鉴定申请报告（共13篇）
山亭区教育局：
枣庄市第三十二中学，座落于山城办驻地，始建于1957年（原滕县八中），2016年6月重新恢复政府办学。是一所寄宿、九年一贯制学校。现有11个教学班，共有师学生460人，枣庄市第三十二中学占地面积40亩，建筑面积7000 多平方米。
由于年代久远及建筑质量等问题，学校建筑存在多个方面的问题，为避免师生的安全受到危害，希望有关部门给予做出房屋鉴定：
1001号：教学楼。学校教学楼建于1986年，建筑面积1400平方米，至今30年了，为楼板结构，三层。
1002号：实验楼为楼板结构，建于1996年，建筑面积1100平方米，至今20年了，为楼板结构，三层。
1003号：学校餐厅。建于2001年9月，楼板砖石结构，建筑面积980平方米，一层半。
1004号：学校北宿舍楼。建于2001年9月，楼板砖石结构，建筑面积1800平方米，四层。
1005号：南宿舍楼。建于2001年9月，楼板砖石结构，建筑面积960平方米，一层半。
1006号：学校内大门。建于2001年9月，门顶已下坠15公分，十分危险。
1007号：厕所。建于2001年9月，建筑面积300平方米，为板房旱厕。由于建筑年代久远，建筑标准低。基础薄弱，抗震级别差，有明显的沉降断裂现象，墙体出现开裂，顶层面板多处开裂渗水，雨季特别严重。
几百名师生在校学习、工作和生活，存在较大安全隐患。敬请领导予以鉴定为谢！
枣庄市第三十二中学
出于节约和精简会议的考虑, 今年我省未再举办推广鉴定技术培训班。有些企业尤其是新上产品的企业由于对推广鉴定申请的有关内容、程序不清楚、不明白, 对相关要求的理解不到位, 甚至存在歧义和误解, 为帮助企业顺利申请推广鉴定, 现就有关问题做些说明。
一、关于申请范围。
根据《山东省农业机械试验鉴定管理办法》 (以下简称《管理办法》) 第三条规定, 山东省农业机械管理局 (以下简称省农机局) 主管全省农机鉴定工作, 组织制定并定期调整、发布全省农机鉴定产品种类指南、计划, 公布鉴定大纲、发布鉴定公告等。第七条规定, 申请农机鉴定的产品应当是列入农机鉴定产品种类指南或计划的产品。为此, 我省自2011年起连续四年在山东农机化信息网上对《山东省农机鉴定产品种类指南》 (以下简称《指南》) 进行了公告。随着我省农机化发展重点的调整和推广目录管理要求的变化, 《指南》的相关内容也随之发生着变化。但无论怎么变化, 《指南》的基本内涵没有发生实质性的改变。一是农机产品推广鉴定由生产企业自愿申请, 申请鉴定的产品应在省级推广鉴定能力认定范围内的基本要求没有变化。《农业机械试验鉴定办法》 (以下简称《鉴定办法》) 第三条规定, 农机鉴定包括部级鉴定和省级鉴定, 由农业机械生产者或者销售者自愿申请。《管理办法》第十条规定, 农机鉴定工作原则上由省农机鉴定站独立完成, 特殊情况下也可与其它符合规定要求的农机鉴定机构合作完成, 省农机鉴定站及其合作完成机构应当通过省级以上农机行政主管部门组织的鉴定能力认定, 并在认定范围内实施鉴定工作。二是已通过部级推广鉴定的产品, 不再进行省级推广鉴定的法规规定没有变化。《鉴定办法》第三条规定, 通过部级鉴定的产品不再进行省级鉴定。
二、关于申请条件。
根据省农机局公告的《山东省农业机械推广鉴定申请受理条件暂行规定》, 申请受理条件包括申请鉴定企业应符合的条件和产品应符合的条件。申请鉴定企业应符合以下条件:一是企业应在山东省境内注册、具有企业法人资格的生产企业。二是根据国家推广目录申报要求, 插秧机、谷物联合收获机械、轮式拖拉机的生产企业注册资金应在1000万元以上。其中, 大型谷物联合收获机械 (喂入量4.0kg/s) 企业注册资金应在2000万元以上, 150马力以上的轮式拖拉机企业注册资金应在5000万元以上。其他生产企业的注册资金应在500万元以上。三是企业占地面积原则应在2000m2以上;用于生产的厂房建筑面积一般应在1000m2以上, 其中生产拖拉机、联合收割机等大型农业机械的应在2000m2以上。四是企业应具备与所生产产品配套的生产线及生产设备、检验仪器设备等必备生产条件。五是花生、薯类、棉花、三辣蔬菜等大宗经济作物种、收等关键环节的农业机械产品生产企业注册资金可适当放宽, 但不能低于100万元。
申请鉴定产品应符合以下条件:一是应在省农机局发布的《指南》范围之内。二是应在《企业法人营业执照》的经营范围之内。三是应有相关的产品技术标准且按规定办理备案手续。四是国家实施生产许可和强制性认证管理的产品应获得相应证书并在有效期内。申请产品所装配的主要部件 (如所装配的发动机) 也应符合国家有关规定。五是应当是定型产品, 稳定生产一年以上, 有一定的生产批量, 在两个以上市地销售。累计销售量满足如下要求:小型农业机械产品不少于500台, 中型农业机械产品不少于100台, 大型农业机械产品或成套设备不少于30台 (套) , 对重点推广、农业生产急需或创新型等农业机械产品销售量应不少于10台 (套) 。
