大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养（共9篇）

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇1

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的.表达.结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征.说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs.

作 者：李延清 刘霞 LI Yan-qing LIU Xia 作者单位：李延清,LI Yan-qing(延安大学,生命科学学院,陕西,延安,716000)

刘霞,LIU Xia(延安大学,生命科学学院,陕西,延安,716000;西北农林科技大学,动物科技学院,陕西,杨凌,712100)

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇2

1 资料与方法

1.1 主要试剂及仪器

SD大鼠(第四军医大学提供)3只,低糖改良Eagles培养液(DMEM)(GIBCO),胎牛血清(杭州四季青),兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体(Merk公司),二抗羊抗兔辣根过氧化物酶IgG(武汉博士德),焦碳酸二乙酯(DEPC)(北京鼎国生物技术公司);TRIZOL试剂、逆转录试剂盒(上海生工生物技术公司),SYBR GreenI荧光染料(Invitrogen),倒置显微镜(Olympus);CO2培养箱(Heraeus,德国);6孔培养板(Costor,美国);插入式培养皿(Millipore);FTCTM-2000system实时定量PCR循环仪(上海枫岭公司);低温高速离心机(Eppendorf,德国);水平式电泳仪(BioRad,美国)。

1.2 BMSCs分离培养

无菌条件下剥离大鼠股骨和胫骨,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔,细胞悬液接种于培养瓶中置于37℃,5%CO2孵箱中培养。24小时后弃去培养液,PBS冲洗2～3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。每3天换液1次,细胞约80%融合时用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化传代。分别于原代、传代培养的各个时期,用倒置显微镜观察BM-SCs形态变化及生长情况。

1.3 大鼠子宫韧带成纤维细胞的分离培养

取成年雌性大鼠双侧子宫韧带组织自行分离传代并冻存,经复苏后获得。

1.4 BMSCs与大鼠子宫韧带成纤维细胞共培养体系的建立

细胞非接触式共培养体系的组成:六孔细胞培养板加插入式培养皿。取第3代80%融合BMSCs和大鼠子宫韧带成纤维细胞用0.25%胰酶、0.01%EDTA消化、计数后,BMSCs接种于六孔板中,每孔加2ml含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液,成纤维细胞接种于插入式培养皿中,每孔加入1ml相同培养液。两种细胞间被插入式培养皿的半透膜隔开,只允许两种细胞间分子信号传递,两种细胞不允许通过。对照组内外培养室均为BMSCs。在间接培养3、6、12天后,收集六孔板内的BMSCs。间接共培养实验分组及各组细胞种植密度见表1。

1.5 免疫细胞化学染色

分别取间接共培养组、对照组BMSCs以1×104/孔的细胞浓度接种在24孔板中,孵育24小时后采用过氧化物酶标记的链霉素抗生物素-过氧化酶连接(SP)法做免疫细胞化学染色,主要步骤:(1)10%甲醛室温固定30分钟;(2)H2O2灭活,室温30分钟;(3)5%BSA封闭液,37℃20分钟;(4)加1∶100稀释的一抗,室温1小时;(5)加二抗,室温,1小时;(6)DAB显色10分钟;(7)苏木素复染,镜检。阴性对照组用PBS缓冲液代替一抗。

1.6 实时定量RT-PCR检测BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达

按Trizol试剂说明书一步法分别提取大鼠BMSCs和子宫韧带成纤维细胞内的总RNA,按常规方法获取逆转录cDNA。Light-Cycler毛细管实时定量PCR仪及SYBRGreenⅠPCR合成试剂盒用于检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA转录的检测。每毛细管反应体系总量为20μl,含样本2μl,反应条件按照说明书进行。

1.7 统计分析

所有数据均用均数±标准差表示,在免疫组化和实时定量PCR的结果处理中,采用onewayANOVA检验样本与对照组之间的组间差异,以P<0.05为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs和子宫韧带成纤维细胞形态和生长变化

BMSCs原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10～14天70%～80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。

子宫韧带成纤维细胞采用组织块培养法,原代成纤维细胞自贴壁组织块爬出,为长梭形,向四周成放射状排列,7～8天即可融合80%达到传代标准。传代培养后,细胞形态未发生改变,排列紧密,长梭形。经冻存复苏后细胞复苏率约85%,复苏后细胞生长,增殖旺盛,功能不受影响。

2.2 BMSCs的鉴定

流式细胞仪检测第3代BMSCs表面分子表达情况,98.6%的细胞阳性表达CD 90,98.8%的细胞阳性表达CD 44,细胞CD 34、CD 45为阴性表达,且所得细胞可以被诱导为成骨和成脂细胞。上述结论已被本实验室前期工作证实。

2.3 免疫细胞化学法检测胶原蛋白合成

大鼠BM-SCs未共培养时,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达较低,仅在胞浆区有轻微黄色阳性淡染区(见图1、图2);共培养6、12天后阳性染色逐渐增强,呈现棕黄色染区(见图3、图4)。共培养3天间接共培养组和对照组差异不明显均为轻微黄色淡染区。随即选取5个不重叠高倍镜视野,用Powersite显微图像采集分析系统分别计算每高倍视野的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的平均灰度值,用灰度值代表Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在大鼠BMSCs中的表达。间接共培养6天后,I型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的灰度值在间接共培养组分别为116.86±2.24和108.53±1.12,对照组分别为82.71±3.04和76.25±1.26。6天间接共培养组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和对照组之间灰度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。间接共培养12天后,I型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的灰度值在间接共培养组分别为121.28±3.11和112.19±2.62,对照组分别为86.56±1.28和81.82±1.36。12天间接共培养组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和对照组之间灰度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组胞质未着色。

2.4 I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达

由电泳结果可知,所获得的产物分别为I型胶原352bp,Ⅲ型胶原244bp,与理论值产物片断大小相同。而且,实时定量PCR的溶解曲线光滑平整,只有一个T溶解峰,说明产物中无杂物,定量结果可靠。同时,实时定量RT-PCR检测BMSCsⅠ、Ⅲ型胶原mRNA的表达情况:与对照组相比,间接共培养3天后,Ⅰ、Ⅲ型胶原mR-NA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。间接共培养6天后,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA与内参照GAP-DH的相对表达量在间接共培养组分别为3.9±0.1和1.8±0.2,对照组分别为2.0±0.2和0.9±0.2,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的比例与对照组相比显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。共培养12天后,它们的相对表达量在间接共培养组分别为4.1±0.1和2.0±0.1,对照组分别为2.1±0.1和0.9±0.1,I型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达比例增高与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

POP是盆底功能障碍性疾病中的一种类型,近年发病率呈逐年上升趋势。POP是一种多因素参与的复杂疾病,其确切的发病机制尚不清楚,但大量研究均证实盆底肌肉、筋膜及子宫韧带等支持组织的损伤及胶原代谢的异常,致其张力下降和支持功能的减弱是导致POP发生的主要因素之一。

BMSCs来源于中胚层,为多能干细胞,其具有很强的自我复制和多向分化潜能,可产生具有各种表型的子代细胞。在体内、外不同的诱导条件下BMSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力[2,3]。另外,骨髓BM-SCs获取相对简便,且可从自身获取,细胞来源丰富,对体外培养条件要求不高,分裂增殖能力强,具有无异体排斥反应、生物相容性好以及外源基因易于导入和表达等多种优点。使BMSCs成为组织工程学中重要的种子细胞。

