摘要：枯草芽孢杆菌HS09具备较好益生菌性能，已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高菌株HS09产芽孢发酵水平，以芽孢产量为指标，通过单因素试验及正交试验对枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的碳源、氮源进行筛选及优化，确定最佳发酵培养基。结果表明：影响枯草芽孢杆菌HS09芽孢产量的主次因素为玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。下面是小编为大家整理的《饲用芽孢杆菌水产养殖论文 (精选3篇)》，供大家参考借鉴，希望可以帮助到有需要的朋友。
几株水产用芽孢杆菌的功能分析
摘 要：芽孢杆菌由于功能性强，作用明显，被广泛应用于水产养殖中。为得到一株能有效净化养殖水环境的菌株，本试验从7株芽孢杆菌中筛选出具有高效降氨氮、亚硝态氮、产酶的菌种，其中C24的氨氮去除率达到75%;C22的亚硝态氮去除率可达64%;C12和C13产蛋白酶、淀粉酶能力突出。研究认为可作为水产微生物制剂的候选菌种。
关键词：氨氮;亚硝酸盐;微生物制剂;水产养殖
Analysis of Function of Several Strains of Bacillus in Aquaculture
YANG Yujia， CHEN Ying
(College of Life Sciences， Yantai University， Yantai， Shandong 264005， China)
Key words： ammonia; nitrite; microbial agents; aquaculture
近年来，我国水产养殖业不断发展，随着养殖规模逐渐扩大，养殖密集度、继续恶化程度的加深，养殖环境与水浴生态环境的矛盾也日益突出。我国的水产养殖方式大多为静水养殖，养殖动物的活动、摄食、排泄都在同一池塘内进行，并且以单一品种高密度养殖为主，严重破坏了生态系统的平衡[1]。在高密度养殖中，由于饲料的过量投喂，水产动物排泄物的积累以及渔药滥用，使得养殖水体不断恶化[2]。水体污染物有来自于余料残饵中残留的蛋白质和淀粉，养殖动物粪便、残饵分解及肥料中的大量氨氮、亚硝酸氮和硫化物等，水质好坏直接关系着水产养殖的经济效益。而如何调节和改善水体环境，降低和去除水体污染物(有机物、氨氮、亚硝酸盐)已经成为净化养殖水质的研究热点[3]。就目前来看，用传统的物理及化学方法处理水体氨氮污染，虽然见效快，但投入较大，且容易引起二次污染，而利用微生物调节养殖水体水质被认为是目前最为经济、生态、环保的方法[4-6]。
芽孢杆菌因其具有生长速度快、易培养、抗逆性强等优点，已被越来越多的人所关注，芽孢杆菌具有高活性的消化酶系，能够分解养殖水体中的各种大分子有机物，谢航等研究表明，地衣芽孢杆菌在适宜的水体生态条件下对饲料残饵中的蛋白质与淀粉降解率为60%左右[7]。有些芽孢杆菌还能降解水体中的氨氮和亚硝酸氮等有毒物质，净化水质，有研究表明，巨大芽孢杆菌在氨氮初始浓度为50 mg·L-1的环境下，24 h的氨氮降解率在95%以上[8]。同时芽孢杆菌还能抑制某些病原微生物的生长[9]，提高免疫力，使养殖动物免受病害。因此，芽孢杆菌作为水产微生物制剂的菌株具有广阔的应用前景[10]。
本试验探究几株市售产品中分离的芽孢杆菌的功能，研究它们的生长稳定性、有机物分解能力和氨氮、亚硝酸氮去除能力，为以后开发研制高效净水微生物制剂提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
菌种：从不同种市售芽孢杆菌产品中提取分离得到7株芽孢杆菌，分别是C10-2、C12、C13、C15、C22、C23和C24。留种保存。
主要培养基如下。
(1)牛肉膏蛋白胨培养基(g·L-1)：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，固体培养基加1.5%的琼脂。
(2)生长速度测定培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 1 g，(NH4)2SO4 10 g，酵母膏0.5 g，MgSO4 0.4 g，水1 000 mL，pH 值7.0～7.2、115 ℃灭菌30 min。
(3)酪素水解培养基(g·L-1)：脱脂奶粉50 g，固体培养基加1.5%的琼脂。
(4)淀粉水解培养基(g·L-1)：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，固体培养基加1.5%的琼脂。
(5)卵磷脂酶测定培养基(g·L-1)：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，体积比1∶1的卵黄盐水溶液50 mL，固体培养基加1.5%的琼脂。
