摘要：为探索醉鱼草内生细菌ZJ1的生防机制，对ZJ1菌株的胞外蛋白酶、几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶、纤维素酶活力和溶磷能力等抑菌活性物质及吲哚-3-乙酸(IAA)、番茄保护酶活性进行了测定。结果表明，ZJ1菌株可分泌胞外蛋白酶及纤维素酶，但不能产生几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶以及IAA，且不具有溶磷能力;ZJ1菌株能提高番茄叶片的CAT、POD、PPO、SOD活性，降低叶片中的MDA含量。醉鱼草ZJ1菌株的生防机制可能是通过产生胞外蛋白酶及纤维素酶分解真菌菌丝结构，进而抑制菌丝生长，并通过保持番茄植株膜系统的稳定，进而对植株起到防护效果，使之抗病性增强，减轻植物病害。
植物内生细菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的一类内生菌，其广泛存在于寄主植物的各个部位中，且可以长期稳定的在植物体内定殖[1-2]。研究发现，植物内生细菌可以产生与寄主植物相同或者相似的活性物质，起到抗肿瘤[3]、杀虫[4]、抑菌、抗氧化[5]、降糖[6]等作用。随着绿色农业的发展，植物内生细菌已成为一种不可或缺的生防资源，受到研究者们的重视。
近年来，研究者们对植物内生细菌在生物防治方面的应用进行了大量研究。OZAKTAN等[7]证明了黄瓜内生细菌在具有较好抑菌活性的同时还有促生作用，可促进种子萌发和植株的生长。研究发现，IMBG290在抑制病原真菌的同时也可促进马铃薯的发育。另外，有研究者对植物内生细菌的抑菌及促生机制进行了研究，发现内生细菌可通过产生蛋白酶、几丁质酶[9]和纤维素酶[10]等实现抑菌作用，通过分泌IAA[11]、生物固氮[12]、具有溶磷能力[13]等实现促生作用。李凤芳[14]研究发现，番茄立枯病的生防菌株B11-4可以产生IAA和嗜铁素，证明菌株B11-4主要通过产生促生物质和嗜铁素等物质来发挥抗病和促生作用。孔令春[15]研究发现，抗稻瘟病的拮抗细菌通过提高植株中的几丁质酶和POD等与抗性相关的酶活性以及产生抗菌物质来发挥其诱抗、抑菌及促生作用。拮抗细菌对病原真菌的抑菌机制有多种，其中主要有抑制菌丝生长和孢子萌发、破坏分解细胞壁和细胞膜以及诱导植物产生抗性等，其产生的抗菌物质作为主要的抗菌机制已被广泛认可，其产生的挥发物已被证实在促生、抑菌[16-18]以及诱抗方面[19]发挥着重要作用。
醉鱼草(BuddlejalindleyanaFortune)是醉鱼草属马钱科的灌木，在我国分布广泛、生长迅速、容易种植，是一种天然的中药。在我国古代就常用作中药，因其有活血、祛风、杀虫等功效，可用来治跌打损伤、风湿麻木、风寒感冒、蛔虫和钩虫等疾病[20]。有研究证明，醉鱼草茎叶具有良好的抗病毒活性。蔡鲁[21]研究发现，醉鱼草具有较好的抗H5N1病毒活性，对醉鱼草茎叶化学成分进行分离提纯，提取出6种有明显抑菌作用的物质。目前尚未见醉鱼草内生菌的相关报道。本研究以醉鱼草内生细菌ZJ1为研究对象，对ZJ1菌株的胞外蛋白酶、几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶、纤维素酶活性及溶磷能力、产吲哚-3-乙酸(IAA)能力进行测定，并通过测定番茄保护酶活性对ZJ1菌株进行抑菌机制初探，以期为该菌株在生物防治方面的应用以及后期的市场化奠定理论基础。
1材料和方法
1.1试验材料
醉鱼草内生细菌ZJ1由山西农业大学植物化学保护实验室分离并保存;番茄种子为美国红将军(西安市西兰良种有限公司)。
1.2试验方法
1.2.1胞外蛋白酶活力测定将ZJ1菌株接于酪蛋白培养基(取5g脱脂奶粉、1.50g琼脂分别溶于50mL蒸馏水中，灭菌后，待冷却至45～50℃，将两液混合均匀)上，重复3次，在26℃霉菌培养箱中培养48h后，观察是否有透明圈产生。
1.2.2几丁质酶活力测定称取5g几丁质，加入20mL丙酮研磨，研磨过程中再加入适量丙酮，充分研磨至呈糊状，在4℃条件下边研磨边加入浓盐酸60mL，用磁力搅拌器搅拌2h，在4℃静置24h。将混合物过滤，把滤液加入到预冷的50%乙醇中，经低温离心除去上清液，再加入预冷的无菌水，离心，除去上清液，如此反复多次至中性，收集沉淀，即制成胶体几丁质。将ZJ1菌株点接于几丁质培养基(称取胶体几丁质15g，(NH4)SO41g，酵母粉5g，KH2PO41.4g，MgSO4·5H2O0.3g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL，pH调至7.0。)上，每皿3个接菌点，重复3次，在26℃霉菌培养箱中培养48h后，观察是否有透明圈产生。
