DREB转录因子研究进展（精选8篇）
植物特有的.NAC家族转录因子数量众多,广泛分布于陆生植物中.NAC转录因子涉及多个生长发育和胁迫应答过程,功能多样而重要,从发现至今一直是研究的热点.ANAC019蛋白三维结构的解析和一系列NAC基因功能的揭示可以帮助我们更全面地了解NAC家族,包括它们的起源与分类、生物学功能、表达调控规律以及结构与功能的关系.该文较为详尽地阐述NAC家族转录因子的研究现状,并展望其未来的研究方向.
作 者：彭辉 于兴旺 成慧颖 张桦 石庆华 李建贵 麻浩 作者单位：彭辉(南京农业大学大豆研究所,作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京210095;广西师范大学稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室,桂林541004)
于兴旺,成慧颖,麻浩(南京农业大学大豆研究所,作物遗传与种质创新国家重点实验室,南京210095)
张桦,石庆华,李建贵(新疆农业大学农业生物技术重点实验室,乌鲁木齐,830052)
转录因子是一类能够与基因上游的特异核苷酸序列结合以调控基因转录的蛋白质,转录因子不仅可以与基因上游的启动子区域结合,也可以和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录。植物体内存在大量的转录因子,在生长发育过程中,植物感受高温等环境胁迫信号,并通过一系列的信号转导途径激发转录因子,使转录因子与顺式作用元件结合后,启动基因的表达,通过产生抗氧化剂和渗透调节物质对外界胁迫信号在生理生化等方面的调节反应,保证植物的生长发育。该文对近年来通过基因工程方法利用高温抗性转录因子转化植物,提高植物高温抗性的研究进展进行综述,为基因工程方法培育抗热植物提供参考。
1 植物高温抗性转录因子
目前已经发现的植物高温抗性转录因子有热激转录因子、脱水应答元件结合蛋白、MYB类转录因子、WRKY转录因子以及其它转录因子。
1.1 热激转录因子
热胁迫下热激基因表达迅速增加,热激蛋白(heat shock protein,HSPs)迅速积累,作为分子伴侣帮助相关受损蛋白重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解,使植物在逆境中生存。热激蛋白的表达是受一类专门的转录因子-热激转录因子(Heat stress transcription factor,HSFs)调控的。热胁迫下热激转录因子特异结合到高温调节基因上游的热激蛋白启动子区的热激元件(Heat shock protein promoter region components element,HSE)回文序列上,对多数热激蛋白基因及热胁迫调节基因,非热激蛋白基因的转录激活起到调节作用。最近的研究表明,HSFs与HSPs一同组成了HSF-HSP环路,作为调节网调节热胁迫应答基因的转录激活[2]。高温胁迫应答时HSFs经历了同寡聚化或异寡聚化状态的改变,使HSFs在细胞中的位置发生了变化,也对高温相关基因的转录调节起重要作用,HSFs的不同结合类型和HSF与蛋白的互作也会影响不同环境下的细胞功能[3,4]。
1.2 脱水应答元件结合蛋白
脱水应答元件结合蛋白(Dehydration response element binding protein,DREB)最初作为对干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫应答的转录调节因子为人们所了解。DREB类基因的过表达能够激活热激相关基因的表达,提高植物对高温的耐受力。预测调节高温的遗传学级联放大反应时,DREBs和HSFs可能产生了互作。
1.3 MYB类转录因子
MYB类转录因子是植物中最大的转录因子家族之一[5],它参与了植物激素和环境因子的应答反应、细胞分化与细胞周期调控[6],对植物次生代谢与花色素形成过程[7]以及叶片等器官的形态建成[8]等都具有重要的调节作用。MYB能够使植物对高温、低温、干旱及盐碱等胁迫环境应答。
1.4 WRKY转录因子
WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子,它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性作用[9],调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达,从而参与植物的各种防卫反应,调节植物的生长发育等。WRKY转录因子广泛参与植物对生物与非生物胁迫反应,例如参与盐、干旱、低温、新陈代谢、果实成熟、种皮和毛状体发育以及植物衰老[10]等一系列生理活动。WRKY基因也广泛参与植物对高温的应答。WRKY转录因子在基因表达过程中既是抑制物也是激活物。
1.5 其它转录因子
一些其它转录因子也广泛参与了植物对高温等逆境胁迫的应答。核转录因子X-盒结合基因1(Nuclear transcription factor X-box binding 1gene)促进获得抗热性的产生。锌指蛋白、碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)以及多蛋白结合因子(Multiprotein-bridging factor 1c,MBF1c)等转录因子也积极地参与了植物对高温胁迫的响应。
2 高温抗性转录因子提高植物抗热性
植物高温抗性转录因子在转化模式植物的研究中,往往表现为能够提高植物耐高温胁迫的能力,并可作为提高植物抗热性的备选基因。
2.1 热激转录因子
晁旭等[11]研究表明过量表达拟南芥热激转录因子(AtHsfA6a)的植株高温处理后的存活率远高于野生型植株,而反义转基因植株存活率则显著低于野生型,基因表达分析证明,AtHsfA6a受热胁迫诱导表达,并且调控下游靶基因Hsp70的表达,进而提高植物耐高温胁迫的能力。陈晓军研究表明,在转GmHsfA1基因大豆中GmHsfA1的过量表达激活了小分子量热激蛋白GmHsp22的转录,促进了高温诱导下2个内源热激蛋白基因GmHsp23和GmHsp70的表达,显著提高了转基因大豆的耐热性[12]。热激转录因子可以作为改良植物耐热性的主要候选基因之一。
2.2 脱水应答元件结合蛋白
过表达DREB2ACA(有持续活力的突变体形式)蛋白的植株抗热性增强,而敲除了DREB2A的植株抗热性降低。DREB2A启动子含有一个DREB2A基因热胁迫诱导表达重要的HSE序列。HSFA1a/b/d三元突变体和HS-FA1a/b/d/e四元突变体中,DREB2A的热胁迫诱导表达难以实现[13]。Qin等[14]对转ZmDREB2A的拟南芥进行芯片分析,发现ZmDREB2A过量表达能够增强Hsfa3等下游热激相关基因的表达,从而提高转基因植株的耐热性。转基因实验中,DREB基因已通过遗传转化方法转移到不同植物物种之中。过表达玉米(Zea mays)DREB2A基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的抗热性得到了加强[14]。过表达AtDREB1A蛋白的菊花(Chrysanthemum morifolium)维持较高的光合活性,提高了高温胁迫下的RUBISCO和蔗糖磷酸合成酶活力[15]。过表达OsDREB2B蛋白的拟南芥植株中,DREB2B蛋白使靶基因DREB2A的表达得到了增强,提高了植物的抗热性[16]。拟南芥中AtDREB2C蛋白水平的提高增强了拟南芥植株的抗热性[17]。高温胁迫下DREB2C和HSFA3的相互作用诱导了信号的转导[18]。过表达DREB2C的拟南芥植株生长阶段的抗热性得到了增强,但发芽阶段的抗热性没有增强。编码CBF/DREB1超家族AP2转录因子的DDF1基因的激活使拟南芥突变体产生了温度胁迫抗性和干旱胁迫抗性[19]。