有研究表明,韧带修复部位周围可见新的成纤维样细胞聚集,且这些细胞均由BMSCs分化而来[4]。Watanabe等[5]将转基因大鼠的BMSCs注射到受损的野生大鼠韧带组织中,28天后在已经愈合的野生大鼠韧带中检测到存活的转基因细胞,其性状与周围的韧带成纤维细胞相似。Young等[6]用种植了BMSCs的胶原纤维替代兔的跟腱,4、8、12周后检测发现,种植了BMSCs的胶原纤维比未种植组排列更加整齐有序、更具方向性,且新形成的韧带纤维明显比对照组韧带纤维直径粗大。以上实验初步表明,BMSCs可转化为韧带成纤维细胞,在韧带组织修复过程中发挥重要作用。但如何稳定诱导BMSCs的定向分化是目前组织工程学急待解决的问题。

本实验利用大鼠BMSCs贴壁早于骨髓基质细胞的特性,通过骨髓冲出内容物完全培养,再经过差速贴壁法进行反复纯化。实验将初次纯化换液在培养24小时后进行,而并非采用普遍文献报道的72小时后换液,此外在原代培养的集落形成时间上与部分报道也不尽一致[7]。这可能与实验所选BMSCs来源物种不同而造成细胞在生长特性上存在一定差异有关。组织块培养法用于韧带成纤维细胞的原代培养,效果理想,7～8天即可达到70%～80%融合,达到传代标准。

从培养的大鼠BMSCs形态学观察结果来看胞内细胞核较大,胞浆较少,细胞呈三角形、多角形和长梭形等多种形态,在传代培养中细胞生长旺盛,大多呈长梭型,这些形态上的特征均与目前报道的BMSCs的形态相吻合[8]。子宫韧带成纤维细胞原代传代培养均为长梭形,生长旺盛,经冻存后复苏细胞成活率高。

细胞外基质的合成是细胞的重要特性和功能。韧带成纤维细胞虽没有特异性的标记性蛋白表达,但细胞基质Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达量及其在总蛋白中的百分比是韧带组织和韧带成纤维细胞的重要标志[9]。因此,细胞对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的合成能力是衡量组织工程化韧带质量的重要标准之一。目前,BMSCs高表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白作为细胞向某一方向分化的重要标志之一[10]。

本实验室采用免疫细胞化学和实时定量RT-PCR的方法对间接共培养组和对照组细胞分泌的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和mRNA表达进行了定量检测。PCR产物电泳结果显示产物片段大小与预期值相同,另外PCR熔解曲线分析示熔解曲线光滑,只有单一的熔解峰,进一步证实定量结果可靠。实验结果检测到与子宫韧带成纤维细胞共培养后,BMSCsⅠ型、Ⅲ型胶原蛋白含量6天、12天增高明显,免疫细胞化学染色可见胞质内棕黄色颗粒。间接共培养6天和12天,Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达明显增加,其增高与对照组相比差异有统计学意义。BMSCs在子宫韧带成纤维细胞的影响下分泌的胶原增多,说明间接共培养可以促进BMSCs向子宫韧带成纤维细胞分化。但有学者认为,细胞与细胞直接相互作用在诱导细胞分化中起着重要作用,单纯的细胞共培养对细胞分化几乎没有作用。但实验结果表明间接共培养时细胞分泌的生长因子、调节信号等也会对周围的其他细胞有调节作用,另外,间接共培养后Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的比例较对照组增大,这一点符合韧带成纤维细胞的特征有研究表明,韧带成纤维细胞较其他细胞分泌更多的Ⅲ型胶原蛋白,韧带成纤维细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例为0.55,而皮肤成纤维细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例仅为0.25[11]。因此我们推测,受韧带成纤维细胞的影响,BMSCs的性质与韧带细胞更接近了,使其有潜力作为替代韧带成纤维细胞的来源。为BMSCs在体内分化的机制提供一定的理论依据,为从BMSC中获取构建韧带组织工程种子细胞提供了初步实验基础。

参考文献

[1]王建六.女性盆底功能障碍性疾病研究进展[J].中国医刊,2005,40(1):10-11.

[2]Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues[J].Science,1997,276(5309):71-74.

[3]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

[4]Awad HA,Butler DL,Boivin GP,et al.Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon[J].Tissue Eng,1999,5(3):267-277.

[5]Watanabe N,Woo SL,Papageorgiou C,et al.Fate of donor bone mar-row cells in medial collateral ligament after simulated autologous transplantation[J].Microsc Res Tech,2002,58(1):39-44.

[6]Young RG,Butler DL,Weber W,et al.Use of mesenchymal stemcells in a collagen matrix for Achilles tendon repair[J].J Orthop Res,1998,16(4):406-413.

[7]张黎,刘靖,周畅.体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(10):1881-1885.

[8]Beyer NN,da silya ML.Mesenchymal stem cells:isolation,in vitro Expansion and characterization[J].Hand b Exp Pharmaco1,2006,174:249-282.

[9]Vunjak-Novakovic G,Altman G,Horan R,et al.Tissue engineering ofligaments[J].Annu Rev Biomed Eng,2004,6:131-156.

[10]Liu T,Zhang J.Detection of V,ⅠandⅢtype collagens of dermal tissue skin lesions of patients with systemic sclerosis and its implica-tion[J].J Hua zhong Univ Sci Technolog Med Sci,2008,28(5):599-603.

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇3

【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定

【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。

1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。

1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。

1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鉴定

对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。

2 讨论

BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。

2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。

2.3 传代的注意事项

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。

综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。

參考文献

［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243

［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇4

兔骨髓间充质干细胞获取与特性的实验研究

目的:完善兔骨髓问充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外扩增培养体系并观测其特性. 方法:兔骨髓经密度梯度离心获得单核细胞后贴壁培养,光镜、透射电镜观察所获细胞形态,流式细胞术检测细胞周期,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定. 结果:原代及传代MSCs为漩涡状贴壁生长的.长梭形成纤维细胞样细胞,传代细胞具有类似的生长规律;透射电镜示所获细胞具有较强的自我更新能力;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;MSCs经体外诱导可向成骨细胞、成脂肪细胞分化. 结论:利用密度梯度离心联合贴壁培养法可分离、纯化MSCs,所获细胞具备成体干细胞特性,于体外可大量扩增,做为种子细胞和载体细胞满足实验需要.

作 者：刘永亮 YE Gang 方针强 LIU Yong-liang YE Gang FANG Zhen-qiang 作者单位：第三军医大学新桥医院泌尿外科,全军肾脏病中心,重庆,400037刊 名：西北国防医学杂志 ISTIC英文刊名：MEDICAL JOURNAL OF NATIONAL DEFENDING FORCES IN NORTHWEST CHINA年，卷(期)：200829(4)分类号：Q813.11关键词：细胞培养 问充质干细胞 骨髓

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇5

间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种,广泛存在于人体的间充质组织中,具有自我复制能力和多项分化潜能.单独或联合使用某些细胞因子、生长因子、激素、维生素、抗氧化剂和抗肿瘤药物等,可诱导MSCs在体外培养条件下向某一谱系细胞分化.鉴于MSCs的上述特点,使其有着非常诱人的`临床应用前景,可以用于许多种疾病的治疗.本文从MSCs的生物学特性、MSCs的分化诱导、分化调节机制及应用前景等方面进行了评述.