三、关于申请时限。
山东是一个农机生产大省, 申请鉴定的产品每年都在递增, 因此, 为便于推广鉴定实施计划安排, 所有产品推广鉴定申请受理都规定了一个受理截止时间。受理截止时间, 是指符合受理条件的企业和产品的申报截止时间, 如果首次申报不符合受理条件, 那么是指整改后的截止时间。因此, 要求企业一定要按规定要求认真准备相关材料, 尽量提前申报。申报过程中还应注意, 一是去年年底已提交推广鉴定申请但还未实施的, 要重新按照规定的截止时间提交申请;二是根据国家和省推广目录申报条件的有关要求, 为避免已在目录中的产品因到期未重新进行鉴定而被撤销目录, 《农业机械推广鉴定证书》在次年3月31日前到期的, 也应在规定时间前提出申请;三是《农业机械推广鉴定证书》在次年3月31日后到期的个别季节性产品, 考虑到到期复查时需要提前进行作业性能试验的, 也应当在规定时间前提出申请。
四、关于申请材料。
推广鉴定的申请材料很多, 但均在鉴定站公共邮箱内挂出, 格式要求明确, 联系方式清楚。申请材料包括:一是山东省农业机械 (推广) 鉴定申请表;二是山东省《农业机械推广鉴定证书》复印件;三是产品使用说明书;四是三包凭证;五是产品定型证明文件;六是采标文件原件和复印件;七是营业执照副本原件和复印件;八是企业组织机构代码证复印件;九是国家法律、法规有许可或强制认证要求的产品的生产许可证、3C认证证书等许可证书和强制认证证书原件和复印件;十是山东省农业机械推广鉴定企业必备条件自查结果表;十一是符合要求的用户名单;十二是企业基本情况表;十三是企业组织机构图;十四是企业各部门职能分配表;十五是产品照片4张 (前、后、左、右) ;十六是产品主要技术规格参数表;十七是山东省农业机械鉴定委托企业确认书。
五、提请注意事项。
我与妻子石某结婚后生一子，现已７岁。孩子出生后，就有朋友说这个孩子不像我，长得很像妻子以前的恋人，当时我半信半疑。但随着孩子一天天长大，我的疑心也越来越重，因为孩子长得既不像我也不像他妈。为此我们夫妻感情一直不和。最近，我起诉至法院要求离婚，并以孩子不是我亲生为由，拒绝抚养和支付抚育费。妻子反对我的诉讼请求，并说孩子确实是我与她所生。为了确定孩子是否为我所亲生，我想申请做亲子关系鉴定。请问，该怎样申请做亲子鉴定？如果妻子不同意做亲子鉴定，法院是否可以采取强制的手段？
贺时峰
贺时峰朋友：
要确定子女是否亲生，亲子鉴定结论是非常重要的证据。但我国在亲子关系鉴定方面的立法还是空白。目前，最高人民法院只允许各级人民法院采用人类白细胞抗原做亲子关系鉴定。至于如何启动亲子鉴定程序，目前也无明确规定，审判实践中普遍的做法是：夫妻双方都同意做亲子鉴定的，法院应予准许，在夫妻双方提出书面申请后，由人民法院委托有关亲子鉴定机构进行鉴定。受委托的鉴定机构应当作出书面鉴定结论并在鉴定书上盖章。若有一方不同意，或子女较大，法院则应从严掌握，即一方拒绝做的，法院不应采取强制措施。
法定代表人：朱**，厂长
申请鉴定的事项与要求：
被上诉人泰州市**工业设备制造厂出售给申请人的KGPS1200/2.0/1S中频炉频繁出现的 死炉 现象是操作不当引起，还是因内在质量瑕疵或设计缺陷引起。
事实和理由：
20XX年12月26日，申请人与被上诉人泰州市**工业设备制造厂签订购销合同一份，约定：被上诉人向申请人出售型号为KGPS1200/2.0/1Sk 中频炉一台，价格17万元;由被上诉人负责安装调试，提供产品基础图;质量与技术标准为JB/T4280-93、JB/T8669-20XX，主电路保修1年，二次回路三年质保。合同对其他事项亦作了约定。申请人在使用该炉后，发现经常出现 死炉 、电容及晶闸管烧毁等内在故障。被上诉人应申请人的要求，于20XX年6月份到9月份之间曾多次派人进行维修，但始终未能使该炉正常运作。20XX年10月份以后，被上诉人开始拒绝维修，甚至连申请人的电话也不接，导致上诉人无法继续使用该炉从事生产经营。上诉人为此提起了诉讼。现因被上诉人不承认出售的中频炉存在内在质量瑕疵，并认为 死炉 是上诉人操作不当造成的。为此，申请人特具申请书，恳请贵院依法对诉争中频感应炉 死炉 现象的形成原因委托司法鉴定。
此致 泰州市中级人民法院
申请事项：
依法申请鉴定申请人提供的__X年8月12日合同上手写的：“施工工期60天”、“南后外墙砖”、“7月6号封顶”、“__X”是否由__X所写。
事实与理由：
申请人与被告__X于__X年4月13日签订了建房合同(共两份，双方各执一份)。20_年8月12日，经过双方协商被告__X在申请人所执的合同第二条(承包方式)第一款后添加文字“施工工期60天”，第五条(乙方义务)第二行“包括主体建筑”后添加文字“南后外墙砖”，第六条(付款办法)第二行“三楼封顶付2万元”后面“四楼封顶付2万元”下面添加文字“7月6号封顶”，并在建房合同第八条(补充条款)下面的乙方签名处签名“__X”。