2.3 MYB类转录因子
研究表明,与野生型拟南芥相比,转MYB44拟南芥对高温的抗性显著增强,而缺失突变体atmyb44对高温的抗性减弱。野生型拟南芥和atmyb44的H2O2含量及脂类氧化损伤均高于过表达MYB44拟南芥。但转MYB44植株拥有较高的抗氧化酶(如SOD,CAT,APX)活力和较高的耐热基因Hsp20,60,70,90和101表达量。表明转录因子AtMYB44能够通过上调HSP基因的表达并且产生高活力的抗氧化酶体系来增强植株的抗高温能力[20]。在根中柱鞘细胞中特异表达的AtMYB68受高温诱导表达,高温胁迫下,根中MYB68活性增强,而MYB68突变体的生长活力比野生型低[21],也说明MYB参与高温应答反应。
2.4 WRKY转录因子
对WRKY25、WRKY26和WRKY33基因在热胁迫应答中表达水平的微阵列分析发现,热处理的野生型拟南芥的WRKY25,WRKY26转录本丰富。42℃热处理1h后,WRKY25的转录水平比对照增加了4.9倍,WRKY26的转录本上调,与对照相比增加了2倍。与此相反,WRKY33的转录水平下调表达近2.3倍[22]。研究表明,转AtWRKY25基因的拟南芥植株AtWRKY25表达的增加使HSFA2、HSFB1、HS-FB2A和HSP100蛋白的含量升高,最终使植物具有抗热性[23]。OsWRKY11基因也能够对高温胁迫做出响应,对提高逆境耐性起作用。Wu等将带有HSP101启动子的OsWRKY11cDNA转入水稻(Oryza sativa L.)中,热胁迫后,高温胁迫诱导基因过量表达,转基因株系表现出明显的耐热抗干旱性状[24]。AtWRKY39[25]参与植物对热诱导的响应。WRKY68在高温条件下诱导表达,推测WRKY68可能参与植物对高温的调控[26]。
2.5 其它转录因子
过表达水稻锌指蛋白基因ZFP177的转基因烟草的抗热性增加[27]。拟南芥中过表达含有AtSAP10蛋白的锌指结构域赋予了拟南芥对重金属和热胁迫的抗性[28]。敲除锌指结构蛋白家族成员Zat12的拟南芥表现为对热胁迫敏感,同时过表达会提高植物的氧化胁迫和渗透胁迫的耐受性[29,30,31]。Zat10的过量表达可以提高植物抗干旱胁迫、渗透胁迫和高温胁迫的能力[32,33]。Gao等[34]研究表明,在拟南芥中,转录因子AtbZIP28与内质网膜相结合对抗热起重要的作用。暴露在高温胁迫时,锚定在内质网膜上的bZIP28向细胞核移动,启动抗热相关基因的表达,抵御高温伤害。喻旭等[35]研究表明与AtbZIP28高度同源的转录因子OsbZIP60在水稻中过表达能够增强水稻的抗热性和抗旱性。
近期的研究表明,多蛋白结合因子(MBF1c)是拟南芥中高温抗性的关键调节者。高温胁迫下其在水杨酸、海藻糖和乙烯基因的上游起作用。MBF1c在转录水平上调控高温胁迫下DREB2A、HSFs和锌指蛋白的表达。
3 培育抗热植株面临的挑战及对策
随着对植物耐高温机制研究的不断深入,已发现多种转录因子在植物适应高温等逆境胁迫中发挥重要作用,但植物对高温胁迫响应是一个复杂的过程,植物通过温度感受、信号传导、调控核内元件、基因表达调节和蛋白翻译几个阶段对胁迫应答,在热胁迫应答基因上游发现了Ca2+、NO等信号分子参与热胁迫信号级联放大,将胁迫信号通过CDPK等途径传导到细胞核中,增强抗热基因表达,合成渗透保护剂和抗氧化物来抵御热胁迫对细胞造成的伤害。虽然对植物耐高温的机制有了认识,但很多问题仍需探索,如调节高温表型的LEA蛋白、脱水素、甘氨酸丰富的RNA结合蛋白、FK506结合蛋白和伸长因子等影响高温抗性的详细机制仍不清楚。一些热胁迫相关基因已经被鉴定出来,但植物的高温抗性是由多基因控制的复杂性状。仍需对热胁迫下基因表达的转录组、表观基因组、代谢组和表型组进行印迹分析,以帮助鉴定热胁迫相关的有效性状(在伴侣蛋白、保护性因子、活性氧、膜的改变和上游因子),进而用来产生高温耐受性植株。另外,不同发育阶段高温诱导基因的表达差异很少有分析,需要进一步的研究。对多个物种的高温抗性应答特异的数量性状位点的研究也很有必要。最近,在小麦中鉴定了3个主要的数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)提高了小麦的抗热性[36]。曹立勇等[37]在水稻中检测到了20个耐热性QTL,这些QTL可用于分子标记辅助选择,以改良作物的耐热性,从而解决热害问题。
培育抗热植株的转基因实验中,采用遗传转化的方法将鉴定的有效的耐热基因导入植物基因组中,从而获得具有非生物胁迫抗性的转基因植株,研究基因功能,在植物转化中应用诱导型启动子表达目的基因,能够有效地调控下游基因的表达,最大限度地减少了由于组成型启动子恒常表达引起的外源蛋白积累对转基因植物造成的伤害。研究表明35S-DREB1A转基因烟草比rd29A-DREB1A转基因植株表现出明显的生长滞后现象;rd29A-DREB1A转基因植株的胁迫耐性明显高于35S-DREB1A转基因植株[38]。Pellegrineschi等[39]用胁迫诱导型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达,提高了转基因小麦的干旱胁迫耐性,而且没有引起明显的畸形。因此,利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因的表达成为改良作物非生物胁迫抗性的热点问题。然而,目前能够用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。为此,对于新的诱导型启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后研究的重点。
摘要：高温胁迫是影响植物生长代谢和产量的重要因素之一,通过基因工程方法能提高植物抵御热胁迫的能力。现对近年来发现的与植物高温抗性有关的转录因子进行综述,并阐述了通过基因工程方法利用已知转录因子提高植物抗热性的研究进展,以期为利用基因工程方法培育抗热植物提供参考。
摘 要：探究转录因子FOXM1不同的剪接异构体对乳腺癌EMT过程中的影响.采用基因工程方法分别构建了表达FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP两种 FOXM1剪接异构体真核表达质粒，并将其转染进乳腺癌细胞，采用RT-PCR和Western印迹检测细胞样本中FOXM1剪接异构体的表达和EMT相关基因表达，同时采用transwell检测高表达不同FOXM1剪接异构体细胞的侵袭和迁移能力.成功构建了FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP真核表达质粒.外源FOXM1B在乳腺癌间质型细胞的表达高于上皮型细胞，并主要存在于细胞核内，且高表达FOXM1B 能够显著促进乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程.外源FOXM1C在乳腺癌上皮型细胞中的表达高于间质型细胞，并且在细胞核和细胞质中均有表达，高表达FOXM1C能够显著抑制细胞的侵袭和EMT过程.实验结果表明，在乳腺癌细胞中，FOXM1B主要存在于细胞核内，FOXM1C在细胞核和细胞质中均有表达.本研究预示FOXM1B和FOXM1C对乳腺癌细胞EMT过程发挥不同的影响.