(6)耐盐性培养基：含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基。
(7)耐碱性培养基：pH值为10的牛肉膏蛋白胨液体培养基。
(8)氨氮降解筛选和测定培养基(g·L-1)：葡萄糖5.0 g，NH4Cl 2.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.2 g， pH 值7.0～7.5，固体培养基加1.5%的琼脂。
(9)亚硝酸氮测定培养基(g·L-1)：葡萄糖4.0 g，NaNO2 0.5 g，K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4 0.2 g，蛋白胨1.0 g， pH 值7.0～7.5，固体培养基加1.5%的琼脂。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化 在无菌条件下取适量菌种接种于20 mL牛肉膏蛋白胨培养基，28 ℃，100 r·min-1摇床振荡培养24 h(厌氧菌28 ℃静置培养72 h)，于4 ℃保存。
1.2.2 微生物生长速率试验 取活化后的菌液各200 μL，分别接种于20 mL培养基，28 ℃、100 r·min-1摇床振荡培养(厌氧菌静置培养)12和24 h(厌氧菌培养24和72 h)，无菌条件下取适量菌液测定菌液浓度。
1.2.3 有机物分解试验 各取5 μL活化好的菌液，分别点种在酪素平板、淀粉平板和卵磷脂平板上，每个平板上点种3个点，置于28 ℃培养箱内倒置培养24 h(厌氧菌培养72 h)，并观察试验结果。
1.2.4 耐盐耐碱性试验 取活化后的菌液各200 μL，分别接种于20 mL含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基和pH 值为10的牛肉膏蛋白胨液体培养基上，于28 ℃、100 ·min-1摇床振荡培养(厌氧菌静置培养)，培养 24 h(厌氧菌培养72 h)。
1.2.5 抑菌性试验 采用滤纸片法分别浸润芽孢菌悬液，贴在涂有待抑制4种致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌)平板上，28 ℃倒置培养24 h(厌氧菌培养72 h)，观察有无抑菌圈及抑菌圈大小。
1.2.6 氨氮含量测定试验 取适当稀释的菌悬液0.1 mL涂布在氨氮筛选培养基平板上，28 ℃倒置培养24 h，观察菌种生长情况。选取能够在氨氮筛选固体培养基中生长的菌种，并取其菌悬液0.5 mL接种于20 mL的氨氮测定培养基的100 mL三角瓶中，28 ℃、120 r·min-1振荡培养(C22 28 ℃厌氧静置培养)24 h。菌液适当稀释后测定氨氮含量，氨氮测定方法为次溴酸盐氧化法(参照GB 17378.4—2007)。
1.2.7 亚硝酸氮含量测定试验 取0.5 mL活化好的不同菌种，分别接种于20 mL的亚硝酸氮测定培养基1和2的100 mL三角瓶中，于28 ℃、120 r·min-1振荡培养(C22于28 ℃厌氧静置培养)24 h，适当稀释后测定菌液浓度OD600和菌液的亚硝酸氮含量。亚硝酸氮测定方法为萘乙二胺分光光度法。
2 结果与分析
2.1 芽孢杆菌生长的测定
从图1可知，C22为厌氧菌，生长情况较差，其余菌种生长情况良好。其中：C24在24 h的菌液浓度最大，生长情况最好;C15前期生长较差，24 h生长旺盛;C10-2、C12、C13和C23前后菌浓度差别不大。
2.2 不同芽孢杆菌酶活能力的测定
如表1所示：所有菌种都有分泌蛋白酶的能力，C22分泌蛋白能力较差;从产淀粉酶的能力来看，C15、C22产淀粉酶能力非常弱，无法看到淀粉水解的透明圈，其余菌种都有较强的淀粉水解能力;从产卵磷脂酶的能力来看，C23、C24产卵磷脂能力很强，C10-2、C12和C13产卵磷脂酶能力次之，C22对卵磷脂的降解能力较小，C15不产生卵磷脂酶。
2.3 不同芽孢杆菌的耐盐性试验
如表2所示，在耐盐性试验中，除了C24试验组(含3%NaCl)的生长情况好于对照组(含0.5%NaCl)之外，其余菌种在对照组中的生长情况好于试验组，C22的生长情况较其余菌种的生长浓度小的多。
2.4 不同芽孢杆菌的耐碱性试验
如表3所示，在耐碱性试验中，对照组(普通牛肉膏蛋白胨培养基)的生长情况很好，试验组(pH10的牛肉膏蛋白胨培养基)基本没有生长，C22的生长结果在两组均较差。
2.5 不同芽孢杆菌的抑菌试验
抑菌试验结果：7个菌种对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌结果如表4所示。
在金黄色葡萄球菌的抑菌试验中，可以看出C10-2、C12和C13的抑菌效果较好，C22、C23和C24的抑菌效果稍差一些，C15没有抑菌效果。