作 者：唐文洁 李玛琳 洪岸 作者单位：唐文洁(昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室,昆明,650031;暨南大学生物工程研究所,广州,510632)

李玛琳(昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室,昆明,650031)

洪岸(暨南大学生物工程研究所,广州,510632)

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

出生4周SD大鼠 (雌雄不拘) , 体质量150 g左右, 由东南大学医学院实验动物中心提供。低糖DMEM培养基、胎牛血清 (FCS) 、BMP- 7、EGF、bFGF、RA、神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 抗体均为SIGMA公司产品。SABC试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB) 显色剂为武汉博士德公司产品。

1.2 BMSCs的培养和纯化

取SD大鼠1只, 100 g·L-1 水合氯醛麻醉后体积分数75%乙醇浸泡3 min, 于超净工作台上严格无菌条件下取大鼠双下肢, 剪除软组织, 留取股骨和胫骨。将骨骺端剪去, 暴露两端骨髓腔, 使用5 ml注射器抽取DMEM培养液反复冲洗骨髓腔, 冲洗液收集于无菌离心管中, 1000 r·min-1 离心5 min 。弃去上清液, 加入体积分数20%血清培养液, 充分吹打至单细胞悬液, 调细胞浓度为4×108个·L-1, 接种于培养瓶中。置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。4 d后全量换液, 去除未贴壁细胞。以后每3 d换液1次, 待细胞长至80%～90%融合后, 用含0.25 g·L-1 胰酶的消化液消化, 以细胞密度4×108个·L-1 接种传代。

1.3 诱导和分化

传至第3代MSCs按1×104个·ml-1浓度接种于6孔板中, 培养液改用DMEM加20%胎牛血清, 待细胞融合达90%后, 分为A、B、C 3组。预诱导24 h后, A组加入EGF、bFGF和RA联合诱导剂 (终质量浓度为300 ng·L-1) , B组加入BMP- 7诱导剂 (质量浓度为20 μg·L-1) , C组不加因子继续培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态变化。

1.4 细胞免疫组化染色及观察

3组细胞诱导培养后第7天, 调细胞浓度为4×108个·L-1, 分别将3组细胞接种入24孔培养板, 每孔0.5 ml, 贴壁24 h后40 g·L-1多聚甲醛固定, 分别进行NSE免疫组化鉴定, DAB显色, 倒置显微镜下拍照记录, 细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞。

2结果

2.1 BMSCs 的培养扩增

初接种的细胞种类较多, 大部分呈圆形。接种24 h 后可见部分大圆形单核细胞贴壁, 骨髓中的造血干细胞不会贴壁, 可在每次换液中逐渐清除掉。原代培养36～48 h后贴壁的单核细胞开始增多, 但仍保持圆形。72 h后细胞开始增殖迅速并出现多种形态。大多数细胞呈梭形并带有2～3个长的突起, 细胞核较大, 扁圆形, 可见1～2个核仁。少部分细胞呈不规则形, 形态多样, 胞体大, 胞核为圆形或椭圆形, 有多个核仁, 胞浆可向不同方向伸出突起, 细胞集落间相互融合成单层, 排列具有一定方向性。细胞倍增时间约为7～ 10 d, 刚经传代的BMSCs 呈圆形, 迅速贴壁、伸展, 重新变为梭形细胞 (图1A) 。传代培养的细胞比原代细胞增殖速度加快, 但也存在1～2 d 的潜伏期, 第3～6 d 是细胞快速增殖期, 9 d后速度减漫, 进人平台期。反复换液和传代培养去除非贴壁细胞, 至第3代的BMSCs形态基本单一, 呈梭形或扁平形, 增殖至细胞融合时, 倒置相差显微镜下观察呈漩涡状排列 (图1B) 。

2.2 BMSCs 的诱导分化

A组细胞经诱导3 d后可见转化的细胞增殖分裂成小圆形, 呈团簇状半悬浮状态。对这些细胞进行连续观察, 发现其胞体逐渐增大, 并有突起逐渐伸出、延长, 诱导7d 后可见大量具有2个或多个突起的细胞, 胞体呈大多角形或不规则形, 类似于神经元和胶质细胞形态, 折光性较强, 细胞突起间相互连接成网状, 可见细胞核和核仁 (图1C) 。B组和C组细胞诱导后未出现类似变化, 仍为典型的成纤维细胞形态。

2.3 BMSCs 的诱导分化后免疫细胞化学检测

A组诱导3 d后NSE免疫阳性细胞有少量表达, 诱导7 d后NSE阳性细胞数增多, NSE阳性细胞占BMSCs 总数的比率为 (14.74 ±3.50) %;B组和C组无NSE阳性细胞。

3 讨 论

近年来的研究表明, BMSCs可向神经类细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、网状细胞、脂肪细胞等方向分化[2,3] 。但由于BMSCs 在骨髓中的存在率仅为0.1%, 其在自然状态下大多向成纤维细胞方向分化, 向神经细胞方向分化的比例非常低[4]。因此, 必须在体外进行培养扩增, 并寻找高效的诱导方案。本实验采用密度梯度离心法, 利用BMSCs易黏附塑料的特性, 经过换液和传代, 分离BMSCs。同时通过不同的诱导条件, 对BMSCs 进行诱导分化。研究发现, 添加不同的诱导剂, 可诱导出不同比例的神经样细胞。bFGF的作用广泛而复杂, 能维持由EGF激发的NSCs的存活及增殖, 有诱导NSCs向神经元分化的作用, 并可维持神经元和神经胶质细胞的存活, 诱导神经元合成神经特异性基因 (SCG2100) 产物和乙酰胆碱转移酶, 并能促进交感神经和副交感神经的轴突生长, 具有丝裂原样作用[5,6]。EGF是有丝分裂的促进因子, 其作用没有种属特异性, 对NSCs分裂有促进作用, 可诱导NSCs向星形胶质细胞分化, 促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活[7]。RA是维生素A的衍生物, 能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应, 能调节对EGF有反应的NSCs分化, 增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成[8]。BMPs是转化生长因子超家族的一员, 在骨的发育和结构维持方面发挥极其重要的作用。最新的研究显示, BMPs在一定因素下具有诱导干细胞向神经细胞分化的作用[9]。

本实验结果表明, 从成年大鼠骨髓中分离得到的BMSCs, 可在体外扩增得到大量分化潜能稳定的子代细胞, 为下一步BMSCs 移植治疗奠定了基础。应用全骨髓贴壁筛选培养法, BMSCs于接种后1 h即开始贴壁, 72 h完全贴壁, 3～4 d后进入对数增长期, 14 d左右即长满培养瓶壁。消化传代细胞接种后无增殖潜伏期, 可于1周内再次长满瓶壁。传代后的细胞形态无明显变化且性质稳定。该方法简单高效, 易于掌握和推广。bFGF、EGF和RA联合诱导3 d后部分BMSCs 可转变为神经元样细胞, 出现轴突和树突样结构, 且多个神经元间可形成网络连接。诱导7 d后鉴定结果显示该细胞有神经元标记物NSE表达。而应用BMP- 7在此种诱条件下诱导BMSCs, 形态上未见向NSCs分化的倾向, 免疫组化结果显示未见神经元标记物NSE阳性细胞。对照组亦无阳性细胞出现。

