茶汤中苦涩滋味主要成分为茶多酚、生物碱。儿茶素类是茶叶多酚类最主要的成分, 占多酚类总量的70%~80%。儿茶素具有苦味和涩味, 儿茶素滋味阈值较低, 特别是酯型儿茶素阈值更低, 在茶汤中含量较高, 因此是影响茶汤苦涩味的关键化学成分[1]。施兆鹏等发现以儿茶素为主体的茶多酚类物质对茶汤滋味的影响可能存在着明显的二次曲线关系[2]。茶叶中生物碱主要有咖啡碱、可可碱和茶碱, 咖啡碱是茶叶中重要滋味物质[3]。杨亚军等研究表明, 咖啡碱含量在3.8%~4.5%范围内, 不仅可以降低茶汤的苦涩味还能提高鲜爽度, 当咖啡碱含量超过4.5%, 非络合的咖啡碱越多, 使得苦味越重[4]。目前, 检测儿茶素和生物碱类物质主要用高效液相色谱法, 但对于茶汤中儿茶素和生物碱的测定目前尚无国家标准和规范。为了更好地分析茶汤中的儿茶素和生物碱, 本试验对检测波长、色谱柱的选择、色谱条件等条件进行进一步优化, 为快速检测茶汤中的滋味物质提供参考。
甲酸 (分析纯, 上海国药) , 甲醇 (色谱级, merck) , 乙腈 (色谱级, merck) ;生物碱:咖啡碱Caf (Sgima, >99%) , 可可碱TB (TRC, >99%) , 茶碱TP (EP, >99%) ;儿茶素组分:表儿茶素EC (Sgima, >99%) , 儿茶素C (Sgima, >99%) , 表没食子儿茶素EGC (Sgima, >99%) , 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG (Sgima, >99%) , 没食子酸GA (Sgima, >99%) , 表儿茶素没食子酸酯ECG (Sgima, >99%) 。
Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司) , 2998型PDA检测器 (美国Waters公司) ;色谱柱ZORBAX-ODS (4.6 mm×250 mm, 5μm, 美国Agilent) ;X-select-T3 (4.6 mm×250 mm, 5μm, 美国Waters) ;FA1004型电子天平 (北京, 赛多利斯有限公司) ;p H计 (ohrus) ;UNIQUE-R20纯水系统 (厦门, 锐思捷科学仪器有限公司) ;HWS-16电热恒温水浴锅 (上海一恒科学仪器有限公司) ;微量移液 (Eppendorf Research) ;SB-5200DT型超声波清洗机 (宁波, 新芝生物科技股份有限公司) ;微型研磨PULVERISETTE 23 (德国飞驰, FRITSCH) , Sartorius MA150水分测定仪 (德国, 赛多利斯) 。
流动相A:2 m L甲酸加入100 m L容量瓶中, 水定容至刻度, 摇匀, 过0.45μm的膜;流动相B:甲醇。
对照品溶液分别取Caf, TB, TP, EC, C, EGC, EGCG, GA, ECG适量, 用30%甲醇水超声溶解, 配制成1 000, 500, 600, 500, 200, 500, 400, 600, 500μg·m L-1做储备液, 放置在-20℃备用。取储备液适量, 适度稀释成不同浓度的对照品溶液;另取9种对照品储备液混合成混合对照品, 放置在4℃保存。
参照GB/T8303-2003, 取适量的茶鲜叶, 用微型研磨机适度粉碎茶样至粉末;茶汤制备参照Zhang Y N方法[5]略有改进, 具体操作如下:称取茶样0.20 g, 加入10 m L沸水, 浸提5 min, 迅速在冰浴中冷却到室温, 离心吸取上清液, 定容至100 m L, 用0.22μm微孔水系滤膜过滤, 备用。
对检测波长、色谱柱选择、流动相、流动相p H值、流动相流速、柱温进行单因素色谱条件优化筛选。
取对照品溶液, 置于二极管阵列检测器进行紫外扫描, 设置全波长 (220~400 nm) 扫描, 提取9种物质各个对应3D光谱图吸收峰最大时候的波长 (见图1) 。结果表明, 275 nm能使9种组分有较强的灵敏度和近似的响应值, 且干扰度小, 分离基线较稳定。在样品定性过程中, 采用保留时间和光谱图同时作为依据, 可提高目标物质定性的准确性。