2.6 不同芽孢杆菌的氨氮降解试验
7种芽孢杆菌在氨氮筛选平板上均有菌落出现，表明这7种芽孢杆菌都能以NH4Cl作为氮源生长，具有去除氨氮的能力，需要对其去除氨氮能力进行定量测定。试验结果显示(表5)：不同菌种培养24 h均有良好的生长;经过24 h的培养，不同菌种对氨氮的降解率均达到50%以上，其中C12、C22、C23和C24对氨氮降解率可以达到70%。
2.7 不同芽孢杆菌的亚硝酸氮降解试验
如表6所示，不同菌种经过24 h培养后，菌种均有生长，但生长浓度不高;亚硝酸氮的降解率最好的是C22，达到64.4%，C13的亚硝酸降解率最差，其余菌种的降解率均不高。
3 结论与讨论
有许多研究表明，芽孢杆菌具有降低氨氮和大分子有机物的能力，枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌具有明显的去除氨氮和亚硝酸氮的功能，利用枯草芽孢杆菌制剂改良罗氏沼虾养殖池塘水质，氨氮最大降解率为59.61%，亚硝态氮的最大降解率为86.70%，地衣芽孢杆菌可以有效地分解残饵中的蛋白质和淀粉;芽孢杆菌还可促进微藻、颤藻等有益藻类的生长，抑制嗜水气单胞菌、爱德华氏菌等水产致病菌的繁殖扩散[11-12]。此外，芽孢杆菌对养殖动物还有益生作用，像一些短小芽孢杆菌可以作为水产动物的促生长添加剂，添加芽孢杆菌的饲料可以更明显地提升其在养殖动物肠道中的作用。例如在饲料中添加枯草芽孢杆菌，可以显著提高宿主肠道内消化酶的活性，增加肠道中有益菌群(如双歧杆菌和乳杆菌)的数量。芽孢杆菌的种类繁多、功能各异，是目前在水产养殖中应用最普遍，使用数量最多的菌种，其研究与发展前景十分广阔。
本试验对从不同种市售芽孢杆菌产品中提取分离得到的7株芽孢杆菌进行分类筛选，发现芽孢杆菌C24在基本培养基和高盐的培养基中均能旺盛生长，分泌胞外酶，对氨氮的降解率均达到75%以上，并且同时具有降低亚硝态氮的能力，说明其生长速度快，有一定的抗逆性，能有效去除水中氨氮，可作为高效氨氮降解的水产试验菌种。C22作为试验中唯一的厌氧菌，生长速度缓慢，菌液浓度偏低，所表现出的酶活力、抑菌能力也较差，但在亚硝酸氮的降解试验中，对亚硝酸氮的降解率明显高于其他菌种，达到64.4%，可作为有效去除亚硝态氮的水产试验菌种。C12和C13生长迅速，产蛋白酶、淀粉酶能力较强，可作为水体有机质降解的水产试验菌株。本次试验中得到的芽孢杆菌，虽然在去除氨氮，亚硝酸氮和有机物的降解等方面作用具有可行性，但其在应用实际生产中的降氨效果与有机物分解效率还需进一步研究。
参考文献：
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作者：杨宇嘉 陈营
枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的优化
摘要：枯草芽孢杆菌HS09具备较好益生菌性能，已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高菌株HS09产芽孢发酵水平，以芽孢产量为指标，通过单因素试验及正交试验对枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的碳源、氮源进行筛选及优化，确定最佳发酵培养基。结果表明：影响枯草芽孢杆菌HS09芽孢产量的主次因素为玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵优化培养基为葡萄糖10 g·L-1、硫酸铵8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、硫酸锰0.5 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1 、磷酸二氢钾2 g·L-1、碳酸钙3 g·L-1;以最佳产孢发酵培养基进行200 L发酵罐放大发酵，发酵有效菌落数可达4.3×109 cfu·mL-1，实现芽孢90%高转化率。该研究结果可为菌株工业化生产提供参考依据。
关键词：枯草芽孢杆菌;培养基;优化;正交试验
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.03
Key words： Bacillus subtilis;Culture medium;Optimization;Orthogonal experiment