本研究结果显示, 经过EGF、bFGF和RA的联合诱导, BMSCs在形态学上呈神经元样细胞形态, 细胞突起增多, 折光性增强, 且分化的细胞表达神经元细胞的特异性标记NSE, 说明EGF、bFGF和RA可联合诱导BMSCs分化为神经元样细胞。文献报道β-巯基乙醇的诱导作用快且强, 但分化后细胞存活时间过于短暂, 2 h 即有细胞漂浮, 6 h大部分细胞溶解、死亡, 实际应用价值并不大[10]。本研究诱导的神经元样细胞出现较迟, 72 h才有形态学改变, 7 d大部分细胞仍能存活并可表达神经元细胞的特异性标记, 经多次换液和传代细胞仍较稳定, 说明本研究采用的诱导分化系统不仅成功诱导分化出神经元样细胞, 且分化细胞寿命远大于目前文献报道, 多次传代后细胞形态和性质稳定, 为今后开展NSCs 移植研究奠定了实验基础。而在此种诱导条件下用BMP- 7诱导BMSCs未见有向神经细胞方向分化的倾向, 考虑可能为诱导条件不适宜, 尚需进一步摸索诱导条件, 本课题组考虑能否用BMP- 7基因转染等方法诱导BMSCs向NSCs方向分化, 此尚需进一步研究。

目前, 在体内或体外拟诱导NSCs特异地分化为特定表型的神经元尚有一定困难, 随着对细胞因子在NSCs增殖分化过程中作用的进一步研究和与基因调控手段的结合, 有望能精确地控制NSCs向功能神经细胞分化的比例, 对NSCs移植治疗中枢神经系统疾病有重大意义。

参考文献

[1]Brazelton T R, Rossi F M, Keshet G I, et al.From marrow tobrain:expression of neuronal phenotypes in adult mice[J].Science, 2000, 290 (5497) :1752-1779.

[2]Stewart K, Walsh S, Screen J, et al.Further characterization ofcells expressing STRO21 in cultures of adult human bone mar-row stromal cells[J].J Bone Miner Res, 1999, 14 (8) :1345-1356.

[3]Prockop D J.Marrow stromal cells as stem cells for continualrenewal of nonhematopoietic tissues and as potential vectors forgene therapy[J].J Cell Biochem, 1998, 30-31 (Suppl) :284-285.

[4]Jiang Y, Jahagirder B N, Reinhant R L, et al.Pluripotency ofmesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature, 2002, 418 (6893) :41-49.

[5]Sieber-Blum M, Zhang J M.Growth factor action in neural crestcell diversification[J].J Anat, 1997, 191 (Pt 4) :493-499.

[6]Pincus D W, Keyoung H M, Harrison-Restelli C, et al.Fibro-blast growth factor-2/brain-derivered neurotrophic factor-asso-ciated maturation of new neurons generated from adult humansubependymal cells[J].Ann Neurol, 1998, 43 (5) :576-585.

[7]Woodbury D, Schwarz E J, Prockop D J, et al.Adult rat andhuman bone marrowstromal cell differentiate into neurons[J].J Neurosci Res, 2000, 61 (4) :364-370.

[8]Li M, Pevny L, Lovell-Badge R, et al.Generation of purifiedneural precursors from embryonic stem cells by lineage selec-tion[J].Curr Biol, 1998, 8 (17) :971-974.

[9]Phinney D G, Isakova I.Plasticity and therapeutic potential ofmesenchymal stem cells in the nervous system[J].Curr PharmDes, 2005, 11 (10) :1255-1265.

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇7

关键词：间充质干细胞,脐血,骨髓,体外培养

干细胞以其具有强大的增殖能力及多向分化的特性成为生命科学研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)于1982年由Frieden stenin[1]发现,是目前研究较多的一类成体干细胞。脐血间充质干细胞(Umbilical Cord Blood Mesenchymal stem cells,UCBMSCs)的研究开展较晚,直到2000年,EricesA[2]等人分离早产胎儿脐血单个核细胞,并使用20%胎牛血清,体外培养发现有间充质干细胞样的梭形细胞贴壁后,才有了更多的研究。随着对脐血间充质干细胞的进一步研究,有作者报道,从脐血中分离出间充质干细胞存在极大困难。本文采用了不同的实验方法于2007年7月～2008年3月对36例脐血间充质干细胞分离、培养,并与11份骨髓间充质进行对比,探索脐血中间充质干细胞的最适培养条件,并对其形态特征、生长特性等进行观察,为脐血间充质干细胞进一步应用于实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Ficoll-Paque分离液(美国Pharmacia公司);10%胎牛血清(南京新天地生化制药公司);10%胎牛血清(Hyclone);10%小牛血清(华西生物制品厂);L-DMEM培养基(Gibco.USA)。

1.2 标本的来源和采集

脐血标本的采集:36例脐血均来自我校附二院产科足月顺产的健康产妇,产妇平均年龄(28±5)岁,31例剖宫产,5例顺产。骨髓标本的采集:11例成人骨髓来自健康自愿者,按常规骨髓穿刺方法采集。

1.3 实验方法

1.3.1

无菌条件下取正常足月产脐带血36份,CAPD-1复合抗凝剂抗凝。其中1 8份脐血采用直接分离法,即将脐血稀释后,直接用Ficoll分离单个核细胞,分别采用含5%、10%、20%血清浓度的L-DMEM常规间充质干细胞贴壁培养;其余18份脐血采用间接分离法,即将脐血用5g/L的甲基纤维素先沉降出红细胞,然后将富集到的白细胞用Ficoll进行密度梯度离心,获得单个核细胞,同样分别采用含5%、10%、20%血清浓度的L-DMEM进行培养。

1.3.2

无菌条件下取11份骨髓,按常规间充质干细胞分离培养法,分离培养骨髓作为阳性对照。

1.3.3

对不同方法富集到的脐血单个核细胞数量进行对比,对脐血原代和传代细胞的贴壁时间、贴壁细胞类型、生长速度进行观察记录,对各脐血组成功培养出间充质干细胞的例数进行统计分析。

2 结果

2.1 两种方法分离脐血单个核细胞的比较

间接分离法获得的脐血有核细胞数量显著多于直接分离法(P<0.05);两种方法有核细胞数死亡率差异无显著意义(P>0.05);两种方法分离的细胞培养7天后在30cm2培养瓶中的贴壁细胞克隆数间接分离法显著多于直接分离法(P<0.05),见表1。

2.2 脐血及骨髓组间充质干细胞体外生长的动态观察

2.2.1 原代细胞形态特征

2.2.1. 1 骨髓组(A组):