关键词：细胞粘附；FOXM1B；FOXM1C；乳腺癌； EMT
中图分类号：Q279 文献标识码：A
A Preliminary Study of Transcription Factor FOXM1
Isoforms in Breast Cancer EMT Process
TAN Yong-jun，CHEN Han-xiao
（College of Biology， Hunan Univ， Changsha， Hunan 410082， China）
Abstract：To explore the impact of different transcription factor FOXM1 isoforms in breast cancer EMT process， the eukaryotic expression plasmids for two FOXM1 isoforms， FOXM1B-EGFP and FOXM1C-EGFP， were constructed and transfected into breast cancer cells. The expression levels of FOXM1 isoforms and EMT related genes in the cells were detected with RT-PCR and Western blot. The migration ability of the cells overexpressing the FOXM1 isoforms was measured with the transwell test. The FOXM1B-EGFP and FOXM1C-EGFP eukaryotic expression plasmids were successfully constructed. We found that the levels of exogenous FOXM1B in mesenchymal cells were higher than those in epithelial cells， and it was mainly located in the nucleus. The high levels of FOXM1B expression significantly stimulated the invasion of breast cancer cells and EMT process. The levels of exogenous FOXM1C in epithelial cells were higher than those in mesenchymal cells， and they were expressed in both the nucleus and the cytoplasm. The high levels of FOXM1C expression inhibited the invasion of breast cancer cells and EMT process. FOXM1B was located mainly in the nucleus of cells and FOXM1C was expressed in both the nucleus and the cytoplasm of cells. The research has indicated that FOXM1B and FOXM1C play different roles in the process of EMT of breast cancer cells.
Key words：cell adhesion； FOXM1B；FOXM1C；breast cancer；EMT
FOXM1（Forkhead box protein M1）是叉头框（Forkhead box，Fox）转录因子家族中的成员，又称为Trident，HFH-11，Win，MPP-2等，定位于 12p13-3 号染色体，由十个外显子组成[ 1].FOXM1的蛋白表达存在着A，B 和C 3种剪接异构体：FOXM1A 比FOXM1B多两个外显子，不具有转录活性，在细胞中表达很低；FOXM1C比FOXM1B多一个外显子，和FOXM1B一样具有转录活性，且在肿瘤组织中有高表达，但在某些方面具有不同的生物学功能[ 2-3]；FOXM1B主要在癌细胞中高表达，而FOXM1C在正常细胞和癌细胞中均有高表达[ 4].上皮间质转化（Epithelial to mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞失去极性和细胞与细胞之间的连接点，经过细胞骨架重排、发生类似纤维状细胞形态改变，以此来增加细胞迁移和侵袭能力的过程[ 5].研究普遍认为EMT 的发生一般与胚胎发育、组织再生和癌症转移有密切的联系.在肿瘤发生过程中，上皮间质转化使得分化的上皮肿瘤细胞变为有迁移和侵袭能力的间质肿瘤细胞，从而使良性肿瘤细胞浸润周围正常组织，进一步使肿瘤细胞发生全身性扩散和转移[ 6].已有研究表明，EMT在乳腺癌的转移过程中发挥着至关重要的作用[ 7].FOXM1参与了肿瘤细胞的增殖、EMT等过程的调控：例如，在胰腺癌细胞中，高表达FOXM1B能增强细胞的生长能力、集落生成和细胞迁移能力，并导致细胞间质表型标志物表达上调和上皮表型标志物表达下降[ 8]；本实验室研究也表明FOXM1B能够促进乳腺癌的EMT进程，且FOXM1B 的表达水平与细胞的上皮和间质的特性以及细胞迁移能力呈正相关性[ 6].另一方面，已有研究发现FOXM1C受Raf/ MEK/ MAPK 信号通路调节，并通过影响G2/M进程从而对细胞周期进行调节[ 9].同时，FOXM1C还通过刺激BMI-1表达来抑制氧化应激引起的衰老和细胞增殖[ 10].目前，肿瘤细胞中FOXM1B和FOXM1C这两种FOXM1的剪接异构体在功能和定位上是否存在差异还不十分清楚.因此本研究以乳腺癌细胞的EMT过程为研究模型，探究FOXM1B和FOXM1C两种剪接异构体在不同表型的乳腺癌细胞中的定位以及在EMT过程中是否存在着功能差别.
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231均购置于中国科学院细胞库，按ATCC的细胞培养方法进行培养.
1.2 细胞总RNA提取、RT-PCR检测相关基因表达
RNA的提取按照Total RNA KitI试剂盒（Omega，USA）进行，运用M-MLV逆转录酶（Invitrogen，USA）将RNA反转录为cDNA.PCR检测所用引物序列见表1.
1.3 质粒克隆
以pcDNA3-HA-FOXM1B/C-V5质粒（香港大学生物化学系提供）为模板，PCR扩增得到FOXM1B/C全长的cDNA序列，将其克隆到pEGFP-C2载体上构建pEGFP-FOXM1B/C融合蛋白表达质粒.以pEGFP-C2为模板，PCR扩增得到EGFP全长的cDNA序列，将其克隆到pcDNA3-HA-FOXM1B＼＼C-V5质粒上构建pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B-V5融合蛋白表达质粒.所构建的质粒均经酶切和测序鉴定.其所用引物见表2.