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是芽孢杆菌属的一种腐生细菌，由于发酵能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等十几种酶[1]，是重要的微生态益生菌。我国水产养殖业高速发展，但近年来水产养殖业在养殖密度和规模不断扩大的同时，也面临着日益严峻的食品安全问题。传统的抗生素虽然在治疗动物疾病、促进动物生长方面有明显优势，但其负面效应也日益突出，表现为病原微生物产生耐药性、不易降解等缺点，从而危害人类健康。因此，抗生素替代品益生菌、酶制剂等产品成为绿色饲料添加剂的热点[2-3]。微生态制剂作为抗生素的替代物之一，因其无毒副作用及不存在抗药性等优点，在养殖业中具有广阔的应用前景[4]。枯草芽孢杆菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一[5]，其对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很強的抑制作用，能够有效预防水产动物肠炎、烂鳃等疾病;能够分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质;同时具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能够促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分;能够减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益[6-8]。
为了便于运输、保存及应用，芽孢杆菌型微生态制剂通常加工为芽孢菌粉。枯草芽孢杆菌HS09具备较好的益生菌性能，常作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高产孢发酵水平，本研究进行枯草芽孢杆菌HS09培养基优化，以期降低生产成本，旨在为枯草芽孢杆菌微生态粉剂的工业化生产提供参考依据。
1材料与方法
1.1菌株
枯草芽孢杆菌HS09，由福建汇盛生物科技有限公司研发中心菌种室保藏。
1.2培养基
(1)平皿培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH 7.2。
(2)种子培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，水1000 mL，pH 7.2。
(3)碳源基础发酵培养基：酵母粉8 g，豆粕粉20 g，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.5 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾2 g，碳酸钙3 g，水1000 mL。
(4)氮源基础发酵培养基：葡萄糖10 g，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.5 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾2 g，碳酸钙3 g，水1000 mL。
1.3试验方法
1.3.1摇瓶发酵培养从活化到期的枯草芽孢杆菌HS09平皿挑取2个单菌落接入种子培养基(100 mL/500 mL三角瓶)中，置于37℃，180 r·min-1摇床中培养16 h，按照体积5%的接种量移入发酵培养基(500 mL/2000 mL三角瓶)中，置于37℃，200 r·min-1摇床中培养24 h。
1.3.2碳氮源单因素优化(1)培养基碳源筛选：在碳源基础发酵培养基中，分别加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，初始pH 6.8条件下发酵培养，考察不同碳源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。(2)培养基氮源筛选：在氮源基础发酵培养基中，分别加入硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，初始pH 6.8条件下发酵培养，考察不同单一氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。(3)复合氮源的优化：在单一氮源试验结果的基础上进行复合氮源配比试验，复合氮源配比方案见表1，在初始pH值6.8条件下发酵培养，考察复合氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。
1.3.3碳氮源正交优化在碳氮源单因素优化基础上，选择葡萄糖、硫酸铵、玉米粉3个因素，设计L9(34)正交试验优化，L9(34)正交试验设计因素及水平见表2。
1.3.4200 L发酵罐放大培养从活化到期的枯草芽孢杆菌HS09平皿挑取8个单菌落接入种子培养基(500 mL/2000 mL三角瓶)中，置于37℃，200 r·min-1摇床中培养16 h，按照体积2%的接种量移入体积200 L发酵罐(装液量120 L)中，温度37℃，罐压0.04 Mpa，初始pH值6.8，搅拌转速和通气量控制方案如表3，发酵过程pH自然，培养24 h。每2 h取样检测，观察芽孢形成情况，当芽孢率达到90%即发酵完成，放罐。