1.2.3β-l，3-葡聚糖酶活力测定将ZJ1菌株接于茯苓粉培养基(K2HPO417.98g，KH2PO46.80g，酵母膏5g，茯苓粉4g，苯胺蓝100mg，琼脂20g，蒸馏水1000mL。)上，在26℃培养48h后，观察是否有透明圈产生。
1.2.4纤维素酶(β-1，4葡聚糖酶)活性检测将ZJ1菌株点接于羧甲基纤维素培养基(CMC-Na5g，MgSO·47H2O0.10g，(NH4)2SO40.50g，K2HPO40.25g，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。)上，重复3次，在28℃培养48h后，用1mg/mL刚果红染色20min，再用1mol/L的NaCl浸泡15min，最后用水洗去表面附着的刚果红，观察菌周围是否有透明圈产生。
1.2.5溶磷能力的测定将ZJ1菌株点接于蒙金娜培养基(葡萄糖10g，(NH)42SO40.50g，NaCl0.30g，KCl0.30g，FeSO40.03g，MnSO4·4H2O0.03g，CaCO35g，卵磷脂0.20g，酵母膏0.40g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值调至7.0)上，每皿5个接菌点，重复3次，置于28℃培养5d后，观察是否有溶磷圈产生。
1.2.6吲哚-3-乙酸活性检测采用Salkowski比色法测定吲哚-3-乙酸(IAA)，将ZJ1菌株接种于YSP培养液中培养12h后，取100μL菌悬液接入100mg/μL色氨酸的King培养液(MgSO4·7H2O
1.50g，K2HPO41.15g，蛋白胨20g，L-色氨酸0.10g，丙三醇15mL，蒸馏水溶解后定容至1000mL，pH调节至7.0)中，每三角瓶放50mL培养液，重复3次，以加无菌水的培养液为对照，振荡培养12d。分别取菌悬液和对照各5mL置于试管中，再加入5mL比色液，室温静置15min，观察其颜色变化。若变红为阳性，表示ZJ1菌株可以分泌生长激素IAA。
1.2.7ZJ1发酵液原液的制备将ZJ1菌株接种于YSP培养液中，在28℃、160r/min恒温培养箱中培养12h后，以5%的添加量加入新鲜YSP培养基中，恒温振荡培养3d，即得到ZJ1菌株发酵液。
1.2.8对番茄植株防御酶活性测定室温盆栽番茄，用清水培育至第4片真叶出现时，挑选长势较为一致的幼苗，将ZJ1发酵液原液和5倍、10倍、20倍、50倍、80倍、100倍、200倍的稀释液，每隔7d分别用20mL进行灌根处理，对照组为等量清水。每个处理重复3次，40d后采集各处理番茄叶片20g，置于-20℃冰箱备用。按照试剂盒操作说明书具体步骤通过比色法测定番茄叶片中CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD含量。
1.3数据分析
试验数据均使用MicrosoftExcel2010进行数据统计，使用SPSS25进行分析，并用Origin软件作图。
2结果与分析
2.1醉鱼草ZJ1菌株胞外蛋白酶活力测定
ZJ1菌株在酪蛋白培养基上可以产生透明圈，说明醉鱼草ZJ1菌株可产胞外蛋白酶。
2.2醉鱼草ZJ1菌株几丁质酶活力测定
ZJ1菌株在几丁质培养基上没有透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1菌株不产几丁质酶。
2.3醉鱼草ZJ1菌株β-l，3-葡聚糖酶活力测定
ZJ1菌株在茯苓粉培养基上没有透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1菌株不产β-l，3-葡聚糖酶。
2.4醉鱼草ZJ1菌株纤维素酶(β-1，4葡聚糖酶)活性检测
将ZJ1菌株在CMC培养基上培养48h后，先用刚果红染色，后用1mol/LNaCl浸泡，洗去附着在表面的刚果红后，菌落周围有明显的透明圈产生，说明醉鱼草ZJ1菌株可产纤维素酶。
2.5醉鱼草ZJ1菌株溶磷能力的测定
在蒙金娜培养基上的ZJ1菌落周边没有溶磷圈产生，说明醉鱼草ZJ1菌株没有溶磷能力。
2.6醉鱼草ZJ1菌株吲哚-3-乙酸活性检测
加入比色液后，ZJ1菌液没有变色，所以，醉鱼草ZJ1菌株不分泌IAA。
2.7ZJ1菌株发酵液对番茄叶片防御酶活性的影响
2.7.1ZJ1菌株发酵液对过氧化氢酶(CAT)活性的影响
