摘要：为了建立一种快速、有效鉴定谷子粒黑穗病菌(Ustilagocrameri)的分子检测方法，使谷子粒黑穗病得到有效的监测和防治，采用真菌通用引物ITS1/ITS4对谷子粒黑穗病菌ITS序列进行扩增，扩增产物测序后，依据粒黑穗病菌序列设计合成了1对引物，分别以谷子粒黑穗病菌DNA、谷子白发病菌DNA、谷瘟病菌DNA、玉米黑粉菌DNA及谷子叶片基因组DNA作为模板进行PCR扩增。结果表明，仅谷子粒黑穗病菌DNA作模板时有1条特异性扩增条带，且检测的灵敏度可达10pg/μL，其他材料均未出现扩增条带;将建立的PCR技术用于田间植株检测，能特异性检出谷子穗梗及旗叶中谷子粒黑穗病菌的存在;不同品种谷子植株中的病菌检出率与田间发病率数据基本一致，说明所用引物和PCR检测体系在鉴定粒黑穗病菌感染和植株抗病性方面具有较高的特异性。研究建立的谷子粒黑穗病菌PCR检测体系具有快速、准确、特异性和实用性强等特点，可为谷子粒黑穗病的监测和有效防治提供技术支持。
关键词：谷子;粒黑穗病菌;PCR检测
谷子(Setariaitalica)是一种重要的禾本科作物，在我国有8000多年的栽培历史，属山西省优势杂粮作物。随着谷子种植面积的不断扩大，多种病害时有发生[1]，谷子黑穗病在我国的主要产区均有不同程度的发生，其中，谷子粒黑穗病是最常见的，其致病菌为粒黑穗病菌(Ustilagocrameri)[2]。病菌孢子随谷种播种进入土壤，随后孢子萌发侵染幼苗，在植株体内蔓延，最终危害谷子穗部。被病菌侵染的籽粒因病原菌冬孢子大量形成变为黑粉，黑粉外包坚韧的灰白色膜，有一定机械强度。当谷子收获脱粒或经风吹摩擦时，籽粒破裂散出黑粉污染种子，来年随种子播种进入谷田。目前对谷子黑穗病的控制主要靠农药[3]，而抗病品种的使用才是解决问题的根本。
针对不同地域病原菌生理小种的差异[4]，对抗病品种的常规筛选主要是应用形态学鉴定，通过对相同种植条件下不同品种谷子植株的感病特性进行分析比较，由发病率和发病程度判断品种对病原菌小种的敏感或抗性[5-6]，该过程比较费时，不利于控制病害的传播。因此，寻找一种快速、灵敏、有效的方法来检测不同品种的抗病性是十分重要的。
近年来，研究人员应用PCR技术检测植株组织中的病原菌DNA来判断病原菌对植株的侵染特征，该过程操作简便、特异性强、快速、经济[7]。目前已建立了针对玉米和高粱的丝黑穗病[8-9]、小麦白粉病和散黑穗病[10-11]、甘蔗黑穗病[12]等的PCR检测技术。用PCR技术检测特定植物病原菌主要靠引物的有效性，引物设计用到的基因序列有：真菌核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)及间隔区，如基因间区(In-tergenicspacer，IGS)、核糖体基因内转录间隔区(Internaltranscribedspacer，ITS)等[13-14];未知的特异DNA片段;保守的蛋白基因序列。但到目前为止，应用PCR方法检测谷子粒黑穗病菌的研究未见报道。
本研究根据黑穗病菌ITS序列设计PCR引物，建立了谷子粒黑穗病菌的快速检测体系，并证明所用引物和PCR检测体系在鉴定病菌感染和植株抗病性方面具有较高的特异性，可快速、准确地监测谷子粒黑穗病，并为提前预防谷子粒黑穗病提供特异性高、实用性强的技术支持。
1材料和方法
1.1试验材料
谷子粒黑穗病菌(Ustilagocrameri)冬孢子、谷瘟病菌(Pyriculariasetariae)菌丝，由山西农业大学谷子研究所郭二虎研究员提供;谷子白发病菌(Sclerosporagraminicola)孢子、玉米黑粉菌孢子采自大田发病植株。
1.2试验方法
1.2.1材料准备取谷子粒黑穗病菌冬孢子粉过0.297mm筛，用于谷种拌菌。选用对黑穗病抗性不同的谷子品种晋谷21和长农35，设谷种拌菌组与不拌菌对照组，同期播种于山西农业大学谷子研究所试验田。每个处理播种3个小区作为重复，每个小区面积30m2，拌菌组与对照组间设置隔离带。在谷子拔节期与抽穗期，每小区随机选3个样点，每个样点随机选取生长一致的5株植株，采集拌菌组与对照组植株各5株，带回实验室备用。
