试管法abo血型鉴定（精选5篇）
1.检验目的
鉴定供受血者ABO血型，保证临床输血安全。2．检验方法 试管法 2.1.试管法 2.1.1.实验原理
ABO血型鉴定，是根据IgM类特异性血型抗体与红细胞膜上特异性抗原结合能出现凝集反应的原理，用已知IgM类特异性标准抗A和抗B血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或（和）B抗原，同时用已知标准A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的天然IgM类抗A或（和）抗B。2.1.2.标本要求
静脉EDTA抗凝血2.0～3.0ml，以3000r/min离心3分钟，分离上清液。2.1.3.试剂
单克隆或多克隆抗A、抗B试剂，3-5% A、B及O型试剂标准红细胞悬液。2.1.4.器材
离心机，4℃冰箱、显微镜，12×70mm试管(以下称“小试管”),滴管，10mm×60mm透明的玻璃试管或塑料试管。2.1.5.操作步骤
2.1.5．1．正定型（查抗原）：取试管2支，分别标明抗A、抗B，加入抗A和抗B分型血清各2滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴，混匀。
2.1.5．2.反定型（查抗体）：取试管3支，分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。
2.1.5．3.立即以3000r/min离心10秒。（离心时间为离心机校准时间）。2.1.5．4.轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象,如肉眼观察不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜下观察有无凝集。2.1.5．5.凝集强度判断标准
＋＋＋＋：红细胞凝集成一大片或几片，仅有少数单个游离红细胞，血清清晰透明。
＋＋＋：红细胞凝集成数个大颗粒凝块，有少数单个游离红细胞，血清透明。
＋＋：红细胞凝成数个小颗粒凝块，游离红细胞＜1/2。＋：红细胞凝成数个小颗粒凝块，游离红细胞＞1/2。±：红细胞凝成数个微小颗粒凝块，周围有很多游离红细胞。MF：混合凝集外观（mixed field，MF），镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞呈分散分布。
－：阴性，镜下未见红细胞凝集，红细胞均匀分布。HP：部分溶血（part hemolysis，HP），有些残留红细胞。H：完全溶血（hemolysis，H），无残留红细胞。2.1.5.6.报告受检者红细胞ABO血型（表1001-1）。
表1001-1 ABO血型鉴定结果判断
分型血清＋受检者红细胞
抗A ＋ － － ＋ 抗B － ＋ － ＋
A B O AB 受检者血型
A细胞 － ＋ ＋ －
B细胞 ＋ － ＋ －
O细胞 － － － －
受检者血清＋试剂红细胞
1 临床资料与方法
1.1 临床资料
全部资料来源于我院自2006年9月至2007年12月收治的住院患者、门诊患者和体检患者共32例, 其中男性14例, 女性18例, 年龄21～71岁, 平均年龄48.6岁。全部病例均为常规血型鉴定正反定型结果不一致。需接受输血治疗患者30例, 占所有观察病例93.8%, 其中有一次输血史患者17例, 占需接受输血治疗患者56.7%, 有2次或2次以上输血史患者13例, 占需接受输血治疗患者43.3%;单纯血型鉴定患者2例, 占所有观察病例6.3%。所有检测结果均经过复检, 排除技术因素与试剂因素。