番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，叶片内CAT活性均发生不同程度的变化，在ZJ1菌株发酵液原液和稀释5倍、100倍的处理条件下，与对照相比CAT活性显著升高，其中，稀释100倍处理明显高于其他处理。
2.7.2ZJ1菌株发酵液对番茄叶片丙二醛(MDA)含量的影响
番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，10倍、50倍、200倍液处理的番茄叶片MDA含量与对照相比变化较为明显，50倍液处理含量显著低于对照，而200倍液处理远高于对照和其他处理，其余处理叶片MDA含量与对照相比无显著差异。
2.7.3ZJ1菌株发酵液对番茄叶片过氧化物酶
番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，各处理条件下叶片内CAT活性均有不同程度上升，5倍稀释液处理对POD活性的促进效果最好，远高于对照。
2.7.4ZJ1菌株发酵液对番茄叶片多酚氧化酶(PPO)活性的影响由图10可知，番茄植株经不同倍数稀释液灌根培养后，叶片内PPO活性均发生不同程度的变化，稀释10倍、80倍处理与对照相比，对叶片PPO活性的促进效果最好，远高于其他处理。
2.7.5ZJ1菌株发酵液对番茄叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，番茄叶片经不同倍数稀释液灌根培养后，SOD活性均发生不同程度的变化，除稀释50倍、200倍ZJ1发酵液处理外，其余各处理下的番茄叶片SOD活性都明显高于对照，稀释5倍处理最为显著。
3结论与讨论
李雪婷[9]研究表明，生防菌株S17-377可通过产生蛋白酶和几丁质酶发挥拮抗作用。千慧敏等[22]研究表明，生防细菌PA2101可致使病原真菌菌丝畸形并抑制分生孢子萌发，且可产生蛋白酶、β-l，3-葡聚糖酶、纤维素酶以及几丁质酶，还可以分泌I-AA等多种抑菌及促生物质，并具有合成可对烟草病害进行防控的DAPG和PCA基因。任晶等[23]研究发现，解淀粉芽胞杆菌SQR9可以产生IAA，促进黄瓜植株的生长。本研究表明，ZJ1菌株可分泌胞外蛋白酶及纤维素酶，但不能产生几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶以及IAA，且不具有溶磷能力。蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-l，3-葡聚糖酶等胞外酶可抑制病原真菌的生长，是生防菌株发挥拮抗作用的重要保障，ZJ1菌株虽不分泌几丁质酶、β-l，3-葡聚糖酶以及IAA，不具有溶磷能力，但本研究及以往研究发现，ZJ1菌株可产生抑菌活性物质，抑制菌丝生长及孢子萌发，纤维素酶和蛋白酶可分别降解纤维素和蛋白质，说明ZJ1菌株可通过胞外蛋白酶及纤维素酶分解真菌菌丝结构，进而抑制菌丝生长。
CAT、MDA、POD、PPO、SOD是植物抗病代谢过程中重要的几种酶，植物内生细菌不仅具有良好的生防作用[24]，还能改善防御酶系统，促进宿主植物的生长、增强抗逆[25]。本研究表明，ZJ1菌株发酵液能提高番茄叶片的CAT、POD、PPO、SOD的酶活性，降低叶片中MDA含量，通过保持番茄植株膜系统的稳定，进而对植株起到防护效果，使之抗病性增强，减少植物病害发生。同样地，张妙宜等[26]分离内生细菌QN2MO-1可促进番茄种子萌发和植株生长。焦蓉等[27]分离出内生细菌YN201728菌株，发现其能够促进烟草种子的萌发及幼苗生长。但是不同菌株对各种酶活性的改善能力有很大差异，可能与菌株来源不同以及菌株在提高互作植物防御酶活性方面有关。总之，醉鱼草内生细菌ZJ1菌株具有良好的生防效果，有待进一步通过大田试验进行测定。
参考文献：
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[3]李军，李白，高广春.药用植物内生菌抑菌作用研究进展[J].浙江农业科学，2017，58(11)：1989-1992，1996.
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[5]王景仪，李梦秋，李艳茹，等.药用植物内生真菌的多样性及生物功能研究进展[J].生物资源，2020，42(2)：164-172.
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