骨髓单个核细胞经24小时首次换液后,见贴壁细胞数量较多,为短梭形或纺锤形,圆形细胞很少;3天后梭形细胞变长,数量增多(见图1,A)。

2.2.1. 2 脐血组(直接分离法)

5%FCS组(B1组):72小时首次换液后,见梭形细胞和圆形细胞稀疏散在分布。梭形细胞呈短纤维状或纺锤形,形态似骨髓中的梭形细胞,数量少,混杂于圆形细胞中。圆形细胞数量也少,多数为小圆形细胞,单个核,贴于瓶壁生长,形态似骨髓中圆形细胞(见图1,B)。

10%FCS组(B2组):贴壁细胞数量较B1组多,细胞类型及各种细胞比例与B1组相似。

20%FCS组(B3组):贴壁细胞数量较B1、B2组多,贴壁细胞多为圆形细胞,梭形细胞数量仍然少。

2.2.1. 3 脐血组(间接分离法):

5%FCS组(C1组):贴壁细胞数量较B3组多。短梭形细胞数量较多,圆形细胞大小不一,数量较少(见图1,C)。

10%FCS组(C2组):贴壁细胞数量较C1组多,仍然由梭形细胞和圆形细胞构成。有2/6份脐血出现了大量的梭形细胞,梭形细胞形态同骨髓中的梭形细胞,活力好,轮廓清楚。呈克隆样生长,同样也有较多的小圆形细胞(见图1,D)。

20%FCS组(C3组):贴壁细胞同以上各组相比,数量最多,成份最杂,梭形细胞较骨髓中的梭形细胞短,有的梭形细胞核内可见1～2个核仁。圆形细胞成份复杂,细胞大小不等,有多核大圆形细胞、单个核的大圆形细胞、边缘呈毛刺状伸出的小圆形细胞等。

2.2.2 传代细胞形态特征

2.2.2. 1 骨髓组(A组):

约1～2周细胞融合长满瓶底,形态均一,细胞出现分枝交叉,呈旋涡状紧密排列。0.25%胰酶作用约2分钟即可消化下来。传代细胞生长迅速,以1×105接种,3～4天即可达80%融合。随着细胞的传代,形态由长梭形变短、宽,多角,分枝,细胞融合后仍呈旋涡状排列(见图2,A)。

2.2.2. 2 脐血组

直接分离法:

5%FCS组(B1组):多份细胞经长达3周不能融合,0.25%胰酶作用10分钟后也不易被消化下来,1:1传代后细胞生长较原代更慢,最后本组所有细胞老化死亡(见图2,B)。

10%FCS组(B2组):传代细胞生长情况同B1组,但本组中有1/6份细胞出现如A组样优势生长、呈旋涡样排列的梭形细胞。

20%FCS组(B3组):传代细胞生长情况同B1组。传代后的梭形细胞生长慢,增殖不明显,多数不能融合,多份脐血贴壁细胞最终老化死亡。同样,本组中有1/6份细胞出现如A组样优势生长、呈旋涡样排列的梭形细胞。

间接分离法:

5%FCS(C1组):传代后细胞生长相对快,3周左右达融合,但多份脐血梭形细胞仍不能优势生长,圆形细胞可以融合生长,0.25%胰酶难以消化。本组中2份样本出现梭形细胞优势生长。

10%FCS(C2组):原代细胞生长快,2周达融合。传代后细胞生长相对快,但梭形细胞不能优势生长,传至第三代时仍有较多的圆形细胞,并且融合生长。本组中仍有2/6份脐血梭形细胞呈克隆样生长较快,0.25%胰酶容易消化,传至第三代时细胞已很纯,成梭形或多角形,融合时呈旋涡状排列。形态似A组骨髓MSCs细胞(图2,C)。

20%FCS(C3组):原代细胞生长快,不到2周多份细胞已达融合,传代后细胞生长速度逐渐渐慢,多数为圆形或类圆形细胞,梭形细胞不能优势生长。传至第三代仍然以圆形细胞为主,呈铺路石样排列(见图2,D)。传代过程中渐老化死亡。有1/6份脐血呈骨髓MSCs细胞样生长。

综上,A组骨髓样本全部培养出了MSCs样的细胞,至第三代时形态一致,为梭形,旋涡状排列;B1组、B2组、B3组多份细胞传至第三代时仍然不纯,梭形细胞不能优势生长,最后,细胞老化死亡,仅B2、B3组各一份脐血细胞出现梭形细胞优势生长,但是生长速度较慢,3周左右才能达融合;C1、C2、C3组原代生长较快,贴壁细胞数量多,但贴壁细胞成份复杂,有5份脐血传到第三代时出现间充质样的梭形细胞。

A:骨髓组原代;B:脐血组(直接分离法,5%FCS);C:脐血组(间接分离法,5%FCS);D:脐血组(间接分离法,10%FCS)

A:骨髓组P3;B:脐血组P3(直接分离法,5%FCS);C:脐血组P3(间接分离法,10%FCS);D:脐血组P3(间接分离法,20%FCS)

2.3 间充质干细胞培养成功率

根据本次实验设定的培养成功率的判定标准,即出现A组骨髓MSCs细胞样的形态和排列方式,则定为培养成功。对各组的成功培养率的统计结果显示,脐血组总体成功培养率为20.0%(7/36),而骨髓组(阳性对照组)成功培养率为100%(11/11),统计分析两组差异有显著意义(P<0.05);脐血组内直接分离法和间接分离法成功培养率分别为:11%(2/18)和28%(5/18),差异有显著意义(P<0.05);间接法采用5%、10%血清组组成功培养率较高,达到33.3%。显著高于其它组(P<0.05),见表2。

2.4 光学显微镜下细胞计数并制作生长曲线

脐血P5代生长曲线见图3(左)。传代后8～12小时,相差显微镜下即可观察到细胞贴壁,传代后7～13d天,细胞处于对数生长期,16～19天进入平台期,扩增速度快于原代培养,但慢于骨髓组,倍增时间为8.5天,3周左右即可长满培养板。

骨髓MSCsP5代生长曲线见图3(右)。传代后6～12h,相差显微镜下即可观察到细胞贴壁,接种后2～4d,细胞进入对数生长期,6～7天进入平台期,扩增速度明显快于骨髓,倍增时间为8.5天,6～7d即可铺满培养板底。

3 讨论

脐血间充质干细胞成功培养率及其影响因素为:

3.1 采用甲基纤维素的间接分离法有利于MSCs的成功培养

有效分离脐血单个核细胞是MSCs培养成功的关键因素之一。因为脐血中MSCs含量非常少,有人报道仅0.35×10-6[3]。因此必须要有足够的单个核细胞用于MSCs的分离培养。每份脐血样本分离出单个核细胞数不低于1×108对于MSCs成功培养非常重要[4]。

脐血单个核细胞常用的分离方法主要有以下几种:6%HES沉降法、甲基纤维素沉降法、Ficoll分离法、Percoll分离法、3%明胶分离法、氯化铵溶解红细胞法,直接离心法等。不同方法对脐血单个核细胞的回收率各家报道不一。常用的单个核细胞的分离方法为Ficoll或Percoll直接分离法[5,6,7,8]。即将脐血稀释后直接加于分离液上经密度梯度离心获得单个核细胞。三军医大的代飞[9]等对比了Ficoll和Percoll分离骨髓MSCs的方法,认为前者优于后者。Ficoll和Percoll均为常用的淋巴细胞分离液,还有人曾对这两种分离液对比研究,认为Ficoll分离获得的单个核细胞最为纯净。