参照文献[6~8]的洗脱方式, 对流动相略做改动。采用流动相A:2%甲酸;流动相B:甲醇, 梯度洗脱0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 进样量10μL, 检测波长275 nm, 柱温32℃, 流速1 m L·min-1。选用ZORBAX ODS与X-select-T3两种色谱柱对9种物质进行分离, 由于两种色谱柱填料的类型和孔径不同, 因此9种物质的出峰顺序不同。此外, 出峰顺序的不同, 还受到流动相、p H值、柱温等影响。如图1的结果表明, 对ZORBAX ODS色谱柱采用梯度洗脱的方式, TP和EGCG很难分离, 同时Caf出现拖尾, X-select-T3对9种物质的分离效果虽基本不错, 但Caf和EC的尚未达到基线分离, 分离度<1.5, 因此后续用X-select-T3, 从洗脱方式、流动相p H值、柱温与流速等方面优化。
选用X-select-T3设置不同的柱温 (36℃, 34℃, 32℃, 30℃) 对9种物质进行分离优化。色谱条件:梯度洗脱0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 进样量10μL, 检测波长275 nm, 流速1 m L·min-1, 结果表明, 在柱温36℃时Caf和EC完全重合, 未分离。随着柱温的降低, Caf和EC逐渐达到基线分离, 30℃的时候最佳 (见图3) 。
因物质EGC, C, ECG, Caf在6 min之后出峰, 在优化其梯度洗脱方式时, 选择在6 min之前 (5 min) 时, 6 min之后 (7 min、9 min) 时对其进行流动相比例优化, 以确定物质分离的最佳梯度。选用X-select-T3设置不同的梯度, 梯度洗脱方式A:0 min (83%A, 17%B) -5 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) ;B:0 min (83%A, 17%B) -9min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) 对9种物质进行分离。进样量10μL, 检测波长275 nm, 柱温30℃, 流速1 m L·min-1。图4结果表明, 对X-select-T3采用0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) 梯度洗脱的方式, Caf和EC分离, 但EGC, C, ECG的峰形不佳, 有拖尾现象, 待进一步调试。
选用X-select-T3设置不同的流速, 0.8 m L·min-1, 1 m L·min-1, 1.2 m L·min-1对9种物质进行分离。色谱条件:梯度洗脱0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 进样量10μL, 检测波长275 nm, 柱温30℃。图5结果表明, 对X-select-T3采用梯度洗脱的方式, 流速在0.8 m L·min-1时, Caf和EC未完全分离;流速在1.0m L·min-1和1.2 m L·min-1时, Caf和EC均达到基线分离。在1.2 m L·min-1时, 3.7~12.5 min 9种物质都得到分离, 流速越高, 出峰越快。但随着流速的增加, 色谱柱柱压升高, 影响柱效, 综合考虑最终选择1.0 m L·min-1。
根据X-select-T3色谱柱对p H值的使用范围 (2~8) 设置p H值为2.2, 2.3, 2.5;色谱条件:梯度洗脱0min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 进样量10μL, 检测波275 nm, 柱温30℃, 流速1 m L·min-1。图6结果表明, p H值对“C和TP”“Caf和EC”的分离有影响。p H=2.2时, C和TP分离效果好, Caf和EC分离效果不好;p H=2.5时, C和TP分离效果不好, Caf和EC分离效果好。同时, 在酸性条件下, 测定儿茶素组分更加稳定, 而且可以改善峰形。综合考虑选择p H=2.3。
