鱼神经坏死病毒 (Nervous necrosis virous, NNV) 是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原, 可以导致鱼类病毒性神经坏死病, 又称病毒性脑病和视网膜病。该病毒具有极高的传染性和危害性, 严重情况下, 仔鱼和幼鱼的死亡率可以达到100%[1]。目前, 使用的检测方法有显微镜观察法、免疫学方法、分子生物学方法和细胞培养法, 这些检测方法普遍存在技术要求高、操作复杂和耗时长等特点, 无法满足现场的大规模应用。
环介导等温核酸扩增 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 是一种新型的核酸扩增技术。由于LAMP技术具有高灵敏度、强特异性、快速简便、成本低廉等特点, 使其广泛应用于病原菌的检测、胚胎性别鉴定、食品卫生检测等方面[2]。本研究利用RT-LAMP检测技术, 建立了斜带石斑鱼神经坏死病毒的快速检测方法。通过对比选取了特异性好的一组扩增引物, 并优化了反应时间、反应温度等条件, 检验了该方法的灵敏性和特异性, 最终建立了一套不依赖复杂设备, 操作简单, 只需肉眼观察就可以实施的检测方法。
感染了NNV的斜带石斑鱼和健康的斜带石斑鱼均由福建水产研究所提供;动物组织/细胞RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;LA-320c环介导等温扩增实时浊度仪、Loopamp RNA扩增试剂盒和Loopamp荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司;RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
参照斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列 (Gen Bank:AF245004.1) , 依据LAMP引物设计原则, 使用在线引物设计软件Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/e/) , 共合成引物5组, 每一组包括4条引物 (BIP、FIP、B3、F3) , 并针对第四组引物设计了Loop引物 (Loop F和Loop B) , 第四组引物序列见表1。
取斜带石斑鱼的脑及眼组织100mg, 参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。
在RNA扩增试剂盒说明书基础上优化建立本研究的扩增体系, 针对鱼神经坏死病毒衣壳蛋白保守区的不同位置设计了5组引物, 以提取的被感染石斑鱼总RNA为模板63℃恒温反应60 min, 选择特异性最好的一组引物;进一步选择最佳的恒温条件和最优的反应时间。
在恒温反应前加入猝灭状态的钙黄绿素, 反应结束后, 有发生LAMP反应的样品可以在紫外灯下看到荧光。
LAMP法具有灵敏度高的特点, 本研究将提取的总RNA分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5, 并以稀释后的样品为模板进行反应。
选取9种常见鱼类病毒的核酸, 并分别提取了核酸, 依照上述优化的条件在61℃恒温反应20 min, 进行特异性检测。
从鱼苗养殖场中随机抽取20尾鱼苗, 分别采用本研究的RT-LAMP法对比RT-PCR法, 检测RT-LAMP的准确性。
Nanodrop测得提取的总RNA浓度为100~200 ng/μL。
针对鱼神经坏死病毒衣壳蛋白保守区的不同位置设计的5组引物进行鉴定, 结果显示 (见图1A) :引物组2浊度值为零无变化, 其余四组特异性先后顺序依次为引物组4、引物组3、引物组1和引物组5, 且引物组4优于阳性对照因此, 选取第4组引物进行后续的实验。
反应温度的优化分别选取59℃、61℃、63℃和65℃恒温条件反应60 min, 结果表明61℃条件下效果最佳, 其次为65℃、63℃和59℃ (见图1B) ;环引物的添加可以有效地加快反应速度、缩短反应时间, 因此在上述实验的基础上, 针对第4组引物设计了环引物Loop F和Loop B (见表1) , 通过添加环引物前后的对比, 反应时间可由30 min缩短到20 min (见图1C) 。因此, 本研究RT-LAMP最佳反应温度是61℃、恒温反应20 min可以完成检测。
对提取的总RNA采取nanodrop法, 测得的总RNA浓度为124 ng/μL。按照10倍的梯度对样品进行稀释, 随着稀释梯度的增加, 检测时间逐渐延长。本研究论文前期以未感染的样品为模板进行扩增, 一定时间后也会有浊度峰值, 与稀释倍数10-4和10-5情况相似, 因此判定当稀释10-4倍后, 该浓度下的核酸含量达到了本方法的检测下限值。然而, 当样品稀释10-3倍, 在反应30 min后仍可以做出正确的判断 (图1D) , 此时总RNA的浓度仅有0.124 ng/μL, 由于实验过程中测得的为提取的组织的总RNA浓度, 其中有效的模板量应远小于这个浓度值。
注:A.不同引物的RT-LAMP扩增结果;B.不同引物的RT-LAMP扩增结果;C.不同温度的RT-LAMP扩增结果;D.添加环引物与否的RT-LAMP扩增结果。