1.4 细胞转染与检测
转染前一天接种1×10～6细胞于10 cm 培养皿中，待细胞铺满率达 80%～90%时，按Lipofectamine2000说明进行转染实验，于48 h后进行收样检测.
1.5 Transwell 实验
取对数生长的细胞，胰酶消化，细胞数为1×10 5/孔，上室用1% FBS的 DMEM 培养基培养，下室用5% FBS 的 DMEM 细胞培养基，37 ℃常规细胞培养 20～24 h 后，用0.1%的结晶紫进行细胞染色后，置于显微镜下拍照，随机取 3～5 个视野，用 image J 软件对照片进行数据分析.
1.6 统计分析
所有结果均采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，数据以X±S表示，两组间比较采用t-test，P<0.05具有统计学意义.
2 结 果
2.1 FOXM1在间质型乳腺癌细胞的表达高于上皮型细胞
显微镜下观察，MCF-7细胞呈扁平不规则多角形， E-cadherin表达量高于MDA-MB-231细胞，而MDA-MB-231细胞细长如梭形，Vimentin表达量高于MCF-7细胞（图1（a）～（c））.同时通过Transwell实验发现 MDA-MB-231细胞的侵袭和转移能力明显强于MCF-7细胞（图1（d）（e））.由此可以看出，MCF-7和MDA-MB-231虽同属于乳腺癌细胞，
但是两株细胞的细胞形态与基因表达存在着明显的不同.研究结果表明MDA-MB-231属于间质型细胞类型而MCF-7属于上皮型细胞类型.通过对FOXM1的检测发现，两株细胞中FOXM1B的mRNA水平无明显差别，而MCF-7细胞中的FOXM1C mRNA水平略高于MDA-MB-231细胞，但MDA-MB-231细胞中的FOXM1蛋白表达明显高于MCF-7细胞（图1（b），（c））.推测出现这种现象的原因，虽然FOXM1的不同剪接体的mRNA表达量在这两株细胞中存在差异，但实验中所用的FOXM1抗体无法区分两种剪接异构体蛋白，预示两种剪接异构体所产生蛋白的稳定性在这两株细胞中不同.
2.2 质粒构建
如图 2（a）所示，分别构建pEGFP-FOXM1B＼＼C，pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B＼＼C-V5 4个质粒，经酶切鉴定，测序鉴定正确（图 2（b））.
（a） 4个质粒的质粒图谱
（b） 4个质粒的克隆鉴定琼脂糖电泳图
2.3 重组质粒在真核细胞内的表达
将所构建的重组质粒pEGFP-FOXM1B＼＼C，pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B＼＼C-V5分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞，WB检测蛋白表达，结果表明FOXM1B在MDA-MB-231细胞中的表达水平较高，而FOXM1C在MCF7细胞中的表达水平较高（图3（a））.24 h后荧光倒置显微镜观测显示pEGFP- FOXM1B在MDA-MB-231细胞中的表达量高于pEGFP- FOXM1C（图3（b）），而pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1B-V5在MCF-7细胞中表达略低于pcDNA3-EGFP-HA-FOXM1C-V5（图3（d）），结果与蛋白检测结果一致.并且FOXM1B主要在细胞核表达，而FOXM1C在细胞核和细胞质中均有表达（图3（b）～（e））.
2.4 FOXM1B促进上皮间质转化的发生
在上皮型细胞MCF-7内高表达FOXM1B，收集样本进行相关检测，结果显示上皮型标志物E-cadherin表达水平显著下调，而间质型标志物Vimentin表达水平显著上调（图 4（a），（b））.Transwell实验同时证明FOXM1B高表达的MCF-7细胞的迁移能力明显高于对照组（图4（c），（d））.这些结果表明FOXM1B的高表达能够诱导MCF-7细胞向间质型细胞转化，使细胞呈现间质型细胞特性，促使EMT的发生.
2.5 FOXM1C抑制上皮间质转化的发生
在间质型细胞MDA-MB-231内高表达FOXM1C，收集样本进行相关检测，结果显示间质型标志物Vimentin水平显著下调，而上皮型标志物E-cadherin显著上调（图 5（a），（b））.同时Transwell实验表明高表达FOXM1C的MDA-MB-231细胞的迁移能力比对照组低（图5（c），（d））.以上结果表明高表达FOXM1C能够诱导MDA-MB-231向上皮型细胞转化，使细胞呈现上皮型细胞特性，抑制EMT的发生.
3 讨 论
本文将构建好的FOXM1B和FOXM1C真核表达质粒转入乳腺癌细胞，发现高表达FOXM1B 的MCF-7细胞上皮型标志物E-cadherin表达水平显著下调，而间质型标志物Vimentin表达水平显著上调.Transwell实验同时证明FOXM1B高表达的MCF-7细胞的迁移能力明显高于对照组，由此表明FOXM1B的高表达能够诱导MCF-7细胞向间质型细胞转化，使细胞呈现间质型细胞特性，说明FOXM1B能够促进EMT的发生.Park H J等人的研究也发现FOXM1B是肿瘤发生转移的活化剂，通过激活Akt-SNAIL1通路并刺激Stathmin，赖氨酰氧化酶，进而调节癌症转移相关基因的表达[ 13].由此可见，FOXM1B可受多种信号通路调节，激活癌细胞转移的相关标志性基因，进而激活EMT过程.而高表达FOXM1C的MDA-MB-231细胞显示其间质型标志物Vimentin水平显著下调，而上皮型标志物E-cadherin显著上调.同时Transwell实验表明高表达FOXM1C的MDA-MB-231细胞的迁移能力比对照组低，由此表明高表达FOXM1C能够诱导MDA-MB-231向上皮型细胞转化，使细胞呈现上皮型细胞特性，说明FOXM1C能抑制EMT的发生.Wierstra I等人研究发现FOXM1C可直接结合到上皮表型重要标志物E-cadherin的启动子序列上直接调节E-cadherin基因的表达，进而抑制EMT的发生[ 14].也有研究表明细胞可通过Raf / MEK/ MAPK信号刺激FOXM1C发生核转位，从而激活抑癌基因的表达，实现抑制EMT的作用[ 9].
综上所述，FOXM1B在间质细胞中高表达，同时促进EMT的发生，而FOXM1C在上皮型细胞中高表达，同时抑制EMT的发生.可以看出FOXM1B与FOXM1C作为FOXM1的剪接体具有完全相反的功能.因此，作为EMT的关键调控因子，FOXM1的不同剪接异构体FOXM1B和FOXM1C有望为乳腺癌的治疗提供潜在的作用靶点.