本次研究中预实验发现,采用Ficoll和Percoll直接分离法操作时间长、不同批次的Ficoll或Percoll、不同的脐血样本、同一样本同样操作,收集的单个核细胞的数量多少不一,影响单个核细胞的稳定收集。

为此,本实验选择了5%甲基纤维素结合Ficoll用于分离脐血中单个核细胞的方法,该法每次获得的单个核细胞数量稳定,不影响细胞的活力和贴壁能力,提高了脐血MSCs的成功培养率,与不用甲基纤维素组而其它条件相同的相比,差异有显著意义(P<0.05)。而直接法费时、分离效果不稳定,混有较多的红细胞,影响MSCs的成功培养。目前该法用得很少,但也有报道,赵文利[10]采用该法成功培养出MSCs并将其诱导成肝样细胞,但没有在单个核细胞活力、贴附能力、数量等方面具体报道。

我们的实验通过对比研究认为,采用5%甲基纤维素结合Ficoll用于分离脐血中单个核细胞提高了MSCs成功培养率。

3.2 选择适合的血清浓度提高脐血MSCs的成功培养率

胎牛血清是最常用的培养添加物之一,其成份复杂,对它的许多作用并不十分明了。在某些情况下,胎牛血清的促分化作用强于促增殖作用,正因为如此,近年在以干细胞扩增为目的的培养中,越来越多地采用无血清培养体系。但由于胎牛血清中丰富的营养成份有利于细胞的体外增殖,因此,适当浓度的胎牛血清对细胞的体外生存是必要的。

目前,培养骨髓MSCs通常采用10%血清,可以取得很好的分离效果。对于脐血MSCs培养时的血清浓度则存在争议。有采用5%血清浓度的,如:黄伟等[11]对培养瓶予胎牛血清包被,共培养和分析了60例脐血间充质干细胞样本,将之接种于含5%胎牛血清的DMEM-LG中,最初2周内仅发现少许贴壁细胞,多数贴壁细胞为单核细胞并逐渐形成破骨样细胞,3～4周后基本融合,42例实验样本出现了上述情况。另有15个样本培养出了扩增迅速的间充质样细胞和少许破骨样细胞能促进细胞的贴壁及扩增,培养成功率25%。有文献将脐血单个核细胞分种于胎牛血清包被的常规培养基(10%胎牛血清)、低血清培养基(5%胎牛清)中,结果,低血清组12/12培养出了MSCs,常规培养组为3/12。也有文献采用10%的血清浓度,培养出较高比例的阳性率。Karen Biebac[11]等人利用10%胎牛血清从59份脐血中培养出了36例MSCs,阳性率近63%,三军医大的李启明[12]用10%胎牛血清成功培养出了MSCs,并诱导分化成肌、成骨、成脂,但没有报道成功培养的比例。

同样,有文献采用20%的胎牛血清成功培养的报道。2003年,Oscark·Lee等在采用20%胎牛血清+bFGF+L-谷氨酰胺+IMDM的培养条件下成功的培养出了间充质干细胞。

本次实验C组采用了3个血清浓度梯度(5%、10%、20%)在其它条件相同的情况下进行培养,发现首次换液后贴壁细胞数量有区别。高血清组贴壁细胞数量虽然多,但是杂细胞也多,出现了大小不等的多核圆形细胞,而具有MSCs样的细胞却相对少,分析原因可能系高血清组有利于各种细胞贴壁生长,但也影响了MSCs细胞的优势生长,增生的杂细胞抑制了MSCs细胞的增殖。其它两组(5%、10%血清组)成功培养率无明显差异。同样地,B组也采用了上述3个血清浓度梯度,结果5%血清组的成功率最低,而其它两组(10%、20%)成功率无明显差异。从上述结果看,血清浓度的选择与接种的单个核细胞的数量有一定关系,在高量(108)接种单个核细胞时选择5%或10%的血清浓度较适合,而高浓度血清不利于MSCs的成功培养,低量接种单个核细胞(106)时选择较高血清(10%、20%)较适合,低血清(5%)不利于MSCs的成功培养。此结果也解释了文献中采用相同的血清浓度却得出不同的成功培养率的原因,可能与接种的单个核细胞的数量不同有一定的关系。

参考文献

[1] Sanchez RJ,Song S,Cardozo-Pelaez F,et al.Adult Bone Marrow stromal cells differenitiate into neural cells in vitro[J].ExpNeurol,2000;164(2) :247～256

[2] Buzanska L,Machaj EK,Zablocka B,et al.Human cord blood drived cells attain neuronal and glial features in vitro[J].J Cell Sic,2002;115(10) :2131～2138

[3] Romanov YA,Svintsitskya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:Candidate MSC-like cells from UCB[J].Stem cells,2003;21:105～110

[4] Karen Bieback,Susanne Kern,Harald Klter,et al.Critical parameters for the isolation of Mesenchymal Stem Cells from umbilical cord blood[J].Stem Cells,2004;22(4) :625～634

[5] Erices A,Conget P,Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol,2000;109(1) :235～242

[6] Karen Bieback K,Kern S,Kluter H,et al.Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J].Stem Cells,2004;22(4) :625～634

[7] Lu Minjun,Xiao Zhifeng,Shen LiLi,et al.Mid-trimester fetal blood derived adherent cells share characteristics similar to mesenchymal stem cells but full-term umbilical cord blood does not[J].British Hematology,2003;124(5) :666～675

[8] Romanov YA,Svintsitskya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:Candidate MSC-like cells from UCB[J].Stem cells,2003;21:105～110

[9] 代飞,吴军,许建中,等.两种从骨髓中分离人间充质干细胞方法的比较研究[J].第三军医大学学报,2005;29(16) :1631～1633

[10] 赵文利,王宇明.人脐血间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞[J].世界华人消化杂志,2005;13(15) :1814～1818

[11] Karen Bieback,Susanne Kern,Harald Klter.Hermann Eichler Critical Parameters for the Isolation of Mesenchymat Stem Cells from Umbilical Cord Blood[J].Stem Cells,2004;22(4) :625～634

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇8

心肌梗死是人类常见的疾病之一, 患者即使能渡过急性期, 也会由于成体心肌细胞的再生能力不足, 使心肌细胞不可逆的丢失及被纤维瘢痕组织取代, 导致心力衰竭。因此, 如何提高患者的心肌细胞数量, 修复坏死心肌, 改善梗死区结构, 是一个意义重大的课题。

近年来, 干细胞移植疗法的研究不断升温, 细胞移植成为治疗心肌梗死的有益探索。在生命体的整个生长过程中, 干细胞扮演着重要角色;一般相信, 即使已发育成熟, 干细胞仍普遍存在于生命体中, 并担负着个体组织及器官的细胞更新与受伤修复的责任。