现双方产生纠纷且已诉至法院，被告__X否认申请人所执合同中上述添加文字为其所写，根据《民事诉讼法》第76条的相关规定，申请人依法申请笔迹鉴定。
此致
__县人民法院
申请人：__
1 材料与方法
1.1 参鉴品种
粤蚕8号及对照品种两广二号。
1.2 试验内容
相同试验条件下, 对参鉴品种粤蚕8号的蚕期饲养表现、虫蛹率、茧质、丝质及综合经济性状进行了实验室鉴定。
1.3 试验方法
平温催青, 7月10日收蚁, 每品种正反交各收蚁1.5g, 四龄饷食一足天内数蚕5区, 每区400头。稚蚕防干育, 壮蚕普通育, 每日给桑3回。试验保证各区之间营养及其它环境条件一致, 过程严格按照《2013年国家桑蚕品种试验实验室鉴定实施方案》进行。用花蔟分区上簇, 终熟后第6天进行采茧, 记载蔟中病毙蚕数, 后进行茧质等成绩调查。调查结束后, 将同一品种的正交5区、反交5分别混合, 各选留样茧1 000粒混合, 采用二次烘干法烘茧, 干样茧二等分, 按要求送交指定单位进行丝质鉴定。
2 鉴定结果
2.1 鉴定成绩
按照《2013年国家桑蚕品种试验实验室鉴定实施方案》进行鉴定, 鉴定结果详见表1、表2和表3。
2.2 综合分析概评
粤蚕8号为四元杂交, 蚕种产附好, 孵化齐一, 克蚁头数正交2 207头, 反交2 437头。蚕体发育整齐, 眠起齐一, 食桑快, 不踏叶。壮蚕体色青白, 体形粗壮, 素蚕。熟蚕齐一, 结茧快;茧形比对照大, 长椭圆, 茧色白、均匀, 缩皱中等, 茧层结实。
粤蚕8号龄期经过与对照种相同, 实用孵化率98.66%, 比对照种 (98.63%) 稍高, 虫蛹生命力为95.16%, 比对照高0.82%。茧质优, 全茧量1.80g、茧层量0.382g、茧层率21.25%, 分别比对照种高4.05%、8.52%和0.84%, 普通茧重量百分率94.04%低于对照1.37%。上车茧率96.48%, 比对照种稍高, 一茧丝长1 021.5m, 比对照提高3.5%, 鲜毛茧出丝率15.32%、解舒丝长757.4m和解舒率74.32%, 分别比对照低0.44%、2.98%和4.77%, 茧丝纤度2.538D, 比对照粗0.022D;净度88.13分, 低于对照4.08%。综合经济性状优于对照种, 万蚕收茧量17.64kg、万蚕茧层量3.749kg和万头产丝量2.702kg, 分别比对照高6.20%、10.62%和3.21%。
3 小结与讨论
3.1从鉴定综合成绩来看, 参鉴品种粤蚕8号孵化好, 眠起齐一, 五龄及全龄经过与对照品种相同, 虫蛹率比对照品种稍高, 鲜毛茧出丝率、解舒丝长、解舒率及净度稍差于对照种, 一茧丝长及实用经济性状 (包括万蚕收茧量、蚕茧层量和万头产丝量) 均优于对照品种。
3.2分送两个丝质鉴定单位的样茧严格按照《2013年国家桑蚕品种试验实验室鉴定实施方案》要求进行烘茧, 处理完全一致, 但两鉴定单位出具的与解舒相关的丝质成绩有较大差异, 值得商榷。
3.3本次鉴定为一次试验结果, 基本反映了参鉴品种在广东点的饲养情况及性状表现。本次试验结果显示, 鉴定品种与对照品种各项试验成绩各有高低, 需结合其它试验点的综合情况才能给参鉴品种一个客观公正的评价, 为蚕品种审定和推广提供科学依据。
摘要：2013年, 广东省蚕业技术推广中心对参加国家桑蚕品种鉴定的1对新蚕品种粤蚕8号进行了实验室鉴定。通过蚕期饲养表现、茧质调查成绩、丝质鉴定成绩及综合经济性状的对比分析, 客观反映了粤蚕8号在广东点的饲养情况及性状表现。
申请人：付满才
年龄：66岁
性别：男
鉴定目的：
申请人于2012年8月27日凌晨因腹痛送到人民医院急诊科就诊，经医院急诊科和医院外一科的医生检查病因为胆结石。后于2012年9月5日在医院外一科作胆囊切除手术，在手术前，医生和主任明确知道病人有粘念，当时主任告诉家属有两个方案作胆囊切除手术：
① 首先做腹腔镜（微创），② 直接做传统手术；
（以上方案病人家属都同意，但是优先考虑腹腔镜）
在作胆囊切除手术的时候把申请人的肠子弄破了（在手术过程中医生告诉申请人家属他们不小心把肠子弄破了，但是已经处理好），在2012年9月12日早上医生查房的时候发现病人腹部横向伤口有类似粪质的东西流出，后经检查，流出来的的确是粪便，就于当天下午（2012年9月12日）就在医院做了横结肠造瘘术，之后申请人一直留在医院内治疗，最后于2012年12月14日在医院作了“横结肠造瘘回纳术”。这样对申请的身体及精神上受到了极大的伤害；
鉴定事项：
① 医院为申请人进行胆囊切除手术过程中存在医疗过错； ② 申请人在进行胆囊切除手术过程中存在医疗事故。
申请时间：2013年3月13日
县房安办：
酒店乡丁庄小学院内36间教室，层数两层，属砖混结构，建筑面积1200平方米。建于1995年4月份。在2009年经县房安办鉴定是：C级危房无维修加固价值。