1.3.5发酵液菌数的测定(1)发酵液有效菌落数(cfu·mL-1)测定：采用平板菌落计数法检测细菌总数;(2)发酵液芽孢数量测定：发酵液经80℃水浴加热15 min后，用稀释倒平板法检测芽孢的产量[9]。(3)发酵液芽孢率快速计算：采用血细胞计数板计算发酵液总菌数与芽孢数，芽孢数与总菌数的百分比，即发酵液芽孢率。
2结果与分析
2.1碳源对枯草芽孢杆菌HS09发酵的影响
在碳源基础发酵培养基中，分别加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，考察不同碳源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影响。从图1可以看出，枯草芽孢杆菌对4种碳源都可以利用，但发酵后期菌体不易转为芽孢。其中以葡萄糖作为碳源使用时，菌落总数最高，达到2.8×109 cfu·mL-1。因此，选择葡萄糖作为枯草芽孢杆菌发酵的最优碳源。
2.2氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵的影响
2.2.1单一氮源优化在氮源基础发酵培养基中，分别加入硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，考察不同氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影響。从图2可以看出，枯草芽孢杆菌发酵培养基中使用单一氮源，菌落总数整体不高，但不同氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量有明显区别。以豆粕粉作为氮源时，菌落总数最高;其中以硫酸铵和玉米粉作为氮源时芽孢转化率最好，分别达到80%和90%。
2.2.2复合氮源优化根据单一氮源试验结果，在氮源基础发酵培养基上，按照表1所列试验方案，对不同氮源进行复配，考察复合氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影响。从图3可以看出，使用复合氮源明显提高枯草芽孢杆菌菌落总数，其中以(硫酸铵10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)和(硫酸铵5 g·L-1+豆粕粉5 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)两个组合菌落总数最高，均达到3.5×109 cfu·mL-1，芽孢转化率分别为90%和75%。因此，选择(硫酸铵10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)作为复合氮源，进行下一步正交试验。
2.3正交试验优化
2.3.1碳氮源正交试验优化根据碳源、单一氮源、复合氮源试验结果，选取葡萄糖浓度为5 、10、15 g·L-1，硫酸铵浓度为2、5、8 g·L-1，玉米粉浓度为10、15、20 g·L-1为试验条件进行正交试验。以芽孢产量为指标，确定最优配比。从表4结果可知，影响枯草芽孢杆菌芽孢产量的主次因素是C>B>A，即玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。枯草芽孢杆菌产芽孢培养基中最佳碳、氮源配比为A2B3C2，即葡萄糖10 g·L-1、硫酸铵8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1。
2.3.2验证试验结果对2.3.1正交试验设计组合7(A3B3C2)和最优方案A2B3C2二者进行摇瓶试验验证，试验结果见表5。表5结果显示，两种方案芽孢产量相差不大，验证了最优方案(A2B3C2)是可行的。
2.4200 L发酵罐放大发酵培养
在摇瓶优化的基础上，进行200 L发酵罐放大试验。发酵罐装液量120 L，温度37℃，罐压0.04 Mpa，初始pH 6.8，搅拌转速和通气量控制如表2，发酵过程自然pH，培养24 h。发酵过程中每2 h取样检测，记录pH、OD600、芽孢转化率，绘制发酵过程曲线，结果如图4。
