麋鹿 (Elaphurus davidianus) 是中国特有的鹿科动物, 出现在更新世早期, 具有重要的生态价值和经济价值[1]。后由于人类的扩张和栖息地的消失, 逐渐从野外灭绝, 现今麋鹿都是世界上仅存18头麋鹿的后裔, 面临着严重的近亲交配问题[2~3]。麋鹿人工授精与冷冻精液技术的研究和应用, 可以有效的改良麋鹿的血统, 遏制这种退化趋势。随着麋鹿数量的增加和饲养规模的扩大, 利用麋鹿细管冻精技术, 建立麋鹿种质资源库, 将成为中国麋鹿保护的有效方法和途径。
CZJC-2型电刺激采精器、凯苏氏输精枪、重光生物显微镜、玻片、恒温水浴锅、塑料细管、麻醉吹管、长臂手套、一次性注射器、剪毛剪、玻璃集精杯、胶头滴管、阴道内孕酮释放装置 (CIDR) 、孕马血清 (PMSG) 、促排卵3号 (LRH-A3) 、陆眠灵、陆醒灵、酒精、天鹿3号稀释液 (冷冻基础液配方:136mL三蒸水, 2g果糖, 4.48g Tris, 2.68g柠檬酸, 40mg GSH, 160mgBSA, 40mgATP, 500mgVc, 40万+20万双抗, 40mL卵黄, 磁力搅拌, 0.22um滤过灭菌冷藏)
选择4~7龄雄性麋鹿10只供采精使用, 采精前将电刺激采精仪校对准确, 将若干集精杯放在37℃恒温水浴锅中, 采精时多人配合, 按住头和四肢, 用生理盐水清洗公鹿龟头及包皮, 采精者蹲于公鹿腹侧, 一手操作采精仪, 一手握住公鹿阴茎。采精时用润滑剂涂抹电极棒, 将电极棒插入公鹿直肠内约20cm, 刺激电压由低到高, 每次持续刺激30s, 间歇10s。随着刺激强度增加, 公鹿阴茎膨大勃起, 射精常在通电后的突然瞬间、持续刺激或突然调高电压时发生, 用集精杯分段接精液, 迅速送检, 采精后公鹿用鹿醒灵解醒。
将采集好的精液送往实验室, 观察并测定活率、密度, 以0.7和0.6为标准统计不同环境温度下达优、良标准精子活力的精液份数所占的百分数。挑选活率≥0.8的精液, 确定稀释倍数, 将与精液等温的不同成分和甘油浓度的稀释液分降温前1次、降温过程中2次或平衡前1次沿精液试管壁缓缓加入, 混匀[4]。在0℃冰箱中水浴降温平衡5h。在冰箱中将平衡好的精液吸人0.25mL细管, 聚乙烯醇粉封口, 置于液氮面2cm的冷冻架上, 盖好容器盖, 冷冻5min, 投入液氮中。抽样并在35℃的水浴锅中解冻20s, 镜检, 活率0.35以上的精液标记装入纱布袋保存。
采用激素处理方法 (CIDR+PMSG) , 对雌性麋鹿进行诱导同期发情处理。对试验雌鹿麻醉放入CIDR, 第12天后取栓, 同时肌注PMSG, 剂量为400IU。对去栓24h后的雌鹿进行发情鉴定观察, 58h~59h后全群麻醉保定。
体格健康, 性欲旺盛公鹿进行输精管结扎, 初期每4h试情1次, 试情方法是把试情雄鹿拨入雌鹿圈内, 雄鹿逐个嗅闻雌鹿, 当雌鹿接受雄鹿爬跨站立不动时, 此时立即把雄鹿拨走, 之后试情频率改为每2小时试情1次, 直到发现雌鹿不愿接受雄鹿爬跨, 记下发情的雌鹿号, 立即给雌鹿进行人工输精。
采用直肠把握子宫内输精法:一只手握紧呈锥形, 将直肠内灌人肥皂水, 慢慢地深入直肠, 排除宿粪。把手伸人直肠, 通过肠壁轻轻握住子宫颈, 使颈口握在手心里, 另一手持安装好细管精液的凯苏氏输精枪, 缓缓伸人子宫颈口, 两手配合将精液注入子宫颈口过2~3个皱褶处。输精结束后肌注LRH-A3, 剂量12.5ug。
经过人工输精的雌鹿产出健康胎儿是麋鹿人工授精试验成功的标志。受胎率的计算一般以输精雌鹿产仔为依据, 即产仔输精雌鹿数量占输精雌鹿总数的百分比。