至今由于年久失修，现在房子到处漏雨，而且有多处开裂，存在大量的及其严重的安全隐患。经丁庄小学领导班子研究并经校职工大会通过，报上级批准，特此报告县房屋安全办公室，请县房安办对丁庄小学这座老楼进行重新鉴定。
致
礼！
申请单位：酒店乡丁庄小学
1 试验材料与方法
1.1 参鉴蚕品种
菁松×皓月:分别由江苏蚕种管理所、四川蚕业管理总站、浙江蚕种公司、山东蚕业研究所提供的江苏锡东蚕种场、四川阆中蚕种场、浙江千岛湖蚕种场、山东广通蚕种公司生产的春制春正反交一代杂交种;
871×872:分别由陕西省蚕桑丝绸研究所、四川蚕业管理总站、西南大学部重点实验室、山东蚕业研究所提供的陕西石泉蚕种场、四川阆中蚕种场、重庆北涪蚕种场、山东广通蚕种公司生产的春制春正反交一代杂交种。
1.2 参鉴养蚕单位
中国农科院蚕业研究所, 四川农科院蚕业研究所, 陕西省蚕桑丝绸研究所, 安徽农科院蚕业研究所, 云南农科院蚕蜂研究所, 浙江农科院蚕桑研究所, 山东蚕业研究所。
1.3 参鉴缫丝单位
中国农科院蚕业研究所, 四川农科院蚕业研究所。
l.4 试验方法
采用简易催青法催青, 2008年5月12日收蚁, 每对品种正反交收蚁1.0 g。1-3龄混合育, 3龄眠中数蚕, 每对品种正反交3区, 每区400头。试验在相同饲育环境下进行, 统一技术处理, 全龄实行三回育, 做到良桑饱食。塑料折簇上簇, 注意通风换气, 终熟第7天后采茧, 然后进行收茧、茧质调查并选样留茧, 鲜茧采用二次烘干法。样茧烘干后按正反交等粒混合后称量, 分为两个等分样品, 一份送中国农业科学院蚕业研究所质检中心、另一份送四川省蚕业研究所茧丝检验室进行丝质鉴定。
2 鉴定结果与概评
2.1 试验鉴定成绩
我所对我国现行主推春用家蚕品种菁松×皓月、871×872进行实验室通比鉴定, 试验成绩统计和整理见表1、表2、表3。
2.2 综合评述
2.2.1 江苏供试品种
菁松×皓月:孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内、区间开差小, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.80%, 虫蛹率98.91%, 全茧量2.18 g, 茧层量0.483 g, 茧层率22.16%, 普通茧百分率98.82%。上车率97.85%, 茧丝量0.407 g, 茧丝长1273 m、解舒丝长982 m、解舒率77.13%。万蚕收茧量21.12 kg, 万蚕茧层量4.680 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.217 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.934 kg。纤度2.88 D, 净度95分, 清洁96分。
2.2.2 浙江供试品种
菁松×皓月:孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内、区间开差小, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.46%, 虫蛹率98.64%, 全茧量2.12 g, 茧层量0.464 g, 茧层率21.89%, 普通茧百分率98.14%。上车率97.66%, 茧丝量0.391 g, 茧丝长1237 m、解舒丝长989 m、解舒率80.01%。万蚕收茧量21.08 kg, 万蚕茧层量4.614 kg, 5龄50kg桑收茧量4.114 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.901 kg。纤度2.84 D, 净度95分, 清洁96分。
2.2.3 四川供试品种:
1) 菁松×皓月:
孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内表现一致, 区间略有开差, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.64%, 虫蛹率98.98%, 全茧量2.16 g, 茧层量0.476 g, 茧层率22.04%, 普通茧百分率98.77%。上车率97.86%, 茧丝量0.400 g, 茧丝长1178 m、解舒丝长743 m、解舒率63.10%。万蚕收茧量21.28 kg, 万蚕茧层量4.690 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.233 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.933 kg。纤度3.06 D, 净度96分, 清洁96分。
2) 871×872:
孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 营茧较快。体色青白, 普斑, 区内表现一致, 区间略有开差, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.24%, 虫蛹率97.91%, 全茧量2.24 g, 茧层量0.483 g, 茧层率21.56%, 普通茧百分率98.64%。上车率97.72 %, 茧丝量0.352 g, 茧丝长948 m、解舒丝长421 m、解舒率44.44%。万蚕收茧量22.15 kg, 万蚕茧层量4.776 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.422 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.953 kg。纤度3.34 D, 净度96分, 清洁96分。
2.2.4 山东供试品种
1) 菁松×皓月:
孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内、区间开差小, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.60%, 虫蛹率98.70%, 全茧量2.24 g, 茧层量0.494 g, 茧层率22.05%, 普通茧百分率98.60%。上车率97.85%, 茧丝量0.411 g, 茧丝长1285 m、解舒丝长976 m、解舒率75.95%。万蚕收茧量22.34 kg, 万蚕茧层量4.926 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.499 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.992 kg。纤度2.88 D, 净度94分, 清洁96分。
2) 871×872:
孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内、区间开差小, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.80%, 虫蛹率98.72%, 全茧量2.22 g, 茧层量0.490 g, 茧层率22.07%, 普通茧百分率99.20%。上车率97.72%, 茧丝量0.383 g, 茧丝长1103 m、解舒丝长536 m、解舒率48.54%。万蚕收茧量21.72 kg, 万蚕茧层量4.794 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.239 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.936 kg。纤度3.12 D, 净度95分, 清洁96分。
2.2.5 重庆供试品种
871×872:孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内开差小, 区间略有开差, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.21%, 虫蛹率98.26%, 全茧量2.15 g, 茧层量0.480 g, 茧层率22.33%, 普通茧百分率98.10%。上车率97.74%, 茧丝量0.408 g, 茧丝长1218 m、解舒丝长809 m、解舒率66.48%。万蚕收茧量21.37 kg, 万蚕茧层量4.772 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.378 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.978 kg。纤度3.02 D, 净度96分, 清洁98分。
2.2.6 陕西供试品种
871×872孵化良好, 发育整齐, 食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内表现一致, 区间略有开差, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。幼虫生命率99.55%, 虫蛹率98.61%, 全茧量2.18 g, 茧层量0.486 g, 茧层率22.29%, 普通茧百分率98.32%。上车茧率97.67%, 茧丝量0.394 g, 茧丝长1175 m、解舒丝长708 m、解舒率60.30%。万蚕收茧量21.32 kg, 万蚕茧层量4.750 kg, 5龄50 kg桑收茧量4.213 kg, 5龄50 kg桑茧层量0.939 kg。纤度3.02 D, 净度94分, 清洁96分。
3 小结与讨论
