理园林废弃物提供思路与理论方法。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种

菌株分离于西藏林芝、察隅等地，并经过《大型真菌鉴定手册》确定菌株名称，分别为：(1)朱红硫磺菌、(2)褐离褶伞、(3)毛头鬼伞、(4)白肉灵芝、(5)黏小奥德蘑、(6)糙皮侧耳、(7)珊瑚状猴头、(8)地磷伞。

1.1.2培养基及试剂

1.1.3园林废弃物

枫叶、柳叶均采集于西藏农牧学院校内。

1.2主要仪器与设备

恒温培养摇床：上海一恒科学仪器有限公司，THZ-100B型;

低温冷光源人工气候箱：宁波普朗特仪器有限公司，LRX-450A-LED型;

高速台式离心机：上海普瑞塞斯仪器有限公司，TGL-16G型。

1.3试验方法

1.3.1菌种初筛

采用孙江慧[11]的方法筛选纤维素降解菌，从PDA培养基中挑取活化的8种大型真菌接种于CMC-Na培养基中，于恒温培养箱中26℃培养7d。之后向含菌落的CMC-Na培养基中倒入刚果红染色剂，染色15min后，倒去染色剂，再倒入1mol/L的NaCl溶液洗涤15min后将NaCl溶液倒去。因此木质素降解菌的筛选方法为将PDA培养基中挑取活化的8种大型真菌接种于苯胺蓝筛选培养基中，于恒温培养箱中26℃培养7d。观察记录平板中菌落圈和褪色程度的大小。

1.3.2粗酶液制备

将菌株分别接种至50mL羧甲基纤维素钠液体培养基中，于28℃、140r/min振荡培养7d，待发酵完成后取6mL发酵液，4℃、6000r/min离心10min，上清液即为粗酶液，并进行酶活测定。

1.3.3酶活的测定

(1)羧甲基纤维素酶活测定

采用顿宝庆等[12]的DNS法：在容积为25mL的离心管中，加入1mL适当稀释的酶液于50℃恒温水浴锅中预热2min后，加入0.5%CMC-Na溶液3mL，将离心管置于恒温水浴锅中，在50℃下反应30min，加入1mLNaOH(1mol·L-1)，并摇匀，终止反应，之后于离心管中加入3mLDNS试剂并摇匀，将离心管置于沸水中，反应5min，利用冷水对离心管进行冲洗终止反应，再用去离子水定容至25mL，于520nm处测定光吸收值，对照标准曲线测算酶活力。在上述条件下，酶活力按国际单位规定：定义每分钟催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU(U·mL-1)。

(2)滤纸酶活测定

用邵帅等人[13]的方法，将滤纸剪成1cm×3cm的小条，将滤纸条卷成小卷放置于5mL离心管内，加入醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4.8)1.75mL，分别加入0.25mL粗酶液并混匀，使得滤纸条完全浸泡于反应液中，将离心管置于50℃水浴锅中水浴1h，加入1mLDNS试剂，沸水浴10min，冷水终止反应。在波长540nm下，用酶标仪测定吸光度值OD值。对照组处理将菌液直接在沸水中加热，再用冷水冷却，每个样品做3个平行。

(3)木质素过氧化物酶(Lip)活性测定

采用Tien的方法[14]，取0.2mL的藜芦醇溶液(10mM)、0.4mL酒石酸缓冲液(0.25mM)与0.4ml粗酶样品混匀，并在30℃下，加20μLH2O2溶液(20mM)用于启动酶促反应，以未加H2O2溶液为参比，再用紫外分光光度计测定310nm处5min前后吸光度的变化。1个酶活力单位(IU)定义为每分钟每毫升反应体系转化1μmol底物藜芦醇所需的酶量。