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1 T-bet与支气管哮喘
转录因子T-bet是2000年美国哈佛大学Glimcher研究小组[1]从小鼠Thl细胞株的c DNA文库中克隆得到的属于T盒家族的新转录因子。人类和鼠的T-bet在氨基酸水平有88%的同源性。小鼠的转录因子T-bet基因与气道高反应基因相连锁, 人类的T-bet基因有可能与哮喘基因相连锁。T-bet在体内主要见于肺、脾脏和胸腺, 而这些器官也是Th1细胞分布主要的位置。
T-bet对Th1/Th2平衡中细胞因子的调节主要表现为以下几点: (1) 诱导IFN-γ表达:研究发现, T-bet活化并诱导IFN-γ基因合成[2], IFN-γ与IFN-γR结合后, 通过活化STAT1 (single transducers and activators transcription 1) , 进而活化T-bet表达, T-bet再次诱导IFN-γ基因的转录, 由此形成一个干扰素-γ-STATl信号正反馈环路[3]。 (2) 诱导IL-12表达:T-bet活化后上调IL-12Rβ的表达, 活化的IL-12导致STAT4的表达正果, 从而促进Th0细胞向Thl分化漂移[4]。 (3) 诱导已分化的Th2细胞向Th1转化:研究发现, 将T-bet转到Th2细胞中, 发现这些细胞表达IFN-γ, 而IL-4、IL-5表达减弱, 且趋化因子组分亦向Th1变化, 表明这些Th2细胞变成了Th1细胞[5]。
我国学者研究发现向哮喘小鼠尾静脉注射T-bet重组腺病毒 (Ad T-bet) 后小鼠肺组织炎症改变明显减轻, 嗜酸性粒细胞及Th1型细胞因子数量明显下降[6]。且利用T-bet基因敲除小鼠可表现与哮喘相同的炎症表现及气道高反应。由此可见T-bet表达水平在哮喘的发病过程中起到重要的作用, 即表达升高时可逆转哮喘的炎症改变, 反之则利于炎症发展。
2 GATA-3与支气管哮喘
GATA-3是T细胞表达的C4锌指家族的多效性转录因子, 是T细胞发育中关键的调节因子, 特异性在Th细胞中表达[7]。研究证实, GATA-3控制Th2活性是通过诱导Th2细胞因子基因表达, 并且诱导Th0偏向Th2功能分化来实现的。研究还发现GATA-3选择性地在Th2细胞中表达, 用反义技术抑制GATA-3的表达, 可导致Th2细胞因子明显降低, 是目前唯一确定的能调控包括IL-4、IL-5、IL-13在内的所有关键性Th2型细胞因子合成的转录因子。逆转录病毒转导GATA-3至Thl细胞, 可以减少IFN-γ生成, 而诱导IL-4和IL-5的产生。所以认为GATA-3是反映Th2细胞释放细胞因子的准确而敏感的标志。
实验证实GATA-3可以通过激活IL-5基因的启动子促进IL-5的表达[8];另一方面, 在IL-4合成中GATA-3也是必需的, 且IL-4通过活化STAT6诱导GATA-3的表达[9]。但是, Th2细胞的发生在STAT-6缺陷的T淋巴细胞能够完全恢复, 表明转录因子GATA-3在Th2发育中, 起着主要的作用[10], 这也说明了GATA-3在Th2细胞发育过程中的特异性。
T-bet/GATA-3动态平衡在Th0细胞的分化方向中起到决定性作用, 因此T-bet/GATA-3比率较单一的测定T-bet或GATA-3的水平能更客观的反应Th1、Th2的分化和两种细胞因子的水平[11]。
3 临床前景
传统的治疗哮喘的方法为糖皮质激素, 俞海国等[12]研究中发现激素作用于哮喘小鼠后可使T-bet和GATA-3表达均下降, 但GATA-3下降更为明显, 表明激素在抑制Th2型炎性反应同时也抑制了Th1的表达。而由于使用长期激素的副作用也使其临床依从性降低, 但若我们从特异调控Th0分化上游的转录因子T-bet和GATA-3干预, 促使Thl/Th2细胞处于动态平衡, 则有可能是一种特异性更强、不良反应更小的方法。最近的研究表明应用GATA-3 RNAi、GATA-3反义寡核苷酸以及小分子盐酸盐 (YM341619) 等均能减少GATA-3的表达可明显改善小鼠的哮喘状态[13,14,15], 且向哮喘小鼠鼻内转染T-bet的病毒载体能增强Th1型免疫反应, 恢复Th1/Th2平衡[16]。
【关键词】急性创伤性脑损伤；核转录因子-KB；变化规律
【中图分类号】R364.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）22-0030-02
【摘要】目的：探讨急性创伤性脑损伤后核转录因子-KB（NF-KB）的表达变化规律。方法：本组实验采用Wistar大鼠进行实验，随机将80例大鼠分为假手术对照组（30例）与脑外伤损伤组（60例）。采用免疫组织化学法观察大鼠创伤性脑损伤后NF-KB表达的变化规律。结果：脑外伤损伤组的脑组织中神经损伤病变区域在损伤后6～120h阶段性时间内，NF-KB的表达明显增高，且与假手术对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：急性创伤性脑损伤后NF-KB表达显著增高，因此NF-KF的异常可能是导致继发性脑损伤的主要因素，可通过抑制NF-KB的表达从而实现防止继发性脑损伤的发生。
【关键词】急性创伤性脑损伤；核转录因子-KB；变化规律
【中图分类号】R364.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）22-0030-02
【摘要】目的：探讨急性创伤性脑损伤后核转录因子-KB（NF-KB）的表达变化规律。方法：本组实验采用Wistar大鼠进行实验，随机将80例大鼠分为假手术对照组（30例）与脑外伤损伤组（60例）。采用免疫组织化学法观察大鼠创伤性脑损伤后NF-KB表达的变化规律。结果：脑外伤损伤组的脑组织中神经损伤病变区域在损伤后6～120h阶段性时间内，NF-KB的表达明显增高，且与假手术对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：急性创伤性脑损伤后NF-KB表达显著增高，因此NF-KF的异常可能是导致继发性脑损伤的主要因素，可通过抑制NF-KB的表达从而实现防止继发性脑损伤的发生。
【关键词】急性创伤性脑损伤；核转录因子-KB；变化规律
1 CBF转录因子的发现