环介导等温扩增基因的同时会生成大量副产物——焦磷酸离子, 将与锰离子结合而处于荧光猝灭状态的钙黄绿素添加到反应液中, 随着扩增反应的进行, 因为被反应副产物焦磷酸离子夺去结合的锰离子, 钙黄绿素恢复游离而发出荧光。通过添加荧光检测试剂, 61℃恒温20 min后, 置于80℃下5 min进行酶灭火, 在紫外灯下观察, 发现被感染的样品有明显的荧光, 而未感染的样品没有荧光 (图2A) 。钙黄绿素的添加, 实现了通过目视方法对结果的判定, 避免了对检测仪器的依赖。
对选取9种常见鱼类病毒对该方法的特异性进行鉴定, 结果表明 (见图2B) :只有鱼神经坏死病毒样品有绿色荧光, 其他样品无荧光, 说明该方法可以准确地将鱼神经坏死病毒与其他病毒样品区分开来, 具有良好的特异性。
注:A.荧光目视结果, 1.未感染样品;2.感染样品;B.RT-LAMP的特异性反应结果, 1.斜带鱼神经坏死病毒;2.传染性胰脏坏死病毒;3.病毒性出血性败血症病毒;4.淋巴囊肿病毒;5.大菱鲆红体病虹彩病毒;6.传染性鲑鱼贫血症病毒;7.嗜水气单胞菌;8.哈维氏弧菌;9.鳗弧菌。
共随机抽取20尾鱼苗, 分别采用RT-LAMP法与RT PCR法检测, 两种方法均检测出3尾被感染的样品, 结果一致, 见表2。
病毒性神经坏死病又称病毒性脑病和视网膜病是石斑鱼一种常见的严重疾病, 临床表现为不同程度的神经异常表现和中枢神经组织空泡化, 作为一种新型的核酸检测技术, LAMP技术具有快速的检测效率、便利的操作条件和较强的特异性和灵敏度等优势。
设计高灵敏性和特异性的引物对LAMP扩增的实施至关重要, 本研究共设计了5组引物, 实验证明不同引物之间的灵敏性存在明显的差异, 通过对比选择了最优的一组。另外, 环引物的添加使检测时间缩短了10 min, 明显提高了实验效率。LAMP具有灵敏度高的优点, Wang采用MIP-LAMP的方法使检测灵敏度降至核酸含量为62.5 fg/反应。Fallahi采用LAMP法检测T.gondii DNA中的RE和B1基因, 灵敏度分别为1 fg和100 fg。Su对18S r RNA和HBB的最小检测值均为10-5ng RNA。本研究的最低检测值为0.124 ng/μL总RNA, 当样品进一步的稀释之后会出现假阳性现象。
通过优化反应的引物、反应温度和反应时间, 选择了一组高特异性的引物, 并设计了对应的环引物, 在61℃条件下恒温20 min, 再置于80℃下灭活5 min, 即可完成实验。最终为科研及养殖户提供了一种准确迅速的NNV检测法。依照优化后的检测方法, 可以准确的将NNV和其他8类常见病害区别开, 对于养殖户来说避免了误诊误判, 具有重要的实际意义。为了简化实验, 又在反应管中添加了钙黄绿素, 实现了目视检测, 特异性实验和现场检测都证明了该方法有较高的特异性和准确率, 与先前研究相比反应时间缩短了15 min[3], 该方法可在较短的时间内实现了对鱼神经坏死病毒的特异性检测。
总之, 本研究成功的建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法, 该方法具有省时、省力、高效、便捷的优势, 具有广阔的应用前景。
摘要：利用反转录环介导等温扩增技术 (RT-LAMP) 建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒 (NNV) 检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物, 提取斜带石斑鱼的总RNA, 利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性, 同时对反应温度和反应时间进行优化, 并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明:筛选出一组高特异性的引物, 在61℃条件下恒温反应20 min可以完成检测;在反应试管中添加钙黄绿素, 可利用荧光反应现象进行结果判定, 且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应;对20尾鱼苗进行了现场检测, 检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法, 方法特异性强、反应时间短、操作简单, 为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。
关键词：石斑鱼,神经坏死病毒,RT-LAMP,检测方法
[1] 罗鸣, 陈傅晓, 刘龙龙, 等.我国石斑鱼养殖疾病的研究进展[J].水产科学, 2013, 32:549-554.
[2] 肖璐, 邬旭龙, 王印, 等.环介导等温扩增技术及其应用[J].动物医学进展[J], 2015, 36 (7) :113-117.
[3] 刘滨, 刘新富, 曾霖, 等.七带石斑鱼神经坏死病毒的RTLAMP检测方法[J].天津农业科学, 2016, 22 (7) :23-28.
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