麋鹿电刺激采精结果见表1, 对雄性麋鹿电刺激采精12头次, 成功10次, 电刺激采精成功率100%, 采精量为0.5mL~2mL, 麋鹿每次射精量平均体积1.15±0.44mL, 精子的平均密度11.59±2.34亿/mL, 平均精子活力0.81±0.10, 72h鲜精活力0.65±0.09, 精液品质良好, 精液经稀释液稀释后72h, 鲜精活力达到0.6以上, 可见该技术可操作性强, 能够提供足够数量高质量精液。
电刺激采精是通过脉冲电流刺激生殖器引起动物性兴奋并射精来达到采精目的, 基本原理相似, 因生理特性的特点所使用的电压、刺激部位以及操作程序而各不相同[5]。梅花鹿电刺激采精有过多则报道, 孙广生 (1984) 认为梅花鹿电刺激采精最适电压为24V~36V, 王潇等 (2009) 认为马鹿的电刺激采精电压为5V~11V, 钟震宇等 (2011) 对雄性麋鹿电刺激采精进行了研究, 认为安全电压一般为3V~5V, 这与本报道的数据有略有不同, 试验中麋鹿的射精电压为3V~10V, 平均 (6.5±2.4) (n=12) , 电极棒插入肛门的长度为20cm, 对于刺激部位, 许多报道是电极棒刺激直肠靠脊柱侧, 本试验认为电极棒刺激直肠腹侧效果较佳。
2007年, 在麋鹿的繁殖期, 对6只试验雌鹿进行了同期发情处理, 去栓40h后有遛圈、回头、举尾、外阴肿胀等发情表现, 58h~59h全群麻醉促定后人工输精。5头雌鹿输精位置为子宫, 1头雌鹿输精位置为子宫口。3号雌鹿于2008年4月11日产仔, 雄性, 孕期268d, 初生重12.2kg, 健康。本次同期发情试验, 5头雌鹿有发情表现, 1头未见明显发情行为, 受胎率为1 6.7%。
2008年, 在麋鹿的繁殖期, 采用雄鹿试情法对雌性麋鹿进行发情鉴定, 分别于7月29日、7月30日和8月10日发现3只雌鹿发情, 其余2只雌鹿未发见明显发情表现。3号雌鹿于2009年5月13日产下1仔, 雄性, 孕期288d, 体重124kg, 健康, 受胎率为20%。麋鹿细管冻精情况如表2所示。
麋鹿人工授精技术是一项人工辅助繁殖手段和方法, 通过采集雄性麋鹿的精液, 经检查、稀释、保存等特定处理后, 输入到雌性麋鹿体内, 使其受孕的濒危物种繁育新技术。目前, 该研究尚处于起步阶段, 尽管能够成功受孕产仔, 但受胎率很低, 对于麋鹿繁殖生物学的深入研究, 尚需要一段时间。但是此项技术对于麋鹿性状的改良, 濒危状态的救护和种群遗传学管理均具有十分重要的意义。
感谢塔里木大学动物科学学院高庆华教授在本研究过程中给予的帮助, 同时感谢北京麋鹿生态研究中心陈星、张树苗等科技人员的支持。
摘要：麋鹿在全麻醉状态下, 进行了电刺激采精, 采用天鹿III号稀释液配方稀释精液, 在超低温下细管冻精, 对精液品质标准检测, 2007年至2008年, 分别利用同情发情和公鹿试情方法对12头麋鹿进行人工授精, 结果表明:麋鹿电刺激成功率100% (12/12) , 采得的精液品质288d和268d, 为麋鹿人工授精技术的推广提供了理论基础。
关键词：麋鹿,电刺激采精,冷冻精液,人工授精
[1] 李春旺, 蒋志刚, 曾岩, 等.麋鹿茸与梅花鹿、黇鹿茸雌二醇含量比较[J].动物学报, 2003, 49 (1) .
[2] 钟震宇, 张林源, 李坤, 等.麋鹿人工授精技术初步研究[J].四川动物, 2011, 30 (1) .
[3] 高庆华, 韩春梅, 魏海军, 等.天山马鹿细管冻精的制备和应用[J].中国兽医学报, 2008, 28 (7) .
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麋鹿的课文原文07-02