从图4可见，在0～2 h枯草芽孢杆菌HS09处于适应期，菌液OD600值没有增长。随着发酵的进行，4 h开始OD600值快速增长，说明枯草芽孢杆菌HS09在4 h左右进入对数生长期，此时菌体大量繁殖，16 h后OD600值趋于稳定，枯草芽孢杆菌HS09菌体的生长进入稳定期。通过降低发酵通气量和搅拌转速，促进芽孢形成。芽孢在18 h左右开始形成，22 h芽孢大量形成，24 h芽孢转化率达到90%。发酵过程中pH自然，0～4 h阶段pH呈现先下降趋势，这是由于菌体在繁殖过程中分解有机物产酸;随后pH回升，这过程可能与氨基酸的降解产生铵根离子有关;6 h之后pH保持下降趋势，菌体处于大量繁殖的对数生长期引起的快速产酸有关，但pH基本保持在5.9以上;16 h后pH呈快速上升趋势，芽孢随之快速形成。试验验证了申烨华等[10]对芽孢杆菌发酵工艺的研究结果：参与合成伴孢晶体的酶最适pH为6.5～7.5。最终，枯草芽孢杆菌HS09在200 L发酵罐培养的发酵液有效菌落数为4.3×109 cfu·mL-1，芽孢转化率达到90%。发酵罐培养比摇瓶菌落数(3.4×109 cfu·mL-1)有较大提高，说明在发酵罐培养过程中体系溶氧更充足、更均匀，氧传递速度增加，促进菌体的大量积累。
3结论与讨论
芽孢杆菌型微生态制剂通常是加工为芽孢菌粉，芽孢菌粉比菌体粉具备更好的抗逆性，在干燥加工、运输、保存过程损失较少，因此枯草芽孢菌发酵除了考察发酵的最终菌数，还必须考虑放罐前菌体能够大部分转化为芽孢。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌HS09产芽孢培养基的组成对菌株的生长及芽孢形成有很大影响，尤其是培养基中的氮源。通过碳氮源的单因素试验、复合试验及正交优化，确定了枯草芽孢杆菌HS09产芽孢培养基的最佳碳源为葡萄糖(10 g·L-1)、最佳氮源为硫酸铵(8 g·L-1)与玉米粉(15 g·L-1)复合氮源。
在摇瓶优化的基础上，进行200 L发酵罐放大试验。发酵罐装液量120 L，温度37℃，罐压0.04 Mpa，初始pH 6.8，在发酵前期增加通气量及搅拌转速，有利于提高菌体产量;在发酵对数生长期后期，通过逐步降低通气量及搅拌转速，以促进芽孢转化。最适放罐时间24 h，发酵罐培养获得有效活菌数为4.3×109 cfu·mL-1，芽孢率90%，比摇瓶培养有效活菌数(3.4×109 cfu·mL-1)有明显提高，说明溶氧对枯草芽孢杆菌HS09的发酵培养有显著的影响。在提高枯草芽孢杆菌HS09有效菌落数上，可通过后期罐上培养将进行流加营养补料试验方案优化。枯草芽孢杆菌HS09具备较好益生菌性能，已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。本研究结果可为枯草芽孢杆菌HS09工业化发酵提供了参考依据。
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(责任编辑：林玲娜)
作者：陈俊煌
水产饲用益生菌的作用机理及功效
摘要:从分析益生菌的作用机理出发,介绍了几种常见水产饲用益生菌具有的提供营养、促进生长、增强养殖动物免疫力、预防疾病、分解有机污染物、净化水质、改善养殖生态环境的功效,提出了其目前存在的问题并进行展望,对今后水产养殖业中更好地应用益生菌具有重要的指导意义。
关键词:水产;益生菌;作用机理;功效
Functional Mechanism and Efficacy of Feed Probiotics in Aquaculture
LIU Shu-ji, WU Cheng-ye
(Fisheries Research Institute of Fujian,Xiamen, Fujian 361012,China)
Key words: aquaculture;probiotics;functional mechanism;efficacy
在水产养殖过程中由于大量投喂饲料,造成水体中残余饲料、水产动物的排泄物及残骸大量积累,细菌繁殖几率增加,导致水质变差,水产病害时有发生。虽然抗生素及化学药物可缓解细菌繁殖及水产病害问题,但过量使用会引致一系列相应的问题,如养殖产品抗生素超标将破坏水产动物肠道内菌群的结构,使动物体内的微生态失调,病原菌耐药性、抗药性增强,从而引发水产品的质量安全问题。
益生菌制剂是一类从宿主体内分离的正常菌群制成的活菌制剂,通过调节肠道内微生物平衡对宿主产生有益影响[1],又称为微生态制剂。1986年,Kozasa[2]首次将益生菌应用于水产养殖中,他用从土壤中分离到的芽孢杆菌处理感染了爱德华氏菌的日本鳗鲡,其死亡率大大降低。此后,关于益生菌预防病害、改善养殖水质、促进生长的研究迅速开展。益生菌发挥功效是基于其菌体本身具有丰富的营养,且能够分泌拮抗物质与病原菌争夺黏附位点或营养物质等。因此,在水产饲料中添加益生菌替代部分抗生素,不仅能促进水产动物的生长发育,还能诱化养殖动物的消化道,提高动物的免疫力,抑制病原微生物,从而有效预防或减少水产疾病的发生,保障水产品安全,降低水产养殖业的风险系数。吴志新等[3]发现,饲料中添加微生态制剂可以显著提高银鲫成鱼血液中白细胞的吞噬活性和血清溶菌酶活性,增强银鲫鱼的免疫力。吴垠[4]研究也发现微生态制剂能够提高对虾的生长速度和抗病力。可见,益生菌在水产养殖中的应用功效已被广泛认同。笔者就水产动物中常见的饲用益生菌的功效及研究情况进行分析,为在水产养殖业中更好地更加广泛地利用益生菌,确保水产品安全提供参考。
