我国是一个农业大国, 在农业生产中, 农药发挥了不可忽视的作用, 但是农药残留成为伴随而来的突出问题。苯并咪唑类药物作为光谱性内吸杀菌剂, 被广泛应用于水果生产, 而噻菌灵是苯并咪唑类农药的主要种类。这类物质对热、酸、碱和光都很稳定, 在自然环境中降解较慢, 对人、畜有一定的毒副作用[1,2,3]。目前应用于噻菌灵检测的前处理方法很多, 其中常用的有液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法和分散液相萃取法[3]。应用于农药检测的方法有很多种, 苯并咪唑类农药仪器分析应用较多, 而广大县乡 (镇) 级基层农产品检测中心仪器条件有限, 少有液质质或气质质等大型检测仪器, 大多配备有气相和液相分析仪器。
噻菌灵的检测方法常采用高效液相色谱法[4,5]。但关于葡萄基质中噻菌灵的Qu ECh ERS-液相色谱法检测分析文献报道比较少, 其测量不确定度评定研究更是缺乏。本实验采用Qu ECh ERS前处理-高效液相色谱法分析测定葡萄中的噻菌灵, 并对其进行不确定度评定, 为今后该方面研究和县乡 (镇) 级实验室提供参考。
无核白葡萄、赤霞珠等, 采自新疆吐鲁番、昌吉、鄯善等地区。
乙腈:色谱纯, 美国Fisher Scientific公司。
甲醇:色谱纯, 美国Fisher Scientific公司。
磷酸:分析纯, 西安化学试剂厂。
氯化钠:分析纯, 天津盛奥化学试剂厂, 140℃烘4 h。
无水硫酸镁:分析纯, 天津盛奥化学试剂厂, 650℃烘4 h。
乙酸铵:分析纯, 天津盛奥化学试剂厂。
Qu ECHERS萃取试剂盒:, 1 200 mg;PSA, 400 mg, 15 m L, 安捷伦科技 (中国) 有限公司。
微孔滤膜:0.20μm, 北京振翔工贸有限公司。
葵烷磺酸钠:纯度≥98%, 天津光复精细化工研究所。
三乙胺:天津富宇精细化工有限公司。
离子对试剂:吸取7.0 m L磷酸于200 m L水中, 加入1.0 g癸烷磺酸钠, 溶解, 再加入10.0 m L三乙胺, 稀释至1 000 m L, 调节p H值为2.4。
高效液相色谱仪:Waters e2695 Alliance型, 配可调波长紫外检测器 (2489UV/VIS) , 美国Waters公司。
高速冷冻离心机:TECHCOMP CT15RT型离心机, 上海天美科学仪器有限公司。
旋转蒸发器:N-1100型, 上海EYELA公司。
漩涡混合器:MS3 digiyal型, IKA公司。
分析天平:PB303-E型, 感量0.01 g, 梅特勒-托利多仪器有限公司。
色谱柱:C18柱100A (250 mm×4.60 mm, 5μm) , 美国Phenomenex公司。
流动相:甲醇+离子对试剂 (60+40) , 流速0.80m L/min。
检测器:配可调波长紫外检测器 (2489UV/VIS) , 美国Waters公司。
检测波长:300 nm。
色谱柱温度:30℃。
进样:10.00μL。
噻菌灵标准储备溶液:1 000μg·m L-1, 甲醇溶解。低温避光保存, 根据需要用流动相配制成适当浓度的标准系列工作溶液, 需现用现配。
标准工作液:分别准确吸取1 m L的噻菌灵标准储备溶液至50 m L容量瓶中, 用甲醇定容, 得20μg·m L-1的标准溶液;再从20μg·m L-1的标准溶液中分别吸取2.5 m L加入到50 m L容量瓶中, 加流动相 (1.2) 定容, 得1μg·m L-1的标准溶液;从1μg·m L-1的标准溶液中分别吸取1.0, 2.0, 5.0, 8.0 m L加入到10 m L容量瓶中, 加流动相 (1.2) 定容, 得标准曲线溶液;每个质量浓度取10μL, 进高效液相色谱仪进行分析。
称取供试试料 (10±0.05) m L于50 m L具塞离心管中, 先加入10.0 m L乙腈, 再加入1.0 g氯化钠、4.0g无水硫酸镁, 剧烈振荡, 用离心机10 000 r·min-1离心1 min。准确吸取6.00 m L上层乙腈相溶液于15m L Qu ECHERS萃取试剂盒中, 剧烈振荡, 用离心机10 000 r·min-1离心1 min。吸取上层乙腈相溶液1 m L, 再加入1.0 m L甲醇水 (1+1) 定容, 过0.20μm滤膜, 待进行液相色谱分析。