1.2 检测试剂和仪器
1.2.1 仪器
Dianafuge专用离心机、Diana Incubador恒温孵育器;
1.2.2 试剂
法国Diana凝胶检测系统, 包括标准血型卡 (正、反定型) ;生理盐水;A型和B型标准红细胞由本室自制;抗A和抗B血清 (单克隆抗体) 定型试剂和筛选细胞均为上海血液生物医药有限责任公司生产。
1.3 检测方法
正定型:A、B、D和Ctrl柱中各加入患者1%红细胞悬液50uL;
反定型:A柱和B柱分别加入1%A型和B型标准红细胞悬液50uL以及患者血浆/血清50uL;
置Dianafuge专用离心机中1000转/分离心10分钟, 观察结果。出现ABO正反定型结果不一致, 排除技术因素及试剂因素, 按下述步骤进行复检。
1.3.1 如Ctrl柱为阳性, 采用37℃、40℃生理盐水洗涤受检红细胞3次, 消除红细胞自凝现象, 再进行A B O血型鉴定。
1.3.2 改变试验条件, 增加1～2倍反定型患者血浆/血清或正定型A、B柱中加入外源性单克隆抗A或抗B血清试剂各50uL重新进行ABO血型鉴定。
1.3.3 红细胞吸收、放散试验按文献操作[1]。
1.3.4 检测受检者血清/血浆中不规则抗体
用筛选细胞I、II、III组来检测受检者血清/血浆, 筛选试验阳性, 再用试剂红细胞鉴定抗体种类, 选择缺少相应抗原的A、B红细胞作为反定型的试剂红细胞。
2 结果
2.1 ABO血型鉴定结果不一致血清学表现型及原因分析结果, 见表1。
2.2 ABO血型抗体减弱4例中通过增加孵育或加大血清/血浆用量获得正反定型一致;弱抗原2例通过增加外源抗体量获得正反定型证实;通过吸收、放散试验证实A亚型2例, B亚型1例;冷凝集素增高12例中, 应用37℃生理盐水洗涤解决红细胞自凝正确定型10例, 采用40℃生理盐水洗涤确定血型2例。
3 讨论
ABO血型准确鉴定在输血科所有试验中极其重要。在标准ABO血型鉴定中, 一旦出现正反定型结果不一致现象, 决不可按ABO正定型或反定型的结果确定血型, 否则可导致ABO血型的误判。必须复检并查明引起ABO血型正反定型结果不一致的原因, 以获得A B O血型的准确定型。
本文观察中冷凝集素增高是引起ABO血型正反定型不一致最为常见的原因, 占37.5%, 一旦血标本出现红细胞自凝或微柱凝胶卡Ctrl柱为阳性, 就应考虑有冷凝集素存在。用37℃生理盐水洗涤受检者红细胞可去除红细胞表面附着的冷凝集素, 从而获得可靠的正定型。ABO血型规则抗体的丢失或减弱是ABO血型正反定型不符的又一常见原因, 占12.5%, 一般加大反定型柱受检者血清/血浆量出现红细胞凝集, 表明血型抗体只是抗体数量降低, 并不是完全缺少。值得注意的是, 随着肿瘤患者的增多, 免疫抑制剂和化疗药物的影响, 这类情况有逐年增多的趋势。这时结合临床相关检查和病史, 准确判断尤其重要。自身免疫性溶血性贫血患者的红细胞严重地包被IgG抗体分子, 给正常血型鉴定带来很多困难, 可在45℃进行放散试验, 可以从红细胞上解离掉这些抗体, 然后可准确定型, 本文7例用此法都得到了正确定型。
红细胞A或B抗原的弱化是ABO正反定型不一致的又一原因, 抗原弱化既可以是遗传基因所决定的弱表现型 (即亚型) , 也可以是获得性的, 必须密切结合临床及血清学的特点才可准确判断出引起抗原弱化的原因。弱抗原通过吸收、放散试验证实本文中有3例。