1水产饲用益生菌种类
益生菌作为饲料添加剂的一种,既无药残,无污染,又可改善水产动物的健康状况,净化水质,改善养殖环境,在全世界范围内已广泛使用,目前全球饲用益生菌的销售额逐年增加[5](图1),特别是最近几年,对于益生菌的需求更是大幅度增加。
中国水产养殖业中常用的饲用益生菌主要有光合细菌(Photo Synthetic Bacteria,PSB)、芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、酵母菌(酵母培养物和活性干酵母)和乳酸菌(嗜酸乳酸菌和双歧杆菌)等(表1)。
2水产饲用益生菌的作用机理
2.1光合细菌
光合细菌在水产养殖业中研究最多,应用最广泛,是一大类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌总称[6],属于革兰氏阴性细菌,具有较强的利用水体中低级有机物的特性,菌体含有丰富的蛋白质、叶酸、B12、生物素、抗病毒物质和生长促进因子,可以作为优质饲料和饵料,促进水产动物生长,增强动物抗病能力。光合细菌还含有细菌叶绿素,能进行光合作用,但并不消耗氧气,也不产生氧气,能以水中的有机物作为自身繁殖的营养源,迅速分解利用水中的氨态氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质,以及残余的水产动物饵料和排泄物,起净化水质的作用。
2.2芽孢杆菌
芽孢杆菌是一类好气性革兰氏阳性菌,在生长繁殖过程中能够产生B1 、B2、B6 等B族维生素和维生素C、维生素K2[7],为水产动物提供维生素营养。贮藏过程中以孢子形式存在,不易死亡,不消耗饲料的营养成分,可保持饲料的品质。孢子能够在肠道内迅速100%复活,消耗大量的氧,维持肠道厌氧环境,抑制致病菌的生长。复活的孢子能够产生多种高活性的水解酶类,降解饲料中复杂的碳水化合物,促进动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌还可作为一种水质调节剂,净化养殖水环境。
2.3乳酸菌
乳酸菌是一类以糖为原料发酵产生乳酸的细菌,属于革兰氏阳性菌,能分解食物中的蛋白质、糖类、脂肪等,提高食物的消化率和生物价,并产生大量有机酸使肠道pH值降低,抑制病原菌的克隆和定殖[8],维持肠道微生态平衡。代谢产物中有抗胆固醇因子,可降低血清中胆固醇含量;另外,乳酸菌细胞壁能与变异原性物质和致癌物稳定结合,具有抗变异原性[9]。
2.4酵母菌
酵母菌属于兼性厌氧微生物,在有氧和无氧的状态下都能生存,其含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素,可作为蛋白质饲料;还含有多种酶类,对饲料的消化率高,一般可达80%～90%。酵母细胞壁可使水产动物的T、B淋巴细胞的数量增多,促进免疫器官的发育,增强非特异性免疫[10]。酵母菌能够利用水中的糖类、有机酸、氨态氮、硫化氢等物质作为自身生长的营养,大量繁殖,在与有害菌的生存竞争中成为优势群,抑制有害菌的生长,有效地降低水体中有机物和有毒有害物质的含量,净化水质,改善水生动物的生长环境,减少水产动物患病的几率。
3水产饲用益生菌的功效
3.1提供营养,促进生长
大部分益生菌菌体含有丰富的蛋白质,可作为蛋白源饵料或饲料添加剂。且饲用后能在水产动物消化道内生长和繁殖,并产生多种营养物质,如氨基酸、维生素、脂肪酸、蛋白肽、促生长因子等,参与水产动物的新陈代谢,利于水产动物的生长。有的益生菌还可以产生消化酶或分泌一些酶类,消化分解宿主动物无法利用的食物成分。王梦亮等[11]发现光合细菌可使鲤鱼肠道中的淀粉酶和蛋白酶活性分别比对照组提高2.68和2.94倍,并认为这可能是光合细菌添加剂能够促进生长作用的一个重要的因素。丁贤等[12]将芽孢杆菌按一定比例添加到水产动物饲料中,发现其在一定程度上可提高养殖动物的蛋白酶和淀粉酶活性,使其生长性能得到明显的改善。乔振国[13]将光合细菌菌液以1.2%～4.8%的量添加到饲料中,饲喂中国对虾40 d后,增重率比对照组提高11.9%～16.2%。王玲娜等[14]从浓缩的光合细菌中分离纯化到1株红色非硫光合细菌,加入饲料中饲养黑曲鱼20 d,黑曲鱼成活率比对照组提高了20%,平均体长提高了2%,平均体重提高了3%。朱励华[15]在淡水鱼饲料中添加6 mL/kg光合细菌液,淡水鱼培育成活率比对照组提高了27.8%,使11.8 cm左右的鱼种增产183.75 kg/hm2,每千克鱼种的生产成本降低6.96%。Lin[16]证实饲料中添加芽孢杆菌有利于改善凡纳滨对虾的生长和消化性能。刘哲来等[17]在饲养建鲤的饲料中添加0.5%的“XP” (一种纯正的酵母培养物)发现有明显的促进生长的作用,特定生长率比对照组提高了26.83%,饲料系数降低了22.54%。