甲醇和离子对试剂在流动相中的比例, 对出峰效果影响较大, 本实验先后采用甲醇+离子对试剂比例为 (80+20) 、 (60+40) 、 (40+60) 的流动相, 对比噻菌灵标准的出峰效果。确定在甲醇+离子对试剂 (60+40) 的流动相条件下, 溶剂峰与标准峰能够实现完全分离, 峰型尖锐, 实验结果良好。空白加标样品的色谱图, 如图1。
对葡萄样品进行乙腈提取, Qu ECHERS试剂盒净化, 选择不浓缩和浓缩2种处理方式, 发现浓缩上样的方法虽然处理时间增加, 但检出限明显好于不浓缩处理。
在实验条件下, 以峰面积y为纵坐标, 质量浓度x (mg·kg-1) 为横坐标绘制标准曲线, 得线性方程, 以基线噪声3倍的峰面积对应的质量浓度为检出限 (S/N=3) , 回归方程、相关系数及检出限见表1。
样品处理方法进行样品处理, 重复3次。按“2.1”节色谱条件进行测定, 精密度和回收率计算结果见表2。采用本方法所得数据满足检测要求。
对乌鲁木齐市市售葡萄样品30份进行了测定, 其中1份样品检出了噻菌灵0.12 mg·kg-1, 检出率为3.33%。
根据液相色谱仪的测定原理, 农药残留含量计算公式如下:
(1) 式中:X为待测样品中农药残留含量, mg·kg-1;c0为待测样品中农药残留浓度, mg·L-1;v0为样品定容体积, m L;m为待测样品质量, g;f为浓缩倍数, 本方法下取值0.5。
根据不确定度的传播规律, 由公式 (1) 可得到样品中农药含量的相对合成不确定度Ur (X) 为:
试样中噻菌灵浓度c0的不确定度由以下三部分合成:1) 标准储备液自身的不确定度;2) 由标准溶液浓度-峰面积响应曲线求得c0产生的不确定度;3) 由标准储备液配制标准曲线系列稀释所产生的不确定度。
购买标准品的证书标注纯度为99%, 则其标准不确定度为 (按照矩形分布考虑, 取) , 所以U (ρ) =0.58 mg·L-1, 其相对标准不确定度为Ur (ρ) =U (ρ) /ρ=0.58/1 000=0.000 58。
根据上述实验条件对标准系列分别进行3次测定, 其峰面积结果见表3。
将表3所测数据建立回归校正曲线, 其拟合所得曲线方程为:A=2 983C+126。同时按照测定方法将葡萄试样测定2次, 根据校准曲线方程求得试样浓度, 则由下式计算:
式中:B1为校准曲线的斜率, 其值为2 983;p为试样溶液测定的次数, p=2;n为标准溶液测定的次数, n=15;c0为试样溶液中农药的浓度, mg·L-1;为校准曲线中农药的平均浓度, mg·L-1;Cj为校准曲c线中农药的标准浓度, mg·L-1;Aj为校准曲线溶液中待测农药峰面积的测定值。
将表3的数据代入公式 (3) 和 (4) 进行计算, 其中:
c1=0.1 mg·L-1标准溶液, 是将储备液 (1 000 mg/L) 按1∶50, 1∶20, 1∶10分3次稀释到0.1 mg·L-1。1∶50稀释标准溶液时, 使用1.00 m L移液管吸取1 m L标准储备液 (1 000 mg·L-1) 定容到50 m L容量瓶, 得20 mg·L-1标准溶液;1∶20稀释标准溶液时, 使用5.00m L移液管吸取2.5 m L标准溶液 (20 mg·L-1) 定容到50 m L容量瓶, 得1.0 mg·L-1L标准工作溶液;1∶10稀释标准溶液时, 使用100 m L移液管吸取1 m L标准溶液 (1.0 mg·L-1) 定容到10 m L容量瓶, 得0.1 mg·L-1标准工作溶液。
这里不确定度主要分为校准、重复性和温度影响。
1) 校准:
1.00 m L移液管 (A级) 在20℃, 允许误差为0.007m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.004 04m L;5.00 m L移液管 (A级) 在20℃, 允许误差为0.025m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.014m L;50 m L容量瓶 (A级) 在20℃, 允许误差为0.05m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.029 m L;10 m L容量瓶 (A级) 在20℃, 允许误差为0.02 m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.012 m L。