1997年Stockinger在研究拟南芥低温驯化期间如何调节COR基因表达的分子机理时, 利用酵母单杂交的方法, 从拟南芥cDNA文库中克隆出一段cDNA序列, 其编码一种转录因子, 编码产物能识别COR基因启动子区的CRT/DRE元件并与之结合, 命名为CBF1 (CRT/DRE binding factor 1) [1]。1998年Gilmour等又从冷处理后的拟南芥cDNA文库中鉴定出CBF2和CBF3[2]。由于CBF1～3基因除了具有抗寒作用外还具有抗旱能力, 所以它们又分别称为DREB1b、DREB1c、DREB1a[3], 2002年Haake在研究拟南芥抗旱时克隆了CBF4[4]。拟南芥基因组测序完成后, 又克隆了CBF5, CBF6[5]。
除了模式植物拟南芥之外, 还在油菜、小麦、黑麦、大麦、玉米、水稻、高羊茅、黑麦草等植株中分离到类似CBF基因。
2 CBF基因的特点
CBF转录激活因子属于AP2/EREBP类转录因子, 它是植物所特有的一类转录因子。其一级结构中含有AP2DNA结合域、碱性核定位信号区和酸性转录激活域。AP2/EREBP结合域是一个由大约60个氨基酸残基组成的非常保守的DNA结合区, 而且在其N-端部分存在一个碱性亲水区, 含有3个反平行的β-折叠, 这3个β-折叠在识别顺式作用元件中具有重要作用。
研究表明CBF1、CBF2、CBF3聚集在拟南芥4号染色体的短臂上, 与分子标记m600、PG11紧密连锁。而CBF4定位在5号染色体上。序列分析表明, CBF1、CBF2、CBF3基因的核酸序列具有较高的同源性, CBF1与CBF2、CBF3的同源性分别为81%和84%, CBF2和CBF3之间同源性为84%。CBF转录激活因子之间氨基酸序列的同源性均在85%以上。CBF4蛋白与其他3种CBF蛋白相比, 有63%的氨基酸相同。
CBF1、CBF2、CBF3基因受低温诱导而不依赖于ABA, CBF4基因能被干旱和ABA所诱导, 但不被低温诱导[6]。
3 CBF转录因子对COR (cold-regulated gene) 基因的表达调控
COR基因是冷诱导基因, 在它的启动子中含有CRT/DRE元件, CRT/DRE是一段DNA顺式作用元件, 核心序列为CCGAC。Jaglo-ottosen等在拟南芥中发现, COR基因包括COR6.6、COR15a、COR47及COR78四种[7]。进一步研究发现, 这4个COR基因分散分布在拟南芥基因组中, 它们既不与CBF基因连锁, 各自之间也不相互连锁。
当植物处于低温时, CBF基因表达, AP2基序与CRT/DRE元件结合, 从而激活COR基因表达, 提高了植物的抗寒能力。
4 CBF转录因子的表达
CBF基因的表达为低温特异诱导而不受ABA和脱水胁迫的调控。在正常生长温度下, 植物体内的CBF基因不表达, 几乎检测不到其转录物的存在。将拟南芥植株转移到低温环境中, 3个CBF基因的转录在15 min内明显提高, 在接下去的1～2 h继续提高, 2h后开始下降, 但在24 h内仍然保持着比正常温度下生长的植株中要高的水平。与拟南芥中的情况一样, 油菜、小麦、黑麦和番茄中类似CBF基因的转录也在经受低温胁迫后15～30 min内快速提高, 几小时内达到最高, 随后开始下降[8]。
CBF基因由于低温诱导的机制还不是很清楚, Gilmour等提出一种模型:正常温度下, 植物体内存在一种转录因子, 该转录因子能够识别CBF启动子, 并在低温下被激活。他们将此推测的转录因子命名为ICE (inducer of CBF expression, ICE) [9]。Chinnusamy等已经从拟南芥中得到ICE1基因序列, 将其连上CaMV35S启动子转入拟南芥, 获得了含ICE1的转基因拟南芥植株, 通过低温检测证实转基因拟南芥植株的抗冷性有很大的提高。同时还发现, ICE1基因突变后, 在低温诱导条件下CBF3的转录水平有明显的降低, 而对其它CBF基因的转录水平影响很小, 由此推测ICE1是一种上游调节蛋白, 能有效控制CBF3的转录, 但ICE1对CBF1和CBF2的表达作用不大。这说明, 在CBF基因家族中存在着表达机制上的差异, 而这差异主要存在于CBF基因家族的启动子中[10]。
ICE是在低温时诱导CBF基因家族表达的转录激活因子, 它是一个上游调控因子。ICE能够识别CBF基因启动子中的冷调控元件 (ICE盒) 。在常温下, ICE没有活性, 当植物经低温处理后, ICE被激活, 与CBF基因启动子中的ICE盒相结合, 诱导CBF基因的表达[11]。
Novillo等发现CBF2突变体在低温下CBF1和CBF3的表达量增加, 比野生型植株更能耐受低温, 表明CBF2对CBF1与CBF3的表达有负调控的作用[12]。
除ICE外, HOS1是另一个重要的上游调控因子, 在拟南芥中为组成型表达。HOS1基因编码一种含有环指状基序的蛋白, 常温时它定位于细胞质中, 但在低温胁迫下转移到核内, 调控CBF基因的表达。它的突变导致低温反应中CBF基因以及它们的下游COR基因的表达增强[13,14]。
5 CBF转录因子在提高植物抗寒性中的作用
拟南芥转基因植株中CBF转录激活因子的超表达导致许多生理生化变化, 包括编码产生LEA蛋白或亲水多肽, 脯氨酸和多种可溶性糖类的合成积累, 这些物质已被证明对植物的低温耐性起重要作用, 并且植物体内的这些变化在冷驯化过程中普遍发生。由此认为CBF转录因子是冷驯化反应途径中的“总开关”。CBF转录因子与CRT/DRE调控元件特异结合, 诱导启动子中具有这一调控元件的基因的表达, 促进这几类物质的合成与积累, 从而提高植物的抗寒性。超表达CBF转录激活因子除了能增加植物的抗寒性外, 也能增加植物的抗干旱和抗盐害的能力。
研究发现, 过量表达CBF1和CBF3的转基因拟南芥与对照相比不仅抗冻, 而且对干旱或盐害胁迫也具有一定抗性。甄伟等将CBF1转入油菜及烟草, 用电解质渗漏法分别检测其抗寒性, 结果显示转基因油菜的抗寒性较未转基因油菜有明显提高, 转基因烟草抗寒性也有一定的提高[15]。金万梅等将CBF1导入草莓中与对照相比提高了草莓对低温胁迫的抵抗力[16]。Hsieh等将带有CBF1基因, 35S启动子及nos终止子的表达载体导入西红柿, 结果发现转基因西红柿T1及T2代其抗寒性要比野生型植株高很多[17]。Ito等将OsCBF基因转入水稻后, Pro及可溶性糖的含量大大提高, 水稻的抗寒性、抗旱性、抗盐性都得到提高[18]。吴琰等在研究转CBF1基因地被石竹抗寒性时发现, 不同低温处理后, 其抗寒性也得到增强[19]。