A B O以外抗体的存在即不规则抗体也会导致正反定型不一致, 此时可用谱细胞鉴定出不规则抗体的种类, 选择对不规则抗体阴性的A型或B型红细胞作反定型的试剂红细胞进行反定型, 本文中有3例用此法正确鉴定了血型。也可用含有不规则抗体所针对的抗原的O红细胞吸收受检者血清, 然后再进行反定型, 也可正确鉴定血型。
微柱凝胶法进行血型鉴定, 抗原抗体量是恒定的, 操作过程标准化, 所以对ABO亚型、弱抗原、弱抗体的检出敏感度高于传统的试管法 (盐水法) 。遇到正反定型结果不符时, 应结合临床和血清学特点, 自行设计实验分析, 并可结合传统的试管法, 作出正确的血型鉴定。
参考文献
关键词：ABO血型；血型鉴定。
【中图分类号】R446.6
血型是人类血液以血型抗原为表现形的遗传性状，ABO血型系统和RH血型系统是红细胞的两大血型抗原抗体系统，在临床输血和血液遗传学研究上有重要意义。血型鉴定是临床输血的首要问题，正确的血型鉴定是保证输血安全的前提条件。临床常用的血型鉴定方法有盐水凝集法和凝胶微柱法。盐水凝集法因简单易行在临床上广泛应用，其又分为玻片法和试管法，结果在实际操作中会受到诸多因素的影响。本文通过对800名住院患者进行玻片法和试管法的血型鉴定通过对其结果分析，探讨ABO血型鉴定中的影响因素。
一、资料与方法
（一）资料 从2013年6月-2013年12月本院需进行血型鉴定的住院患者800名，每人抽取edta抗凝血，在2小时内用玻片法和试管法完成血型鉴定。
（二）试剂 人abo血型反定型用红细胞试剂盒，上海血液生物医药有限责任公司；抗a、抗b血型鉴定单克隆抗体；长春博德生物技术有限公司提供。
（三）方法 正定型法：① 玻片法：取清洁且带有圆形凹陷的推片1张，并注明A、B字样。将抗A试剂、抗B试剂各1滴分别滴于玻片上A、B处。分别取等体积待检血样（5%红细胞悬液或全血）于抗A试剂和抗B试剂。另取洁净推片1张，标明A细胞、B细胞和0细胞，用滴管各加受检者血清1滴，再分别用滴管滴加A、B和0型试剂红细胞悬液1滴。用不同的竹签将分型试剂与待检血样调匀，同时不停的摇动玻片并观察血型凝集（或溶血）反应，也可用低倍镜观察结果。②试管法：取洁净小试管2支，分别标上抗A、B字样，分别加入抗A、抗B标准血清各1滴，于相应标记的试管；然后分别加入被检者5%红细胞生理盐水悬液l滴于各试管充分混匀；以1000转/分的速度离心1分钟。将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象。
反定型法：首先将待检血以2500转/分离心3分钟，分离血清；取小试管3支，分别标记A、B、O，各管加被检者血清1滴，然后按标记分别加入5% 的A、B、O型标准红细胞生理盐水1滴，混匀；以1000转/分离心1分钟后取出试管，轻摇管底，观察凝集。
结果判断：凝集判断标准红细胞均匀分布，无凝集颗粒，显微镜下红细胞分散存在，无凝集靠拢现象为阴性，红细胞出现凝集为阳性。
二、结果
玻片法检验结果：O型253人 ；B型205人 ；A型202人；AB型140人
试管法检验结果：O型260人； B型201人； A型199人； AB型140人
不论是玻片法还是试管法，800名受检者 的血型分布是一致的，即O型最多，之后依次为B型、A型、AB型，即O>B>A>AB。② 玻片法和试管法的鉴定结果显示AB型人数相同，而A型、B型和O型人数不完全一致，存在一定的差异。
三、讨论
血型由血型基因决定，是血细胞的主要特征之一，在临床输血和血液遗传学研究上有重要意义。输血安全是临床输血的首要问题，正确的血型鉴定是保证输血安全的前提条件。
（一）医务人员的问题 临床医生在填写输血申请时，没有做血型检测，单凭印象或听信患者的自诉血型而造成血型错误；临床护士在抽取血标本时，未校对患者的姓名、床号，仅凭印象，抽了其他人的血液而造成血型报告错误或交叉配血不合；检验科人员没有对报告核对正确，造成血型鉴定错误。