2) 重复性:
对1.00 m L移液管 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.002 2 m L;对5.00 m L移液管 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.011 m L;对50 m L容量瓶 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.015 m L;对10 m L容量瓶 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.008 m L。
3) 温度:
在20℃为校正温度, 假设实验室温度与校正温度相差3℃, 产生的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来计算, 甲醇的体积膨胀系数为1.24×10-3m L·℃-1, 则95%置信概率时体积变化的区间转换成标准偏差。
1.00 m L移液管 (A级) 移取1.00 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差为3×1×1.24×=0.002 15m L;5.00 m L移液管 (A级) 移取5.00 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差为3×5×1.24×=0.010 7m L;50 m L容量瓶 (A级) 进行移取1.00 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差为3×50×1.24×=0.107m L;10 m L容量瓶 (A级) 进行移取1.00 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差为3×10×1.24×=0.021 5 m L。
合成以上三项, 稀释成C1浓度时产生的相对标准不确定度:
按上述步骤计算C2、C3、C4、C5, 其中参考值增加10 m L移液管 (A级) 校准、重复性、温度数据如下。
1) 校准:
10.00 m L移液管 (A级) 在20℃, 允许误差为0.05 m L, 按均匀分布转换成标准偏差为0.05/=0.028 9m L。
2) 重复性:
对10.00 m L移液管 (A级) 进行重复11次测定得出其体积的标准偏差为0.013 m L。
3) 温度:
310.00 m L移液管 (A级) 移取8 m L、10 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差分别为3×8×1.24×1=0.017 2m L和3×10×1.24×=0.021 5 m L。
得:
合成以上5个分量, 标准储备液配制成5种标准溶液时产生对c0的测量带来的不确定度:
合成2.5.3.1.1、2.5.3.1.2和2.5.3.1.3步骤, 得到c0的相对标准不确定度:
样品提取处理时经过如下步骤:用10.00 m L移液管加入10.00 m L乙腈, 再吸取6 m L净化, 然后用5.00m L移液管吸取5.00 m L乙腈样品提取液浓缩, 用1.00m L移液管加入1.00 m L甲醇水 (1+1) 的溶液定容。
参考“2.5.3.1.3”的步骤, 计算v0的不确定度。
1) 校准
1.00 m L移液管 (A级) 在20℃, 允许误差为0.007m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.004 04m L;10.00 m L移液管 (A级) 在20℃, 允许误差为0.05m L, 按均匀分布转换成标准偏差为=0.028 9m L。
2) 重复性