(4)锰过氧化物酶(MnP)活性测定

同样采用Tien[14]的方法进行测定，取0.8mLMnSO4溶液(10mM)与0.2mL粗酶样品混匀，并在30℃下添加20μLH2O2溶液(20mM)用于启动酶促反应，以未加H2O2溶液为参比，用紫外分光光度计测定290nm处5min前后吸光度的变化。1个酶活力单位(IU)定义为每分钟每毫升反应体系中使得1μmolMn2+转化为Mn3+所需要的酶量。

(5)漆酶(Laccase)活性测定

采用张鹏飞[15]的ABTS氧化法来测定，并有所改动，反应体系中加入0.6mL醋酸钠(0.5M)，再加入1.5mL粗酶液，最后通过添加0.9mLABTS启动酶促反应，对照组添加的菌液为灭活的菌液，用紫外分光光度计测定420nm处5min前后吸光度的变化。1个酶活力单位(IU)定义为每分钟每毫升反应体系中1μmolABTS转化所需的酶量。

1.3.4固态发酵实验

(1)菌液准备

利用PDA液体培养基，250mL三角瓶装50mL培养基，pH自然，121℃灭菌30min。冷却后，将8种大型真菌菌丝接种到PDA液体培养基中，于28℃、140r/min恒温培养摇床中培养7d，备用。

(2)发酵实验

将树叶(枫叶与柳叶混合)风干后粉碎至2mm，分别称取20g装入玻璃瓶中，调节湿度为65%，121℃灭菌30min。无菌条件下，加入2mL菌液，混合均匀，无菌封口膜封口，在人工培养箱中26℃静态发酵28d，培养箱湿度为75%，每3d搅拌一次，每7d取1次样，测定中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量。以添加等体积的无菌水做对照，每个处理重复3次。中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量测定方法参照范氏洗涤纤维分析系统方法进行测定。

NDF(%)=[(m1-m2)/m]×100

式中：m1表示滤袋的重量和NDF的重量，m2表示滤纸/滤纸的重量，m表示样品的重量。

ADF(%)=[(m3-m4)/m]×100

式中：m3表示滤纸和ADF的重量，m4表示滤纸/滤袋的重量，m表示样品的重量。

2结果与分析

2.1纤维素酶、木质素酶活性的平板检验

葡聚糖内切酶对羧甲基纤维素具有很强的水解能力，测定计算羧甲基纤维素水解透明圈的D/d值，可反映不同菌株产内切酶的活力水平，进而可有效反映降解纤维素分子内多聚糖的能力[16]。通过对8种大型真菌在羧甲基纤维素培养基、苯胺蓝筛选培养基上培养7～10d后，对其透明圈及褪色程度进行观察记录(表1)。供试的8种大型真菌中，白肉灵芝在刚果红染色中出现的透明圈最大，其D/d为2.06;其次为朱红硫磺菌和糙皮侧耳，其D/d值分别为1.58和1.50;位于第3的是毛头鬼伞、黏小奥德蘑和珊瑚状猴头，其D/d值分别为1.41、1.43和1.36;透明圈最小的是地磷伞，其D/d值为1.20。在苯胺蓝筛选培养基中有4种大型真菌出现褪色。毛头鬼伞在苯胺蓝筛选培养基中褪色程度最为明显。但是透明圈及褪色圈不能作为评判菌株降解能力的唯一标准，还需要通过测定其酶活性进行进一步确定。

2.2纤维素酶及木质素降解酶系酶活对比分析

利用Excel对测得的数据进行基本计算，Origin2021进行分析作图。对8种大型真菌分别进行滤纸酶、纤维素酶、木素过氧化物酶、锰氧化物酶、漆酶活性测定，结果如图1所示。其中朱红硫磺菌的滤纸酶活性最高为10.26U/mL，其次为白肉灵芝，为9.99U/mL;白肉灵芝的纤维素酶活性最高为14.58U/mL，其次为褐离褶伞，为12.96U/mL;褐离褶伞与地磷伞的木素过氧化物酶最高，同为69.505U/mL，其次为珊瑚状猴头，为67.333U/mL;朱红硫磺菌、褐离褶伞及珊瑚状猴头的锰氧化物酶活性最高，为46.186U/mL，其次为糙皮侧耳与地磷伞，为45.315U/mL;褐离褶伞的漆酶活性最高，并显著高于其他真菌(P<0.05)，为45.444U/mL，其次为毛头鬼伞，为15.056U/mL。