（二）被检红细胞
①血型测定的错误血型：检测时，因患者红细胞悬液浓度过低，又只用肉眼观察结果，使之在血型抗原较弱的情况下，微弱、细小的凝集未看到，而造成定型报告错误。②标本新鲜，严防污染。细菌污染的标本，红细胞上t抗原被激活，与标准血清中的抗t抗体结合，出现全凝集现象，干扰血型鉴定。当疑有血浆成分干扰血型鉴定时，可用生理盐水反复洗涤红细胞以除去干扰。③ 冷凝集素属于冷反应性的自身抗体，4℃ 条件下，正常人血清中的冷凝集素效价低于1：16，冷凝集素效价增高是导致献血者血型正反定型不符的常见情况。在较低温度条件下，冷凝集素能够与标准红细胞和自身红细胞产生凝集现象，凝集强度随着温度的升高而减弱。低效价的冷凝集素在37℃不能凝集标准rbc和自身rbc，因此不会造成血型误判，但高效价的冷凝集素在37℃仍可产生较强凝集，容易造成血型误判。④ abo亚型在血型血清学试验中是导致正反定型不符的主要原因之一。亚型属于同一血型抗原，是由基因所决定的抗原结构和位点数改变导致的弱表现型。⑤ abo血型抗体减弱：abo血型规则抗体合成量的不足也是造成正反定型不符的重要因素。当献血者血清中抗a和抗b效价减弱，其反定型格局总表现为ab型。在这种情况下，可以通过增加血清用量，降低反应温度，延长反应时间，应用低离子强度溶液等方法，检出低效价的抗a和抗b。
（三）实验器材
① 所用器材必须清洁、干燥，试管、滴管要专用，标记清楚。②用试管法定型时，应同时进行正向和反向定型。每批测定均须设置对照。③红细胞浓度按要求配制，红细胞与相应抗体的比例适当。④反应温度、反应时间、离心时间是血型鉴定的重要影响因素，要按操作规程严格控制。
（四）其它因素
① 经输血或妊娠等免疫刺激产生，在献血者中常见的不规则抗體是抗m、抗n和抗a等。在反定型试验中，不规则抗体可以和标准红细胞上相应的抗原发生凝集反应，而这种反定型结果与a或b抗原无关，所以导致abo血型鉴定时正反定型结果不一致。②类b抗原某些受肠道革兰氏阴性杆菌感染的病人，红细胞获得了类b抗原，a型病人可误定为ab型，o型误定为b型。因此，感染体征病人配血不合时，应考虑类b。③磺胺类药物引起的凝集有人报道一个b型的献血员阑尾术后用氨苯磺胺，3个月后，其血清能凝集a、ab型的红细胞，也能凝集b型的红细胞。另外，注射青霉素后，有些人的血清中含有青霉素抗体，而青霉素已吸附在红细胞表面，当此红细胞与含有青霉素抗体的血清相遇时便发生凝集。
因此，在具备认真的工作态度的基础上，还需要不断积累丰富的血型鉴定经验，对异常结果进行系统全面地分析，查明原因，以获得abo血型的准确定型，确保安全输血。
参考文献
1.目的：ABO血型定型检测 2.适用范围：
新鲜、无污染、无溶血的人全血，避免反复冻融，不可用NaN3 防腐。3.职责：
站（院）长批准，专业负责人考核合格的优生筛查实验室检验人员履行此项工作。4.试剂：
4.1本法所用试剂为长春博德生物技术有限责任公司生产的抗A抗B血型定型试剂盒。
4.2本法所用试剂应在有效期内使用。5.设备仪器： 5.1医用冰箱 5.2双目显微镜
5.3微量可调移液器 6.原理：
本品系由经配制的抗A血型或B血型单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液（或在上清液中加少量同型腹水）组成，专供鉴定人ABO血型用。7.程序：
7.1平衡：将在有效期内试剂盒、待测适用样品从冷藏环境中取出，平衡至室温（18-25℃）。