动物分组实验的研究结果显示, MSC移植后可促进心肌梗死后的创伤修复, 及改善梗死区结构。在对新西兰白兔的实验研究中发现, 注射的部位也是心功能改善的关键因素—将MSCs投送到梗死区有明显的修复作用, 注射到疤痕区, MSCs倾向于分化为成纤维细胞;而注射到边缘区, 则倾向于分化为心肌细胞。在大鼠骨髓细胞的自体移植实验中, 移植细胞在心肌微环境中存活, 且分化成心肌样细胞。移植细胞与宿主细胞以缝隙或闰盘相连, 大鼠的心功能得到明显的改善。

2 骨髓间充质干细胞及其分离培养方法

骨髓间充质干细胞具有分化为血管、神经组织、心肌组织等多种组织细胞的潜能。其优点是易于获取, 可进行自体细胞移植, 且不存在免疫排斥反应。

目前对于骨髓间充质干细胞的分离纯化, 常用的有贴壁细胞离心法、密度梯度离心法、流式细胞仪法与免疫磁珠分离法等。

贴壁细胞分离法是根据BMSCS贴壁生长的特性, 通过反复换液去除悬浮细胞, 使其与造血干细胞分离。培养所得的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖快, 细胞活性高, 缺点是所得细胞成分复杂, 分离难度高。密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度差异进行细胞分离。这种方法与贴壁分离法结合, 分离得到的细胞纯度相对更高, 获得广泛采用。免疫磁珠分离法是利用BMSCS的表面特异性抗原, 利用免疫磁珠进行分离。它是目前所能获得BMSCS纯度最高的方法。

在分离纯化过程中, 可用特异的表面标志对细胞进行鉴定。BMSCS的表面抗原非常复杂, 它本身也能分泌多种细胞因子、生长因子、粘附分子和细胞外基质。目前, 研究表明BMSCS表达的表面抗原有SH2、SH3、CD29、CD44、CD71等, 不表达的有CDl4、CD31、CD34、CD45等, CD45, CD34和CD14作为造血细胞典型的表面抗原, 表达阴性。此外还有很多细胞因子及标记物因受培养条件的影响表达不稳定。

3 BMSCS移植治疗心肌梗死的可能机制与临床探索

骨髓干细胞移植改善心功能的可能机制为: (1) 移植细胞给心室壁提供了强有力的构架, 能有效限制心肌的纤维化和坏死部位的扩张, 改善心肌收缩性;增加其顺应性和弹性, 并能与宿主的心肌细胞形成偶联, 参与心脏的同步收缩。 (2) 移植的骨髓干细胞能表达多种细胞因子、生长因子、促血管生成因子, 从而促进细胞增殖和血管再生。 (3) 血管再生有利于侧枝循环建立, 以及移植细胞的长期生存, 抑制梗死区扩大与心肌细胞凋亡。 (4) 骨髓干细胞能表达肌钙蛋白-1和connexin-43分子等心脏特异性标记物, 这与心脏功能的改善密切相关。

目前, 骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死已进入临床研究阶段。因脂肪沉积而导致冠状动脉堵塞的患者, 大部分可以通过冠脉搭桥术或球囊扩张术来治疗, 改善血流供应。而部分患者由于冠脉病变广泛, 无法采用上述方法进行有效治疗。

日本山口大学的Hamano博士等研究者从患者中挑选5例作为研究对象。他们平均年龄66岁, 有严重的心绞痛, 无法通过搭桥手术改善心肌供血。在进行手术时, 研究者从其髋骨中抽取骨髓, 处理后得到包括干细胞和血管内皮细胞等单核细胞的富集液。分别对患者注射了5~22处, 点间距为1cm。术后1个月用核素心肌扫描测定冠脉血流量, 随访1年。

试验结果显示有3例患者的心肌血流得到明显改善, 心绞痛消失。另外2例则无改善。所有患者的检查项目均未发现不利变化, 但从血管造影片上很难清楚地辨出有新血管形成。研究者解释说, 注射骨髓细胞所形成的新血管直径为30~60μm, 血管造影片仅能分辨出直径>200μm的血管。

学者在这方面的研究与实践, 为心肌梗死的治疗开创了新的里程碑。然而在这个领域尚存在许多问题有待探索: (1) 寻找对人体无害又便于跟踪的移植细胞标记物; (2) 进行干细胞移植的最佳途径; (3) 能够有效改善心脏功能的最佳移植剂量与细胞类型; (4) 干细胞移植的临床适应证研究; (5) 移植后能否产生正常的心肌电-机械偶联, 形成功能合胞体; (6) 移植后干细胞能否在宿主体内长期存活, 增殖和分化。

参考文献

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

周龄Wistar大鼠,购于吉林大学实验动物中心。DMEM培养基、B27(Gibcol公司),4’,6’-二乙酰基-2-苯基吲哚 (DAPI Roch) ,Percoll分离液、双硫腙 (DTZ) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子 (EGF)、胎牛血清、活化素、胰岛素、DMSO 、IBMX (Sigma公司), 地塞米松, Western blot 检测试剂盒(博士德公司)。

1.2 胰腺条件培养液的制备

将本校实验动物部提供的20只健康Wistar周龄大鼠处死,无菌条件下取胰腺组织,匀浆器研磨,离心取上清,滤器抽滤,-70℃反复冻融、1 500 r/min离心10 min,去上清冻存备用。

1.3 大鼠骨髓MSCs的分离、扩增培养

采用本室常规培养、扩增法。将周龄大鼠脱臼处死,75%酒精消毒,无菌条件下取股骨,用DMEM(低糖)培养液反复冲洗髓腔,尼龙网过滤细胞。加等体积的percoll分离液,2 000 r/min离心20 min,收集细胞的界面层,以5×106/ml接种于培养瓶中,加入20%胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2对其进行纯化、培养、传代。

1.4 体外诱导MSC向胰岛样细胞转化

取第3代骨髓MSC胰酶消化,制成单细胞按2×105/ml接种于6孔板中。分成3个实验组、1个对照组,使用无血清的低糖培养基培养2~3 d。3个实验组分别加bFGF、EGF、B27进行诱导培养6~7 d,免疫细胞学检测诱导细胞nestin表达情况。然后换用无血清高糖的培养基,并添加胰腺条件培养液、HGF(10 ng/ml)、2%B27、ActiveA、β巯基乙醇及尼克酰胺,继续培养6~7 d,对照组不加任何因子。

1.5 双硫腙染色鉴定胰岛样的细胞团

将诱导的细胞用缓冲液冲洗后,加1 ml 10 μg/ml双硫腙液,37℃孵箱孵育20 min,倒置显微镜观察细胞。

1.6 免疫细胞化学鉴定胰岛素和胰岛素样生长因子抗原表达

诱导后的细胞盖片,95% 乙醇固定,PBS洗3次,3%H2O2-甲醇液处理30 min,PBS洗3×5 min,0.25%tritonx-100,5%的DMSO溶液孵育10 min; PBS洗3×5 min,滴加5%~10%正常血清,室温,封闭30 min;滴加抗鼠胰岛素抗体,4℃过夜; PBS洗3×5 min,滴加合适FITC标记的二抗,37℃孵育30 min;PBS洗3×5 min,0.25%tritonx-100,5%的DMSO溶液孵育10 min; PBS洗3×5 min,滴加5%~10%正常血清,室温,封闭30 min;滴加抗鼠胰岛素样生长因子抗体,4℃过夜; PBS洗3×5 min,滴加合适FITC标记的二抗,37℃孵育30 min,封片。通过激光扫描共聚焦显微镜镜下观察。