3.2增强免疫功能,预防水产动物疾病发生
水产动物的病害及药物残留问题一直是困扰水产养殖业的主要问题。控制病害的发生,一方面要抑制病原菌的生长与繁殖,减少疾病发生的机会;另一方面要增强水产动物的免疫力。利用微生态制剂,通过营养竞争、空间竞争或分泌抗生素、细菌素等物质拮抗其他微生物的生长。Maeda等[18]提出利用微生物间的拮抗作用,即通过病原菌在水产养殖环境中能被其它有益微生物杀死或削减作为生物防治的一种处理方法。当有益菌在消化道内占优势菌群地位时,就可以抑制消化道粘附的病原菌,维持肠道微生态平衡,排除或控制潜在的病原体[19]。杨绍斌等[20]试验证明,在臭氧配合下,随着光合细菌投放量的增加,患病鱼数量逐渐变少,光合细菌投放量为1%时,可有效预防观赏鱼烂鳃病和水霉病。李勤生[21]用光合细菌(稀释)浸泡患有烂鳃病的鲤、水霉病的金鱼10～15 min,鱼都全部存活。Nikoskelainen等[22]用含鼠李糖乳杆菌的饵料饲育虹鳟鱼,发现鱼的免疫力大大提高,且受杀鲑气单胞菌感染后的死亡率也明显降低。北村博等[23]发现恶臭污水中的光合细菌体内含有抗病毒物质,能消除水中某些动物和人类的致病病毒。Rengpipat等[24]用含芽孢杆菌S11的饲料投喂斑节对虾,饲养100 d后,将虾放入含有虾病原菌的水体中浸泡10 d,用含芽孢杆菌饲料喂养的虾成活率为100%,而对照组的成活率仅为26%。赵卫红等[25]试验表明,光合细菌、芽孢杆菌及其1∶1的混合制剂均能提高异育银鲫鱼血液中白细胞的免疫机能,以混合制剂作用效果最佳,在5×108、5×109、5×1010 CFU/m3 的浓度范围内,微生态制剂的作用效果随着添加量的增加而增加。
3.3 分解有机污染物,净化水质,改善养殖生态环境
当前水质恶化成为导致水产动物存活率和产量下降的重要原因。养殖过程中残余的饵料、水产动物残骸及排泄物等有机物的累积产生了许多有毒有害物质,滋生大量病原菌,污染生态环境。益生菌可以降解和转化水体中的有机物,减少或消除氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害物质,抑制病原微生物的生长,改善水质。刘慧玲等[26]从虾养殖池底泥中分离和筛选出的光合细菌I,能够降解养殖水体中的亚硝酸盐,对亚硝酸盐的去除率达70.4%。沈锦玉等[27]发现光合细菌能够降低池塘水中氨氮、亚硝态氮、有机物(COD);使用光合细菌后,异氧细菌的总数比原来下降50%;饲料中添加光合细菌,鲫鱼、罗非鱼血清中溶菌酶的活性明显高于对照组,生长速度也明显加快,发病率降低了25%以上。徐成斌等[28]分离到4株光合细菌,其混合菌株能够去除河蟹养殖水中的CODc 和NH4-N。经96 h,对CODc的去除率达78.5%,NH4-N的去除率达91.4%。邢华[29]利用光合细菌(PSB)净化虾池水质,NH4-N下降77.8%,溶氧提高84.8%。Porubcan[30]利用芽孢杆菌改善水质,结果降低了水中的化学耗氧量,提高了对虾产量。张庆等[7, 31]向罗非鱼养殖水体中每隔25 d添加1次以芽孢杆菌为主的微生物复合菌剂,明显改善了水质条件,有效降低了氨氮和亚硝酸盐,促进了罗非鱼的生长。
4 水产饲用益生菌存在的问题与展望
饲用益生菌在提高水产动物抗病能力、提高饲料转化率、改善生态环境等方面发挥着明显的作用,且无污染、无残留、安全,有利于绿色食品的生产及生态环境的净化,有利于人类的健康,发展前景十分广阔,但在如何充分发挥饲用益生菌的功效等方面仍存在一些问题:(1)不同的养殖品种、不同的生长时期,益生菌发挥的功效不同。应根据具体情况选择合适的益生菌,于不同生理阶段适当地添加;(2)有的益生菌制剂在制作、贮藏过程中活力与稳定性容易受破坏甚至死亡,导致实际应用的效果不理想,因此应尽可能的按照益生菌的特性及使用说明进行贮藏,保持益生菌的活力和稳定;(3)某些抗生素的药效比较强,有的益生菌可能也会被抗生素抑制,因此,应研究如何采取多种益生菌配合使用,或将益生菌与抗生素、酶制剂、多肽、酸化剂等物质联合使用[32],以提高益生菌的功效;(4)长期使用抗生素及化学药物容易引起病原菌的耐药性和突变等,如何根据益生菌的生物学特性,将其作为基因工程的受体菌株,应用基因工程技术进行改造[33],克隆及表达有用的氨基酸合成酶基因或抗原基因,研制耐受常规化学药物、抗热、抗碱、抗酸的新菌种,是亟待解决的问题,这将成为今后益生菌研究的重点,将推动微生物及水产动物行业的发展。
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作者：刘淑集,吴成业
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