6 结语
关键词：NF-κB,肾脏,缺血-再灌注损伤
近年来随着器官移植技术的不断进步, 人们对缺血-再灌注损伤 (Ischemia/Reperfusion Injury, IRI) 的发生机制有了进一步的认识。尽管IRI发生的确切机制尚未完全阐明, 但许多学说及理论在临床实践和科研实验中得到证实。在临床上多种疾病均可导致肾缺血-再灌注损伤 (renal Ischemia Reperfusion Injury, RIRI) , RIRI的发生机制也成为人们关注的焦点。最近, 国内外许多文献报道核转录因子κB (nuclear factor of kappa B, NF-κB) 与RIRI方面的新进展, 本文综述如下。
1 肾脏缺血-再灌注损伤研究现状
1.1 RIRI的原因及研究意义
在临床上凡是能引肾脏血流动力学改变的疾病, 例如严重感染、创伤、休克、新生儿窒息、肠梗阻、肠套叠、肺炎、挤压综合征、肾移植、肾切开取石术等均可导致RIRI。RIRI是一种常见且危及生命的严重并发症, 发生率为18%～27%[1], 病死率达35%[2]。因此, RIRI成为近年来研究工作的一个热点。
1.2 RIRI的机制
RIRI机制十分复杂, 目前普遍认为RIRI为缺血和再灌注两大时相多因素、多途径联合发挥作用的病理生理过程。缺血时相病理生理机制为组织缺氧能量代谢障碍;再灌注时相病理生理机制为氧自由基损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡和无复流现象[3]。
2 N F-κB在肾脏缺血-再灌注损伤
2.1 NF-κB简介
2.1.1 NF-κB的分子生物学属性
核转录因子κB为1986年Sen和Baltmore首次从成熟的B淋巴细胞核中提取, 是一种多功能的转录调节因子, 能和球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列 (5'-GGGACTTTCC-3') 特异结合[4], 其在炎症反应、免疫应答、细胞增殖生长分化、细胞周期和细胞凋亡中起重要调控作用。
据研究发现, NF-κB在机体各种组织细胞中呈二聚体形式广泛存在。由NF-κB家族和与其高度同源的Rel家族成员构成, 在哺乳动物中包括五个成员:NF-κB1 (p50和p105) 、NF-κB2 (p52和p100) 、RelA (p65) 、c-Rel、v-RelB[5]。各成员分别两两配对组成各种NF-κB转录因子[6]。各个成员蛋白质的氨基末端约有300个氨基酸残基构成的Rel同源区 (Rel homogeneous domain, RHD) 。该区主司NF-κB的二聚化、核定向易位、与DNA分子的特异结合。
2.1.2 NF-κB的激活与调控
NF-κB激活的机制较复杂, 目前未完全阐明。研究证实, NF-κB在细胞质中与NF-κB抑制性蛋白质 (inhibitory protein of NF-κB, IκB) 结合呈无活性形态存在, 在细胞核中与IκB解离呈活性形态存在。IκB借锚蛋白重复序列与NF-κB的RHD结合, 掩盖NF-κB的核定位序列 (nuclear localization sequence, NLS) , 使NF-κB呈无活性形态潴留于胞浆内。IκB家族成员包括:IκB-α/MAD-3、IκB-β、P105/IκB-γ、P100/IκB-δ、IκB-ε、Bcl-3等。IκB激酶 (IKK) 激活与IκB磷酸化是从NF-κB解离到最终降解最为关键的步骤。其可能机制为, 当细胞受到外界信号刺激时, NF-κB活化诱导信号先使IκB第32和36位点上的丝氨酸发生磷酸化[7], 其在第21和22位的赖氨酸位置上泛素化, 继而引发26S蛋白体使IκB迅速降解并从NF-κB/IκB复合体中释放出来, IκB失活。IKK可在IκB降解中发挥作用, 使NF-κB活性增强。Chen等[8]研究证实, IκB蛋白激酶-1、IκB蛋白激酶-2、NF-κB诱导型蛋白激酶 (NIK) 等参与IκB磷酸化及降解, 导致NF-κB激活, 从而促进相关基因的转录和表达。目前研究认为NF-κB的活化过程受到正负反馈2方面的精细调节。NF-κB的失活与激活是通过其在胞核和胞浆穿梭的动态平衡来实现[9]。
2.2 NF-κB在肾脏缺血-再灌注损伤中的作用机制
NF-κB在RIRI发生发展中起着重要的作用[10]。由于在多种病理活性物质, 如生长因子、细胞因子、转录因子、趋化因子、粘附分子、急性期蛋白、免疫受体、氧化应激相关酶等的可诱导基因基因启动子和增强子中均含有NF-κB的结合位点, NF-κB成为导致组织损伤的一个共同环节, 因而在免疫反应、炎症发应、细胞凋亡、IRI等病理生理改变过程中NF-κB都起着重要的调控作用。再灌注时相产生的过氧化物可激活NF-κB, 后者可诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18、IL-25、粘附分子、C反应蛋白纤溶活化因子-1、补体C33、MCP-1、GM-CSF等炎症介质的高度表达。同时, NF-κB激活后可以促使单核巨噬细胞增殖及活化[11], 从而诱导炎症反应参与RIRI发病。TNF-α相关炎症因子通过激活NF-κB导致TNF-α受体I表达而产生一系列炎症反应[12]。肾小球的系膜细胞, 肾小球脏层上皮细胞和游走进入肾脏的中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎症细胞可通过自分泌及旁分泌作用产生多种炎性介质作用于肾脏而发挥病理生理作用, 从而对RIRI发生与发展产生影响。国内学者孙艳玲等[13]研究证实, 肾缺血-再灌注2h后NF-κB被大量激活, 主要集中在肾小管上皮细胞内表达, 引起ICAM-1和TNF-α的表达, 导致肾组织损伤。而李开龙等[14]研究发现, NF-κB广泛存在于在IRI达1d的小鼠肾脏的肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞和由血循环浸入肾脏的炎症细胞中。
2.3 抗NF-κB与肾脏缺血-再灌注损伤治疗