1.7 Western blot检测胰岛样细胞胰岛素的表达

诱导分化2 w后,未诱导MSC为对照组,诱导分化细胞为实验组,以正常胰岛细胞为阳性对照,进行Western blot检测胞浆蛋白。离心收获细胞,用800 μl TEN洗脱,3 000 r/min离心5 min,弃上清。沉淀细胞用裂解缓冲液裂解后5 000 r/min离心5 min,取上清提取蛋白。将提取的蛋白定量,SDS-PAGE电泳,加封闭液室温封闭2 h,加入胰岛素抗体,加入二抗反应液,DAB显色。同时对凝胶染色,检查蛋白质转移是否完全。使其与抗体结合显色照相分析结果。

2 结果

2.1 MSCs的分离、扩增培养

经percoll分离液分离的细胞24 h后有少量梭型细胞贴壁,72 h后贴壁生长,成圆形、椭圆形、椭圆形、梭形不等。细胞达80%融合后用0.25%胰酶消化,传代继续扩增培养。传代后贴壁细胞大都成梭形。流式细胞仪鉴定所得细胞不表达CD45、CD44,CD34表达甚微。表明所得细胞是骨髓中一群处于未分化状态的幼稚干细胞。

2.2 体外诱导MSC向胰岛样细胞转化

在诱导的过程中MSC的形态渐渐发生变化,最初大多数细胞呈长梭形,少数细胞呈多角形或圆形,见图1、图2。诱导的骨髓MSCs免疫组化表达nestin。1 w后的细胞明显增多,已经聚集成团,见图3。2 w后部分细胞聚集呈悬浮状。

2.3 双硫腙特异染色

将诱导2 w的细胞进行双硫腙染色,倒置显微镜下观察,大部分细胞团都呈亮红色,见图4,表明诱导的细胞胞浆中含有锌离子。未诱导的MSC双硫腙染色阴性。

2.4 免疫组化鉴定胰岛素和胰岛素样生长因子抗原表达

将诱导分化2 w的细胞进行双重荧光标记免疫细胞化学染色,通过激光扫描共聚焦显微镜检测,第一通道FITC(异硫氰酸荧光素),荧光色为苹果绿,表示有胰岛素表达;第二通道Cy3(吲哚碳花青甙)荧光色为红色,显示胰岛素样生长因子表达,见图5。未诱导的细胞无表达。

2.5 Western blot胰岛素水平测定

结果发现,阳性对照组胰岛素有微弱表达,诱导分化为胰岛样细胞的实验组胰岛素表达阳性,未诱导的MSC胰岛素表达阴性,见图6。

注:1.对照组:未诱导的骨髓MSCs; 2.实验组:诱导分化后的骨髓MSCs; 3.阳性对照组:正常胰岛细胞。

3 讨论

MSC为多胚层细胞祖细胞的集合体,具有明显的可塑性,不同的细胞因子作用,导致MSC向不同的细胞系分化[5]。已证实可向心肌细胞、肝细胞及神经样细胞等转化,因此,它具有可向胰岛细胞的祖细胞转化的可能。

胰岛细胞主要是由α、β、γ、pp 4种细胞组成,将MSC体外诱导分化为胰岛细胞需要适宜的微环境。据报道大鼠MSC可以诱导转化为神经元细胞,而胰岛细胞最初发育阶段的形态与神经细胞非常相似[6],因此有人推断细胞分化过程中胰岛样细胞可能来源于神经元样细胞[7]。某些神经生长因子及必要的微环境也是胰腺发育的重要因素。nestin阳性细胞是在神经干细胞中发现的一种中间丝蛋白,已被确认为一种神经干细胞标志,由nestin阳性胰腺导管上皮样细胞诱导分化得到胰岛细胞亚群[8],因此认为nestin是胰岛干细胞的分子标志,可能有促进MSC向胰岛细胞分化的作用。MSC的可塑性表现在它们可在新的微环境中生成新组织所必需的细胞株。也可用随机抑制、随机诱导来解释,在转录水平和细胞因子水平进行调控。

本实验对MSC体外诱导胰岛细胞的培养体系进行了初步探讨。由于某些神经生长因子及必要的微环境也是胰腺发育的重要因素。EGF、bFGF具有扩增神经干细胞的功能[9,10],所以笔者首先将MSCs在无血清的DMEM培养基中培养,筛选nestin阳性细胞,使用EGF、bFGF进一步将MSC诱导成为nestin阳性细胞。另外,骨髓基质干细胞不仅可分化为中胚层细胞如脂肪细胞、软骨细胞,也可以分化为肝细胞等内胚层细胞;而肝细胞和胰岛细胞来源于同一祖细胞,肝细胞中的干细胞也可以转分化为胰岛细胞[11,12],因此笔者选择使用HGF和较特异的胰岛细胞分化剂尼克酰胺及胰腺组织条件培养液促进MSC向胰岛细胞分化。高糖培养基的使用,是因为提高葡萄糖浓度可以刺激MSC诱导分化。尼克酰胺又可以促进高糖诱导分化的细胞聚集,加快胰岛样细胞团的形成,增加胰岛细胞分化的数量,促进分化细胞的成熟[13]。地塞米松、B27、胰岛素可营养细胞并维持各种离体细胞的生长。活化素等因子可促进β细胞分化[14]。经诱导分化而来的胰岛样细胞,要经过一定的细胞因子(大部分是生长因子)作用后才能成熟,产生比较强的分泌胰岛素的功能。这是由于这些细胞因子在体外提供了使细胞成熟的环境,其中葡萄糖是强力促胰岛素分泌细胞成熟剂。在条件培养液中应该存在胰岛细胞生存的营养素及细胞生存因子。因此,胰腺条件培养液不仅提供了MSCs向胰岛细胞转化的细胞因子,还为所要诱导的MSC创造一个模拟体内的适宜体外胰岛细胞生存的微环境,MSCs可以分化成胰岛样细胞团的研究结果表明了微环境对MSCs的定向诱导分化起着重要作用,也为实现糖尿病患者用自体干细胞治疗自身疾病开辟了一条新途径。

在培养和诱导MSC的过程中,大多数MSC的形态由长梭形变成圆形并逐渐聚集。由于胰岛细胞中含有丰富的锌离子,双硫腙与其结合使细胞变成红色,因此双硫腙染色被认为是鉴定胰岛细胞较特异的方法。实验证实,多数细胞双硫腙染色阳性,证明体外诱导分化的MSC具有胰岛细胞的特性,说明大鼠MSC可在体外诱导分化为胰岛样细胞;在诱导分化的第一阶段(第一周),免疫组化、Western blot检测所诱导的细胞胰岛素有微弱表达;第二阶段(第二周),胰岛素表达增强,说明细胞已进入成熟阶段具有胰岛细胞的分泌功能。