2.3菌种对树叶的降解能力的比较

经过固态发酵28d后，样品中的NDF、ADF含量及降解率测定结果见表2。由表2可知，发酵第28d后，所有处理的NDF和ADF均较CK降低。其中毛头鬼伞的处理效果最好，NDF降解率达到了23.9%，ADF降解率达到了30.85%，其次为黏小奥德蘑，NDF和ADF降解率分别为23.53%和23.88%，降解效果最差的是朱红硫磺菌，NDF和ADF降解率分别为14.09%和9.82%。

从表2中我们可以看出，有4种真菌对NDF的降解率都达到了20%，有5株菌对ADF的降解率都超过了20%，所测定8种大型真菌中大多数对树叶都有较好的降解率。降解率的差异可能与菌株本身的生长速度有关，从图1可以看出毛头鬼伞的酶活性不如白肉灵芝，但是由于毛头鬼伞相对于白肉灵芝的生长速度快，进而导致在固态发酵中毛头鬼伞的降解率高于白肉灵芝。

3讨论与结论

纤维素是吡喃型D-葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的复杂结晶分子，在适宜的发酵培养条件下可通过外源微生物代谢产酶作用，快速实现纤维素聚合物的裂解[17]。木质素的化学性质较为复杂，目前已发现多种可以有效降解木质素的微生物，它们在降解木质素过程中产生过氧化物酶、漆酶等与木质素降解有关的生物酶[18]。想要实现对园林废弃物高效降解的有效手段，可以通过接种能够高效降解纤维素以及木质素的菌种对其进行堆肥腐熟。

本试验采用CMC-Na刚果红水解透明圈法及苯胺蓝培养基褪色法对8种大型真菌产酶活性进行定性筛选，酶活力比较法和园林废弃物凋落叶中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)降解率进行定量筛选。结果表明，白肉灵芝在CMC-Na刚果红培养基上的水解透明圈最明显，D/d的比值为2.06，明显高于其他真菌。毛头鬼伞在苯胺蓝筛选培养基中褪色的程度明显高于其他真菌。酶活性定量测定中，朱红硫磺菌的滤纸酶活性最高为10.26U/mL，白肉灵芝的纤维素酶活性最高为14.58U/mL，褐离褶伞与地磷伞的木素过氧化物酶最高，同时为69.505U/mL，朱红硫磺菌、褐离褶伞以及珊瑚状猴头的锰氧化物酶活性最高，同为46.186U/mL，褐离褶伞的漆酶活性最高，为45.444U/mL，并显著高于其他真菌(P<0.05)。

相较于单一菌剂而言，复合菌剂产酶具有多样性，在各种酶的相互协同作用下有利于加快园林废弃物的降解[19]。复合菌群菌种多样性的特点使其能够适应各种生境，使其能够更好地适应堆肥过程中极端的环境变化，从而发挥更大的作用[20]。本试验供试的8种大型真菌产酶活性不同，下一步将进行不同真菌组合试验，探究复合菌剂的接种浓度和比例最佳值，构建可高效降解园林废弃物的复合菌系，并进一步研究其在堆肥过程中的应用效果。

陈莹等[21]从高温期堆肥中筛选出一株链霉菌，以10%接种量发酵45d后，对小叶榕枝条的木质素和半纤维素降解率分别为21.63%和26.60%，几乎不降解纤维素。张鹏飞[15]实验中以5%接种量发酵28d后对园林废弃物木质素的降解率分别为14.88%、20.1%和11.25%。本试验所选菌种中在经过28d的固态发酵后，毛头鬼伞的降解率最好，其酸性洗涤纤维的降解率达到了30.85%，明显高于其他真菌，此菌对于纤维素的降解更高且所需周期较短。

参考文献：

[1]魏乐,李素艳,李燕等.园林废弃物堆肥替代泥炭用于天竺葵和金盏菊栽培[J].浙江农林大学学报,2016,33(5):849-854.