RIRI是一个复杂的病理生理变化, NF-κB在其发生发展过程中发挥着重要的作用, 因而NF-κB成为RIRI治疗的一个切入点。目前主要的研究关注点在于通过干预NF-κB的分子生物学结构、激活途经及信号传导等环节, 从而治疗RIRI。国外有学者研究发现, 糖皮质激素类药物可与细胞质中受体结合, 从而可以抑制NF-κB与IκB序列特异性结合;另外其还通过激活IκB基因表达, 促进IκB表达, 诱导活化的NF-κB灭活[15]。环孢菌素A等免疫抑制剂能够与T细胞受体结合, 抑制蛋白酶体活性, 阻止IκBα的降解, 从而抑制T细胞内NF-κB的活化。维生素C、二硫代氨基甲酸吡咯烷、维生素E及其衍生物等抗氧化剂类药物能够阻止半胱氨酸发生氧化, 阻断IκB磷酸化, 从而抑制NF-κB活性。靶向IKKα的反义核酸, 能够阻止IKKα的合成, 阻碍IκB的磷酸化及降解过程, 从而抑制NF-κB活性。NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术阻断了NF-κB与DNA位点结合, 从而抑制了NF-κB的转录活性。此外, 一些中药如银杏叶提取物、绿茶提取物、葛根素、雷公藤、大黄、参附、黄芪和当归等对NF-κB活性也有调节作用。
3 展望
1 资料与方法
1.1 一般资料
佳木斯大学2007～2008年经手术治疗的胆脂瘤组织30例作为实验组。平均年龄39岁, 平均耳流脓史12.9年。同时取该组病人中20例的外耳道上皮组织作为对照组。所有组织标本均在手术切除后2h内收集, 经10%中性福尔马林溶液固定, 石蜡包埋, 做4μm连续切片, 免疫组织化学染色。胆脂瘤和外耳道上皮组织取自同一患者。胆脂瘤均经病理学确诊。
1.2 方法
1) 石蜡连续切片厚4μm, 贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上, 60℃烤箱过夜。2) 二甲苯脱蜡, 递减梯度酒精至水。3) 抗原修复, 于高压锅内放入适量PBS加热, 放入切片, 至喷气持续2min, 放气, 冷却至室温, 取出切片, PBS洗片3min 3次。4) 0.3%过氧化氢溶液室温封闭10min阻断内源性过氧化物酶活性, PBS洗片。5) 滴加一抗NF-κB p65, 37℃湿盒孵育1h, PBS洗片。6) 滴加二抗辣根酶标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体, 37℃湿盒孵育20min, PBS洗片。7) DAB显色:适当比例的DAB显色剂, 显微镜下观察, 显色3～5min, 出现棕黄色颗粒后, 以自来水充分冲洗终止显色。8) 苏木素轻度复染, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 显微镜观察。NF-κB浓度为1:100, 阴性对照以PBS替代一抗, 用己知阳性标本作阳性对照, 以上PBS洗片均为3min 3次。
1.3 结果判断
在光镜下观察, 阳性表达呈棕黄色颗粒。NF-κB在失活状态时存在于细胞浆, 被激活时快速易位进入核内, 故胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒者均为NF-κB表达阳性细胞。每张切片在400倍显微镜下NF-κB表达的代表部位随机取5个不重叠视野进行阳性细胞计数, 计数100个细胞, 计算阳性细胞所占比例。阴性 (-) :阳性细胞数<10%;弱阳性表达 (+) :阳性细胞数10%～25%;中等阳性表达 (++) :阳性细胞数25%～50%;强阳性表达 (+++) :阳性细胞数>50%。
1.4 统计学处理
应用SPSS16.0统计软件处理数据P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
1) 免疫组化染色显示NF-κB在胆脂瘤组织强阳性表达 (图l) 16例占80%, 分布于上皮全层, 阴性对照无着色, 说明无特异性染色;2) 正常外耳道皮肤组织为全层弱阳性表达 (图3) :其基质旁组织中的炎性细胞及血管内皮细胞亦可见散在阳性表达 (图2) ;3) 胆脂瘤组织的NF-κB阳性率高于正常外耳道皮肤组织 (P<0.05) 差异有统计学意义。见表1。
注:以上图片均为免疫组化×100
i2=10.31, P<0.05。
3 讨论
核转录因子KB (nuelearnartscriptionafetorkappaB, NF-κB) 也称为细胞核因子κB, 是由Sne和Baltimore于1986年首先在B细胞中发现的一种能结合于免疫球蛋白K轻链增强子B位点的核蛋白, 调控免疫球蛋白K轻链的转录, 故命名为核转录因子κB[1,2]。NF-κB广泛存在于真核生物中, 是一个由复杂的多肤亚单位组成的蛋白家族。NF-κB家族成员通常以同源二聚体或异源二聚体的形式与其抑制蛋白1κBs形成复合物, 以非活性形式存在于细胞质中, 只有在受到各种活化因素的作用, NF-κB才能被激活。NF-κB系统由NF-κB家族及其抑制物1κB家族共同组成。到目前为止在哺乳动物细胞中己发现的NF-κB家族成员有:NF-κBI (P50/105) 、NF-κB2 (P52/100) 、P65 (RelA) 、 ReLB和C-Rel五种。不同的NF-κB二聚体的转录激活特性不同, 结合的靶DNA也不同, 调控不同的基因表达, 这可能是NF一κB功能多样性的原因。NF-κB的主要形式为P50和P65组成的二聚体, 其中P50/P65发现最早, 分布和作用也最广泛, 通常所说的NF-κB即为P50/P65。P50是与DNA结合的部位, P65参与基因转录的起始调节, 并可促进P50与DNA结合, 当P65与细胞内抑制蛋白1KB结合, 可掩盖P50上核定位信号。本研究中, 我们采用免疫组化染色研究NF-κB在胆脂瘤中的表达, 结果显示NF-κB蛋白在胆脂瘤上皮全层均有表达, 表达强度显著高于正常皮肤组织, 胆脂瘤基质旁炎性组织中亦可见较多阳性细胞, 主要为炎性细胞及血管内皮细胞, 这一结果说明NF-κB蛋白在胆脂瘤中存在异常表达, 提示在胆脂瘤的炎性反应过程中, NF-κB可能起关键作用。其机理可能为:NF-κB通过调节相关细胞因子的表达, 间接促进细胞的增生;其次, 据报道NF-κB的活化可导致cychnDI的异常表达, 促进细胞通过G/S和G/M检测点, 刺激细胞增生[3], 说明NF-κB可直接调节细胞周期相关蛋白的表达, 促进细胞增生。但NF-κB对增殖的调控机制还十分复杂, 胆脂瘤型中耳炎的发病机制尚不清楚, 相信对其深入研究能对胆脂瘤型中耳炎的发病机制提供新的思路。
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【DREB转录因子研究进展】推荐阅读：
因子分析实例07-15