7.2平板法（玻片法）：本品与受检者全血或红细胞生理氯化钠悬液按1：1使用，不必再稀释，按照有无凝集判定结果。
7.3试管法：本品与受检者5%红细胞生理氯化钠悬液按1：1使用，不必再稀释，摇匀，1000r/min离心1分钟或室温静置1小时，按照有无凝集判定结果。7.4结果判定
血型 A B AB O 7.5检验结果登记 8.相关程序
8.1设备管理程序
8.2设备校准工作程序 8.3方法管理程序
8.4实验标本管理程序 8.5记录控制程序
8.6优生筛查服务管理程序 8.7实验室管理制度
抗A试剂
++ 8.8员工守则
8.9保密和保护专有权管理程序 8.10档案管理规定 9.相关记录
9.1《环境条件记录》 9.2《冰箱温度记录》 9.3《实验标本流转单》
9.4《仪器设备使用维护记录》
1材料与试剂
1.1标本来源
2013年7月至2014年7月,我院申请输血患者22 558例,标本采集条件为真空采血针采集EDTAK2抗凝全血3 ~ 5 m L,1 760 g离心5 min。
1.2仪器与试剂
ORTHO Autovue Innova全自动血液免疫检测系统,单克隆抗A、抗B血型正定型试剂( 美国IMMUCOR ) ,Ig M单克隆Rh D血型定型试剂( 美国IMMUCOR) ,标准反定细胞 ( 以下简称Ac、Bc、Oc,美国BIO-RAD) 、3系抗筛细胞( 美国BIO-RAD) ; 16系谱细胞( 荷兰Sanquin) ,抗球蛋白检测卡( 美国Ortho Biovue) 、血型检测卡( 美国Ortho Biovue) ,操作方法参照相关说明书进行。
2方法
2.1血型及不规则抗体筛查
采用ORTHO Autovue Innova全自动血液免疫检测系统,严格按照仪器使用说明书要求检测患者ABO及Rh D血型和不规则抗体筛查,对ABO血型正反定型不一致的患者标本,采用试管法复查; 对抗筛阳性患者,进一步进行抗体鉴定。
2.2抗体鉴定
患者血清与谱细胞分别在盐水介质和抗人球蛋白介质中检测,根据患者血清与谱细胞反应格局,并结合患者对应红细胞血型表型,鉴定患者血清中不规则抗体特异性。
2.3抗体类型鉴定
在盐水介质中凝集,抗人球蛋白介质不凝集的抗体为Ig M类抗体; 在盐水介质中不凝集,抗人球蛋白介质凝集的抗体为Ig G类抗体; 对于在盐水和抗人球蛋白介质都凝集的抗体,采用2-Me与患者血清等量混合,于37 ℃水浴30 min,再进行抗体鉴定,如果破坏后盐水和抗人球蛋白介质凝集均消失,提示抗体类型为Ig M,如果盐水介质凝集减弱或消失,抗人球蛋白介质仍有凝集,提示Ig M和Ig G类抗体均存在。
2.4对于怀疑不规则抗体干扰血型的处理
明确患者血清中抗体特异性,筛选对应抗原阴性的献血者红细胞,配置成反定细胞,重新进行血型鉴定。
2.5O细胞冷吸收方法
对于不规则抗体筛查阳性,但无法明确抗体特异性的患者标本,采用多人份O细胞混合,用生理盐水洗涤三次,制备成压积红细胞,与患者血清等量混合,于4 ℃冷吸收30 min,再对患者血清标本进行血型鉴定。
3结果
2013年7月至2014年7月期间共完成血型检测22 558例,其中57名患者因不规则抗体的存在,干扰血型鉴定。通过调查发现MNS、Rh、Lewis、Duffy、P血型系统产生的不规则抗体均发现可干扰血型鉴定,其中MNS系统41例,Rh血型系统10例,Lewis系统4例,Duffy和P系统各1例。抗-M最多,37例,占64. 91% , 其次为抗E相关抗体,5例,占8. 77% ; 从不规则抗体类型统计发现Ig G与Ig M类混合抗体最多,占37例,单纯Ig G类抗体14例,单纯Ig M类抗体6例。 具体分析结果见表1。