1.2.2病原菌和谷子DNA的提取称取一定量的病原菌孢子粉或谷子叶片/穗梗于研钵中，加少许石英砂，加入CTAB提取液[15-16]，充分研磨，匀浆液转入离心管中于65℃水浴50min，10000r/min离心10min，取上清加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1(V/V))，10000r/min离心10min。取上清，加入RNaseA，37℃水浴40min。加入等体积的预冷异丙醇，12000r/min离心15min，沉淀用75%乙醇漂洗，溶于TE。用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA分子的完整性，测OD260和OD280值检测提取物的浓度和纯度。
1.2.3谷子粒黑穗病菌DNA的序列分析以真菌ITS的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为扩增引物，以谷子粒黑穗病菌DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验合格后送华大基因有限公司测序，测序结果用Blast进行分析，并用ClustalX，MEGA5.0获得系统发育树。
1.2.4谷子粒黑穗病菌特异性引物设计将菌株Ustilagoavenae(登录号AY740062.1)、Ustilagohordei(登录号AY740068.1)、Ustilagomaydis(登录号AY345004.1)、Ustilagonuda(登录号AY740069.1)的rDNA-ITS序列与谷子黑穗病菌ITS序列进行比对，选择与谷子黑穗病菌ITS序列相似度高的菌株的ITS序列，利用生物学软件ClustalX进行比对分析，运用软件PrimerPremier5.0设计谷子粒黑穗病菌特异性引物，其中，上游引物F1序列为5′-AGACGGGTTTACCACTCAAC-3′，下游引物R1序列为5′-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3′，由生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.5引物特异性及灵敏度检测分别以谷子黑穗病菌孢子、谷子白发病菌孢子、谷瘟病菌菌丝、玉米黑粉菌孢子及对照组谷子叶片的基因组DNA作为PCR扩增模板，用自行设计的谷子粒黑穗病菌ITS引物进行PCR扩增。扩增体系为20μL，包括：10×Buffer2μL，dNTP1.6μL，引物各0.4μL，DNA模板量0.4～1.0μL，Taq酶0.2μL，余量用双蒸水补足。扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环;最后72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
将谷子粒黑穗病菌基因组DNA浓度分别调整为100、10、1ng/μL、100、10、1、0.1pg/μL，作为PCR扩增模板，采用上述引物和条件进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.6大田谷子植株粒黑穗病菌侵染性检测以谷种拌菌组和不拌菌对照组谷子的旗叶和穗梗的基因组DNA作为PCR扩增模板，用谷子粒黑穗病菌ITS引物进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现特异性扩增条带则说明谷子特定组织被黑穗病菌侵染。
2结果与分析
2.1谷子粒黑穗病菌ITS序列特征分析
将提取的谷子粒黑穗病菌冬孢子DNA进行ITS-PCR扩增，扩增产物测序结果在GeneBank中进行Blast检索分析，构建NeighbourJoining分子发育树。结果显示(图1)，粒黑穗病菌孢子ITS序列长度在700bp左右，与GeneBank数据库中的谷子粒黑穗病原菌(AY344999.1Ustilagocrameri)的序列同源性为95%，系统发育树中聚在一支。说明本研究从田间发病谷穗得到的病原菌为谷子粒黑穗病菌。