3.1 综上所述, 菁松×皓月和871×872孵化良好齐一, 小蚕发育整齐, 上簇齐涌, 营茧较快。食桑旺盛, 行动活泼。体色青白, 普斑, 区内、区间表现一致, 茧形椭圆, 茧色白, 缩皱中等。
3.2 菁松×皓月, 生命率最高99.80% (江苏) ;虫蛹率最高98.98% (四川) ;普通茧百分率最高98.82% (江苏) ;全茧量最大2.24 g (山东) ;茧层量最大0.494 g (山东) ;茧层率最高22.16% (江苏) ;万蚕收茧量最大22.34 kg (山东) ;万蚕茧层量最大4.926 kg ( (山东) ;50 kg桑收茧量最大4.499 kg (山东) ;50 kg桑茧层量最大0.992 kg (山东) 。养蚕成绩综合来看:山东>江苏>四川>浙江。丝质鉴定综合来看:山东>江苏>浙江>四川。
3.3 871×872, 生命率最高99.80% (山东) ;虫蛹率最高98.72% (山东) ;普通茧百分率最高99.20% (山东) ;全茧量最大2.24 g (四川) ;茧层量最大0.490 g (山东) ;茧层率最高22.33% (重庆) ;万头收茧量最大22.15 kg (四川) ;万头茧层量最大4.794 kg ( (山东) ;50 kg桑收茧量最大4.422 kg (四川) ;50 kg桑茧层量最大0.978 kg (重庆) 。养蚕成绩综合来看:山东>陕西>重庆>四川。丝质鉴定综合来看:重庆>陕西>山东>四川。
3.4 参加本次通比鉴定的蚕品种分别来源于我国六大蚕茧主产区, 由于各省地域条件、气候特点、种性保持等可能存在着差异, 各项成绩互有高低, 从总体上看还较为客观地反映了通比品种在山东试验点的饲养情况及性状表现。
公司领导：
我叫******男汉 现年***岁，于******年****月****日出生，身份证号码是：*************，本人系******省******县******（乡或镇）*****村人，于****年参加工作，现为新郑煤电公司运输二队平地装卸料工，*****年**月**日**点****分左右，在平地废料场利用叉车交工字钢时，不慎致使左脚大脚指受伤。送往新郑医院进行救治诊断结论：左足第一趾近节趾骨粉碎性骨折；左足皮肤擦挫伤。根据治疗和目前恢复情况，现申请伤残鉴定！
申请人：*****
申请人：XXX，男，48岁，家住XX县XX镇XX社区X组X号，身份证号码XXXXXXXXX，家庭人口X人。申请事由
我家在XX镇XX社区X组（小地名：XXX）建有一处房屋，修建于1983年，属砖混结构。因年久失修，如今已成了危房，房屋整体现比公路低了一米左右，墙壁四周裂缝，且房顶漏雨，现已无法正常居住，我们全家人只能靠租房居住。现请上级相关部门给予危房鉴定，予以改建，望相关部门能尽早核实为盼！特此申请
申请人：XXX
早在20世纪60年代,Rodbell等人已经成功从脂肪组织分离获得细胞,之后这一方法经过多次修饰后被用于从脂肪组织中分离干细胞[4,5]。当前从脂肪组织中分离干细胞的最常用方法是通过胶原酶消化脂肪组织,但酶解效率并不高,每克脂肪分离的细胞量仅在105数量级[1,3,6,7,8]。尽管有研究通过采用不同酶组合消化的方法有效提高了ASC的产率,但是其细胞产率同样很少能达到106个/g脂肪,无法满足组织工程与再生医学对种子细胞的大量需求[9,10,11]。
本研究通过优化胰蛋白酶和胶原酶对脂肪组织的消化条件,获取ASC高效分离方法,同时利用荧光基因标记方法对分离的ASC进行标记和功能检测,为后期ASC的组织工程与再生医学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
SPF级别SD大鼠,80~120 g,日龄25~35 d,共12只,购自维通利华实验动物中心。
1.1.2 试剂
抗坏血酸(99%)、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,≥99%)、地塞米松(≥98%)、吲哚美锌(99%)、Ⅰ型胶原酶(≥31.25~125 units/mg solid)购自Sigma公司;胰酶(250 N.F.U/mg)购自Gibco公司;荧光标记的CD29(100μL)、CD45(100μL)、CD34(100μL)、CD90(100μL)均购自BD公司;α-MEM(500 m L)购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum)购自MD genics公司。GFP-Fluc的慢病毒载体(1011PFU/m L)购自赛业生物(广州,赛业生物科技)。
1.2 方法
1.2.1 消化酶组分与脂肪来源干细胞的分离
脂肪组织分离自SD大鼠腹股沟,经无菌解剖液冲洗数次去除血污。随后,将脂肪组织充分剪碎,实验分3组,分别添加0.1%Ⅰ型胶原酶、0.1%胰酶或0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰酶,37℃条件下消化,不断轻轻搅拌。