4讨论
ABO血型系统是人类最早发现的血型系统,也是与输血安全相关的最重要的血型系统,ABO血型不合输血可以导致溶血性输血反应,严重的急性溶血性输血反应,发病急骤、来势凶险,若处理不及时可危及患者生命; 因此,ABO血型鉴定是输血前检测的必检项目之一,准确的血型鉴定是保证输血安全、提高输血疗效、减少或杜绝溶血性输血反应的直接保障。
不规则抗体是指正常ABO血型系统以外的抗体,主要因机体受到免疫刺激产生缺乏对应抗原的抗体,主要包括Ig G和Ig M两种类型。不规则抗体可干扰ABO血型鉴定,表现为反定型不应该凝集的一侧出现凝集,O细胞可出现阳性或阴性反应,导致血型正反定型不一致,患者自身对照一般为阴性。 因无论自制还是商品化反定细胞均为人源红细胞制备,而人类红细胞血型系统非常复杂,红细胞表面抗原除包含ABO血型系统抗原外,还有众多其他血型抗原存在,目前已发现33个血型系统[3],当受检者血清中存在不规则抗体,而反定细胞上存在对应抗原时,即可发生抗原抗体反应,在合适的条件和介质中引起肉眼可见红细胞凝集,干扰血型鉴定。
本次研究发现影响血型鉴定的不规则抗体主要为Ig M类占75. 44% ,主要原因为Ig M类抗体为五聚体,可在盐水介质中引起肉眼可见的红细胞凝集, 干扰血型鉴定; 但有14例患者单纯存在Ig G类抗体,也干扰血型鉴定,其原因可能为血型检测所用的血型鉴定卡中加入某些增强介质,如PEG等,虽一定程度上提高了反应的灵敏度,缩短了反应时间,提高了检测效率,但也会导致某些Ig G类抗体在无抗人球蛋白介质存在的情况下发生凝集,给对血型鉴定带来干扰。曹微微等对55481例住院拟输血患者进行红细胞血型不规则抗体分析,发现各血型系统抗体分布为Rh系统抗体最多为59. 79% ,MNS系统其次为24. 74% ,Lewis系统第三为3. 09%[4]。 本次研究发现影响血型鉴定的不规则抗体与文献报道一致,但由于在人类血清中MN血型系统产生的不规则抗体多为Ig M类型,也有少量Ig G类型存在, 因此从扰血型鉴定方面统计发现MNS系统最多,占71. 93% ,其次为Rh血型系统,占17. 54% 。
当血型鉴定出现正反定型不一致时,首先应排除人为因素、试剂因素及样本自身因素的干扰,然后严格按照操作规程重复试验,根据具体问题分析原因并采取相应处理措施。当血型反定型不该凝集的一侧出现凝集,而且不规则抗体筛查阳性时,应注意排除不规则抗体干扰。排除办法为选择对应抗原阴性的红细胞制备成反定细胞,重新进行血型鉴定,这样既可以明确患者血型,又达到了进一步验证抗体鉴定结果的目的。如果无法明确抗体特异性,也可采用多人分O细胞混合,吸收患者血清后,再进行血型鉴定,该方法可一定程度排除同种抗体干扰。
参考文献
[1] Daniels G,朱自严.人类血型.北京:科学出版社,2007:36Daniels G,Zhu Z Y.Human blood groups.Beijing:Science Press,2007:36
[2] 临床输血技术规范.卫生部,2000Technical Specifications of Clinical Blood Transfusion.Ministry of Health,2000
[3] Reid M E,Lomas-Francis C,Olsson M L.The blood group antigen facts book.Third Edition,Academic Press is an imprint of Elsevier,2012:8—23
【试管法abo血型鉴定】推荐阅读：