2.2引物特异性与灵敏度检测
用自行设计的谷子粒黑穗病菌引物对不同供试样品基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物电泳分析发现，仅谷子粒黑穗病菌基因组DNA作模板时能扩增出1条特异性条带，大小与目标片段(320bp)基本一致，其他供试菌株及对照组谷子叶片没有扩增产物。结果表明，所设计的引物对谷子粒黑穗病菌具有特异性(图2)。
采用相同的扩增体系和扩增程序，测试粒黑穗病菌基因组DNA模板量对扩增的影响，结果表明(图3)，模板质量浓度为100、10、1ng/μL以及100、10pg/μL时均可获得清晰的目标条带，模板量为1、0.1pg/μL时，PCR扩增未能得到目标条带。因此，本研究建立的PCR检测体系在粒黑穗病菌基因组DNA质量浓度为10pg/μL时能够检出。
2.3PCR检测大田谷子植株中的病原菌结果
以谷子穗梗和旗叶顶端组织基因组DNA作模板，用自行设计的谷子粒黑穗病菌引物进行PCR检测。结果发现，以未拌菌对照组谷子穗梗和旗叶基因组DNA为模板进行PCR扩增时，琼脂糖凝胶电泳未检出扩增产物;以拌菌发病植株穗梗和旗叶的基因组DNA为模板，PCR扩增检出了谷子粒黑穗病菌的特异性序列(图4)。
以拌菌未发病植株穗梗和旗叶基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物电泳结果表明(图5)，晋谷21的5株植株中有1株的穗梗及旗叶中扩增出特异性条带，有1株旗叶中扩增出条带、穗梗中未扩增出条带，其余3株的穗梗和旗叶中均没有扩增产物;长农35有4株的穗梗和旗叶中检测出特异性条带，1株穗梗和旗叶中均没有检出扩增产物。结果表明，长农35拌菌组植株中黑穗病菌检出率高于晋谷21，该结果与2个品种的黑穗病发病率[6]相一致。
3结论与讨论
谷子粒黑穗病是一种真菌性病害，黑穗病发生的严重程度取决于谷子品种的抗病性和环境条件。本研究根据谷子粒黑穗病菌ITS序列，设计了1对引物F1/R1，应用该引物对谷子粒黑穗病菌、白发病菌、谷瘟病菌和玉米黑粉菌基因组DNA进行PCR扩增，结果表明，只有谷子粒黑穗病菌扩增出1条特异性条带，说明这对引物对谷子粒黑穗病菌是特异的，且检测到的黑穗病菌基因组DNA的最低质量浓度为10pg/μL。对谷种拌菌组植株的检测结果表明，所设计的特异性引物在鉴定植株抗病性方面具有较高的特异性。
朱桂清等[11]用真菌rDNA非编码区ITS1的通用引物设计了特异性引物，对小麦散黑穗病菌进行了PCR检测;程颖慧等[17]根据ITS片段设计引物检测小麦腥黑穗病菌，并用于与黑麦腥黑粉菌的区分。商蓓等[18]应用真菌rDNA的ITS序列设计了对苹果黑星病菌有高度特异性的引物，可检测到苹果黑星病菌基因组DNA浓度是100fg/μL;王楠等[19]研究设计的谷子锈病菌IGS序列特异性引物，利用巢式PCR建立了对谷子锈病的检测体系，检测到病原菌基因组DNA最低质量浓度为100pg/μL。本研究建立的PCR技术体系能够检测到的谷子粒黑穗病菌基因组DNA最低质量浓度为10pg/μL，具有较高的检测灵敏度。
用设计的特异引物对谷种拌菌组发病植株进行病原菌检测，在穗梗和旗叶中都检出特异性条带，表明病原菌随植株的生长发育，对植株顶端的旗叶及穗梗都进行了侵染，病菌对植株的侵染是全身性的。用此引物对拌菌组中未发病植株进行检测，长农35穗梗与旗叶中检出粒黑穗病菌的植株数多于晋谷21，这与田间植株发病率数据[5]基本一致。本研究建立的PCR体系可对谷子粒黑穗病菌进行定性检测，对定量检测还需进一步研究。
综上所述，本研究初步建立了谷子粒黑穗病菌的PCR检测鉴定方法，这种快速、高效的检测手段为今后谷子粒黑穗病菌的检测鉴定提供了基础，并且可以用于检疫研究、流行病害调查、谷子粒黑穗病过程控制和不同谷子品种抗病性鉴定。
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