为确定最佳消化时间,分别消化处理30 min、45min、60 min,然后加入血清终止消化。200μm孔径的筛网过滤,600 g离心5 min收集细胞,加入红细胞裂解液去除血细胞后,血细胞计数器计算每克脂肪组织活得的细胞,同时台盘兰染色计算死细胞数。37℃、5%CO2孵箱孵育24 h活细胞完全贴壁,收集未贴壁的细胞并计数,用于评估不同的消化时间对分离细胞活力的影响。
1.2.2 流式细胞术
将配到P3代细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集,用0.1%BSA溶液将细胞重悬至1×106m L-1,选择兔抗大鼠的PE anti-rat CD29、FTTC anti-rat CD90、FITC anti-rat CD45和PE anti-rat CD34抗体室温孵育20 min,PBS为对照组。离心,弃上清后重悬,用流式细胞仪(FCM)检测CD29、CD90、CD34和CD45的表达,通过利用Cellquest软件采集和分析。
1.2.3 ASC的转染标记
将生长良好的ASC提前1d以1×105细胞/孔接种于6孔培养板。次日,去除培养液,加入1 m L新鲜培养液,同时以MOI=10的剂量加入慢病毒浓缩液,37℃孵箱孵育24 h,去除培养液,PBS多次洗涤后,加入新鲜培养液进行培养。2 d后,用荧光显光显微镜观察GFP表达,细胞扩增后通过流式细胞数检测GFP阳性细胞率评价病毒转染效率。同时,加入能够有效杀死对照组ASC的最低浓度嘌呤霉素进行筛选成功转染标记的细胞。
1.2.4 ASC的生长特征和分化潜能鉴定
1.2.4. 1 MTT法分析ADSCs的生长动力学
ASCs分别以1×104细胞/孔的密度接种于96孔培养板来测定细胞增殖曲线。每天通过MTT法测定细胞的吸光值。测定前,每一培养孔中加入20μl MTT液(25 mg/m L),37℃、5%CO2孵箱孵育4 h,弃去上清液,加入150μl DMSO,充分混匀,使用酶标仪,490 nm波长下测定每一培养孔的吸光值,每组至少测定5孔,取平均值。对照组为经过同样操作的无细胞培养孔。
1.2.4. 2 ADSCs的多向分化潜能鉴定
成脂肪、成骨诱导分化与分析按照Zuk PA的方法[5,12],方案见表1。成脂分化的表型获得通过油红O染色来检测确定。为了评估成骨分化的表型,诱导分化3 w后通过茜素红染色检测基质的矿化水平。
1.2.4. 3 RT-PCR
成脂分化2 w和成骨诱导分化3 w后,用试剂盒提取细胞总mRNA(OMEGA Total RNA,OMEGA,USA),反转录获取c DNA(Quant Script RT Kit,Tiangen),然后RT-PCR检测成脂和成骨分化相关基因的表达水平。采用两步法PCR扩增,扩增条件为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,之后72℃延伸30 s,共40个循环。RT-PCR中所用引物见表2。最后2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.2.5 生物发光成像
对于体外培养细胞,将不同数量梯度的细胞利150μg/m L D-荧光素底物孵育,1 min后采集0.5~1 min内的发光信号,检测细胞数量与生物发光信号之间的线性关系。对于体细胞,将1×106细胞注射到小鼠腹股沟部位。检测前,利用含2%异氟烷的气体麻醉小鼠,腹腔给药D-luciferin(0.150 mg/g体重),并将小鼠放置于成像仓,成仰卧体位,采集峰值信号。
1.2.6 统计学分析
剂量结果利用x±means表示,不同组样本平均数之间利用单因素方差分析,P<0.05时有统计学差异。统计软件为SPSS 13.0。
2 结果与分析
2.1 ASC分离条件的优化
由图1可见,0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰酶组能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一胰酶或胶原酶消化提高4~5倍;随着消化时间延长细胞产量增加,但当消化时间达到45 min后,继续延长消化时间对细胞产量没有显著影响,45min与60min细胞产量相似,60 min消化后较45 min消化死细胞数显著增加。因此,最佳消化时间为45 min(图1)。
2.2 培养细胞的表型特征
ASC分离培养3代后,通过流式细胞术对相关表面标志的表达情况进行检测,如图2所示,大多数细胞表达CD29、CD90等标志物,而几乎不表达CD45、CD34等造血谱系的标志物,这一表型特征与文献报道相似。
2.3 GFP-Fluc双报告基因的标记