对1.00 m L移液管 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.002 2 m L;对10.00 m L移液管 (A级) 进行重复11次测定, 得出其体积的标准偏差为0.013 m L。
3) 温度
在20℃为校正温度, 假设实验室温度与校正温度相差3℃, 乙腈的体积膨胀系数1.37×10-3m L/℃, 水的体积膨胀系数2.1×10-4m L/℃;10.00 m L移液管 (A级) 移取10 m L、6 m L乙腈, 得出其体积的标准偏差分别为3×10×1.37×=0.023 7 m L和3×5×1.37×=0.014 2 m L;1.00 m L移液管 (A级) 移取1.00 m L乙腈提取液, 得出其体积的标准偏差为3×1×1.37×=0.002 37 m L;1.00 m L移液管 (A级) 移取1.00 m L甲醇, 得出其体积的标准偏差为3×0.5×1.24×=0.001 07 m L;1.00 m L移液管 (A级) 移取1.00 m L水, 得出其体积的标准偏差为3×0.5×2.1×=0.000 182 m L。
合成以上三项, 提取定容体积产生的相对标准不确定度:
使用天平的线性分量为0.01 g, 按照均匀分布转化为标准偏差为=0.005 8 g, 所以称量产生的相对标准不确定度为因为要扣零, 应重复计算2次) 。
合成标准不确定度的计算由公式 (2) 得到:
由公式 (1) 得到:c×v0.12×10m×f10.00×0.5
所以·X=0.032 5×0.24 mg·kg-1=0.007 8
本次试验结果的扩展不确定度取包含因子k=2, 对应置信水平9 5%, 其扩展不确定度U=k×U (X) =0.015 6 mg·kg-1。所以葡萄中噻菌灵的含量结果报告表述为:X=0.240.015 6 mg·kg-1, k=2, 对应置信水平95%。
从表4可以看出, 用液相色谱法测定葡萄中噻菌灵含量时, 影响噻菌灵含量测定不确定度的最主要因素是由标准曲线校准所得浓度产生的不确定度, 因此在进行曲线校准及样品的测定时, 应将仪器设备各项测定条件的参数优化组合, 根据实验经验适当调整仪器参数及选择合适紫外波长, 使其处于最佳测定状态。同时应使待测液浓度在曲线中间部位, 减少偏差。由标准储备液配制标准曲线系列稀释所产生的不确定度也是主要因素, 因此在曲线配制的过程中, 要使用浓度准确的标准储备液, 并且使用计量检定合格的移液管及容量瓶配置标准曲线;在校准曲线的配制过程中, 熟练掌握移取的操作和读数技能;同时保证移液管清洁, 防止因玷污溶液挂壁而引起溶液移取体积有误差。
总之, 实验各个操作过程和环节都会产生一定的不确定度, 因此必须认真对待实验的每一个过程, 加强质量控制, 减少误差, 以提高测定结果的准确度。
本实验建立液相色谱快速分析测定葡萄中噻菌灵的方法, 样品用Qu ECh ERS方法提取净化, 结果表明:用Qu ECh ERS前处理方法, 噻菌灵在0.05~1.00mg·kg-1具有良好线性关系 (r=0.999 2) , 检出限为0.030 2 mg·kg-1, 加标回收率在77%~89.1%;采用该方法测定葡萄中噻菌灵残留量, 简便、快速、准确。Qu ECh ERS-液相色谱法分析测定葡萄中噻菌灵含量测量不确定度结果为X=0.240.015 6 mg·kg-1, 取95%的置信概率, k=2。
摘要：建立液相色谱法 (HPLC) 快速分析测定葡萄中噻菌灵的方法, 样品用乙腈提取, Qu ECh ERS净化, 紫外检测器检测, 并用外标法计算含量。结果表明:用Qu ECh ERS前处理方法, 噻菌灵在0.051.00 mg·kg-1具有良好线性关系 (r=0.999 2) , 检出限为0.03 mg·kg-1, 平均加标回收率为75%95%, 相对标准偏差2.3%, 样品中噻菌灵测定值.240.015 6 mg·kg-1, 取包含因子k=2, 对应置信水平95%, 其合成不确定度为0.007 8 mg·kg-1, 其扩展不确定度为0.015 6 mg·kg-1。采用该方法测定葡萄中噻菌灵残留量, 简便、快速、准确。
关键词：葡萄,噻菌灵,残留量,测定,不确定度评估,液相色谱法
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