[2]YanS,YingG,JieC,etal.GardenwastebiomassforrenewableandsustainableenergyproductioninChina:Potentialchallengesanddevelopment[J].Renewable&SustainableEnergyReviews,2013,22(8):432-437.

[3]李芳,勇伟,白雪薇等.添加微生物菌剂和尿素对落叶堆肥的影响[J].园林科技,2013,(2):40-43.

[4]王宏智.园林绿化废弃物再利用的思考[J].农业科技与信息(现代园林),2011,(7):9-10.

[5]曹晓璐.园林废弃物制造栽培基质过程中掇生物的动态变化[D].北京:中国林业科学研究院,2014.

[6]吕子文.日本绿化植物废弃物处置场见闻[J]园林,2012(2):32-34.

[7]付春霞,付云霞,邱忠平等.木质素生物降解的研究进展[J].浙江农业学报,2014,26(4):1139-1144.

[8]MENDESS,FARINHAA,RAMOSCG,etal.Synergisticactionofazoreductaseandlac-caseleadstomaximaldecolourizationanddetoxificationofmodeldye-containingwastewaters[J].BioresourceTechnol,2011,102(21):9852-9859.

[9]LONČARN,BOŽIĆN,LOPEZ-SANTINJ,etal.Bacillusamyloliquefacienslaccase:Fromsoilbacteriatorecombinantenzymeforwastewaterdecolorization[J].BioresourceTechnol,2013,147:177-183.

[10]王垚,韩燕峰,梁宗琦.两株戴氏霉对水稻秸秆的降解及产酶研究[J].菌物学报,2017,36(5):598-603.

[11]孙江慧.几株食用菌对秸秆木质纤维素降解能力的研究[D].南京:南京农业大学,2012.

[12]顿宝庆,吴薇,王旭静等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报,2008,10(1):113-117.

[13]邵帅,王玲玲,林剑等.产纤维素酶真菌分离及高效菌株筛选[J].河南农业科学,2020,49(4):55-61.

[14]Tien,M.,andKirk,T.K(1983).LignindegradingenzymefromthehymenomycetephanerochaetechrysosporiumBurds.Science221,661-663.

[15]张鹏飞,李素艳,余克非等.木质素降解细菌的筛选及园林废弃物降解研究[J].安徽农业大学学报,2018,45(4):676-681.

[16]艾士奇,赵一全,孙志远等.复合菌系降解纤维素过程中微生物群落结构的变化[J].生物工程学报,2018,34(11):1-15.

[17]王佳佳,奚永兰,常志州等.秸秆快腐菌(Streptomycesrochei)对还田麦秸化感物质的响应[J].江苏农业学报,2016,32(5):1081-1087.

[18]曾光明,黄国和,袁兴中等.堆肥环境生物与控制[M].北京:科学出版社,2006.

[19]何宙阳,徐谞,刘超等.木质纤维降解复合菌剂促进堆肥腐熟研究[J].土壤,2020,52(04):728-735.

[20]付冰妍,孙向阳,余克非等.降解园林废弃物专用固体复合菌的构建及其堆肥效应研究[J/OL].环境科学研究:1-12[2020-12-06].https://doi.org/10.13198/j.issn.1001-6929.2020.08.16.

[21]陈莹,张俊涛,阮琳.园林废弃物堆肥中木质素降解菌的鉴定及其降解能力研究[J].华南农业大学学报,2014,35(6):94-98.