经慢病毒孵育转染后,流式细胞检测显示GFP阳性率可到40~50%,经过嘌呤霉素筛选后,GFP阳性率能高达99%,表明获得了纯度较高的GFP-Fluc双报告基因标记细胞(见图3)。
2.4 慢病毒转染后的ASC生物学性能评价
MTT检测结果证实经过慢病毒转染后的ASC与正常ASC有着相似的增殖能力(图4)。如图5所示,ASC与慢病毒转染后ASC的形态相似,都呈纤维状,且与正常培养的ASC(图5A)相比,经慢病毒转染后的细胞表达绿色荧光蛋白(图5D)。茜素红和油性红染色结果(图5B,C,E,F),以及成脂肪和成骨分化特异性基因RT-PCR检测结果(图6)显示二者具有相似的成脂肪和成骨分化潜能。以上结果表明慢病毒转染未对ASC的生物学性能产生明显影响。
2.5 体外与体内生物发光成像示踪
如图7A所示,体外细胞数量与生物发光信号成线性关系,表明生物发光信号可以用于ASC的定量追踪。而体内生物活体成像结果进一步证实(图7B),慢病毒标记的ASC可以用于活体干细胞移植后的追踪。
3 讨论
组织工程和再生医学是一门多学科交叉的科学,近年来随着现代生物技术进步而迅速发展[13,14]。尽管如此,如何选取合适的干细胞用于再生医学的修复研究及应用,仍然是一项具有挑战性的困难工作[15,16]。一般地,用于再生医学的干细胞应该满足下列条件:(1)能够大量获得;(2)收集方法具有较低的侵入性;(3)具有多向分化潜能;(4)能够安全、有效地移植到自体或同种异体宿主;(5)便于产业化实际应用。
脂肪组织在自体细胞移植替代治疗方面是一类来源丰富、实用且诱人的供体组织来源。目前研究表明,脂肪来源的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的性质,并且在组织修复与再生中具有广阔的应用前景[17,18,19]。尽管如此,现有的从脂肪组织分离细胞的方法还具有一定局限性,导致细胞治疗所要求的细胞数量只能通过大量的抽取脂肪组织或者长期的传代培养来满足,很不适合实际应用需要。因此,在脂肪来源干细胞的治疗前景被充分应用之前,有必要开发一种以最少脂肪组织、在较短时间内获得充足细胞的高效分离方法。
本研究中,通过对胶原酶、胰蛋白酶和二者复合酶三种消化方法进行优化比较,发现0.1%Ⅰ型胶原酶+0.1%胰蛋白酶的复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,最佳消化时间45 min,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。流式细胞术鉴定结果表明,经体外扩增培养的ASC以表达CD29和CD90等标志物为主,而几乎不表达CD45、CD34等造血谱系的标志物。
近年来,基于报告基因的非侵袭性成像方法为干细胞移植后的检测分析提供了有效手段。非侵袭性成像法不仅可以用于体内细胞移植后的追踪,同时还具有实时检测细胞存活数量和位置等信息[20]。由于标记的报告基因具有稳定遗传的特性,由此为细胞增殖的实时追踪提供了有效手段[21]。在本研究中,通过利用载有GFP-Fluc双报告基因的慢病毒转染ASC,其GFP阳性率能高达99%。不仅如此,ASC与慢病毒转染后ASC的形态相似,都呈纤维状,并且具有相似的成脂肪、成骨分化潜能和增殖能力。而体外细胞生物发光和体内活体发光成像示踪结果表明,ASC可以用于活体干细胞移植后的定量追踪。
综上,通过利用胶原酶、胰蛋白酶复合酶法可以有效提高脂肪干细胞的原代分离效率。慢病毒标记后的ASC,具有正常ASC相似的多项分化潜能和增殖能力,且具有良好的活体发光成像示踪性。
摘要：[目的]探索ASC高效分离方法,采用荧光基因标记法对分离的ASC进行标记、功能检测和示踪研究。[方法]通过优化脂肪组织的酶解消化条件,分别采用胶原酶、胰蛋白酶及组合对脂肪组织消化,检测细胞产量,并用流式细胞术进行鉴定。之后利用GFP-Fluc双报告基因对体外分离培养的ASC进行标记,鉴定其多项分化潜能。[结果]胶原酶、胰蛋白酶复合酶消化能够显著提高ASC分离效率,细胞产量较单一酶消化提高4~5倍。体外扩增培养ASC以表达CD29、CD90等为主。GFP-Fluc基因标记后的ASCs具有成脂肪、成骨分化潜能,可用于活体干细胞移植后的定量追踪。[结论]胶原酶、胰蛋白酶复合酶解法可以显著提高脂肪干细胞的原代分离效率4~5倍。
申请人：汉族，年 月 日生，现住址：，身份证号码：，联系电话：。
申请事项：
请求人民法院委托鉴定机构对申请人的伤残等级、误工期限、护理人数、护理期限、营养费、后续治疗费、后续治疗的误工时间、护理人数及护理期限进行鉴定。
事实和理由：
年 月 日 时 分许，驾驶鲁G小型轿车与 申请人在 相撞，致申请人受伤，现在 人民医院就医治疗。
贵院现已受理申请人 诉 道路交通事故责任纠纷一案，为准确计算残疾赔偿金及后续治疗费的数额，特申请贵院依法委托司法鉴定机构对其伤残等级等进行鉴定。
此致
人民法院
申请人：