在优化条件下, 以X-select-T3 (4.6 mm×250mm, 5μm, 美国waters) 为色谱柱, 流动相A:2%甲酸;流动相B:甲醇;洗脱方式:0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 检测波长275 nm, 流速1 m L·min-1, 柱温30℃。样品色谱图中9种物质基本上得到分离, 可进行定性定量分析。
在优化条件下, 将不同浓度的儿茶素与生物碱标准液分别以10μL进样, 以峰面积对质量浓度作图, 绘制标准曲线, 由回归分析结果可知:线性良好。适度稀释对照品, 信噪比 (S/N) ≥3∶1时, 记录检出限, 信噪比 (S/N) ≥10∶1时, 记录定量限, 结果列于表1。
按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液, 按照优化下色谱条件连续进样6次, 计算得各个物质峰面积及其保留时间的RSD分别在0.12%~1.42%、0.18%~4.50% (n=6) , 表明仪器精密度良好。
取同一供试品溶液, 于-4℃冰箱中放置, 分别于0, 2, 8, 12 h进样, 据测定结果计算得各个物质峰面积及其保留时间的RSD分别在0.25%~0.47%、0.16%~6.47%, 表明供试品溶液在12 h内具有良好的稳定性。
按“1.3.2”项下方法平行制备5份溶液, 按优化下色谱条件进样测定, 记录峰面积。利用外标法算出其含量, 其RSD值在1.88%~9.96%, 均低于10%, 表明该方法的重现性良好。
按“1.3.2”项下方法制备样品溶液, 然后按优化下色谱条件进样测定, 记录峰面积并计算回收率。取已知含量的样品, 各精密加入3份不同浓度对照品混合溶液。结果表明, 9种物质的平均回收率为103.68%~82.94%, RSD为0.23%~3.31% (n=3) , 说明方法稳定可靠 (见表2) 。
取绿茶、白茶、红茶、乌龙茶、黑茶、黄茶, 按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液, 按照“2.1”项下色谱条件进样测定, 记录峰面积, 按照外标法计算含量, 结果见表3。可见, 这种检测方法同样适用于其他茶类茶汤的检测。
单位:mg·g-1
本研究表明, 以X-select-T3 (4.6 mm×250 mm, 5μm, 美国waters) 为色谱柱, 流动相A:2%甲酸;流动相B:甲醇;洗脱方式:0 min (83%A, 17%B) -9min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 检测波长275 nm, 流速1 m L·min-1, 柱温30℃。利用保留时间和光谱图定性, 外标法定量, 分析茶汤浸出物儿茶素和生物碱, 儿茶素组分和生物碱回归方程相关性系数都在0.999 0以上, 有良好的线性关系, 各组分加样回收率为103.68%~82.94%, RSD为0.23%~3.31%。本方法操作简单、快速、准确, 可用于茶汤滋味物质儿茶素组分及生物碱的含量测定。茶叶是一种饮料, 以品饮方式消费, 对茶汤中物质含量的测定, 可以为更好地真实反映物质对口感的影响, 为研究茶汤浸出滋味的研究提供基础。
摘要：目的:建立茶汤内含物质儿茶素和生物碱检测方法体系, 为研究茶汤滋味物质做基础。方法:以X-select-T3 (4.6 mm×250 mm, 5μm, 美国waters) 为色谱柱, 流动相A:2%甲酸;流动相B:甲醇;甲醇洗脱方式:0 min (83%A, 17%B) -9 min (73%A, 27%B) -15 min (58%A, 42%B) -18 min (83%A, 17%B) , 检测波长275 nm, 流速1 m L·min-1, 柱温30℃。利用保留时间和光谱图定性, 外标法定量, 分析茶汤滋味物质儿茶素组分和生物碱类物质。结果:儿茶素组分和生物碱回归方程相关性系数都在0.999 0以上, 有良好的线性关系, 各组分加样回收率为103.68%~82.94%, RSD为0.23%~3.31%。结论:该方法操作简单、快速、准确, 可用于茶汤滋味物质儿茶素组分及生物碱的含量测定。
关键词：茶汤,HPLC,儿茶素,生物碱,测定
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