肝炎病毒核酸检测
样本要求
1.适用标本类型：血清或血浆 2.标本采集
1）血清：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30—60min，血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5分钟，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管
2）血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA-2K或枸橼酸钠的玻璃管，立即颠倒玻璃管混合5—10次，使抗凝剂和静脉血充分混匀，5—10分钟后即可分离血浆，转移至1.5 ml灭菌离心管
3.标本保存与运送：所采集的标本可立即用于测试，也可以保存在—20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。检验方法
1.DNA提取（样品制备区）
将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品进行同步处理。1）取200μl样品，加入450μlDNA提取液I和4μl的内标溶液，用振荡器剧烈混匀15秒，瞬时离心数秒。100℃恒温处理10±1分钟 2）12000rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR反应管 3.加样（样品制备区）
往上述HBV反应管中用带滤芯吸嘴分别加入待测样本、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清液各20μl。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。
4.PCR扩增（扩增和产物分析区）5.结果分析
反应结束后自动保存结果，根据分析后的图像调节baseline值得Start值、End值以及Threshold值，点击Analysis自动获取分析结果，在Repoet界面查看结果，记录未知样本数值（C）6.质量控制
(1)阴性质控品：FAM通道无对数增长期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我站2011年7月~2014年12月的79089份无偿献血标本。用于核酸检测标本:带分离胶ED-TA-K2抗凝真空采血管 (5ml/管) ;用于酶免4项和ALT检测标本:EDTA-K2抗凝真空采血管 (5ml管) 。准确记录具体的采集样品编码、日期等基础信息, 所得到的标本通过离心处理后放至2℃~8℃冰箱内, 在72h内做ELISA法HBs Ag检测和HBV核酸检测。
1.2 仪器与试剂
Uranus AE200全自动酶免仪, HAMIL-TON STAR全自动加样仪, ABI7500荧光扩增仪, HBs Ag (ELISA) 检测试剂 (上海科华和珠海丽珠) , HBV/HCV/HIV三联核酸提取试剂和检测试剂 (上海科华) 。
1.3 检测方法
1.3.1 ELISA检测
在完成HBs Ag检测过程中给予所得到的每份献血标本2种ELISA试剂, 每批实验需具有空白对照组、室内质控、阳性, 阴性对照组。具体判定标准为:S/CO≥1 (阳性, 血液检测结果不符合标准) , S/CO<0.7 (阴性, 血液检测结果符合标准) , 0.7≤S/CO<1 (灰区, 血液检测结果不符合标准) 。
1.3.2 核酸检测
采用混样的方法检测核酸, 每份混样有8个标本且设定内对照及室内质控, 将混合测定呈阳性者予以拆分检测和将混合测定阴性判定为阴性, 当拆分测定呈阳性则判定为NAT阳性, 呈阴性则判定为NAT阴性。
2 结果
经血清学检测, 2种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的HBs Ag均呈阴性的79050份无偿献血标本进行核酸检测, 核酸检测呈阳性者12份, 检出率为0.015%。其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份;HBs Ag单试剂阳性的19份标本, 核酸检测呈阴性18份, 阳性1份;HBs Ag双试剂阳性的20份标本, 核酸检测呈阳性18份, 阴性2份。因本次研究未对所有单试剂阳性标本和双试剂阳性标本进行核酸检测, 因此未做HBs Ag (ELISA) 检测单试剂漏检率和核酸检测漏检率的统计与分析。
3 讨论
核酸检测技术先后被亚洲及欧美等20多个国家和地区作为筛查献血者血液的方法, 作为高度敏感、特异的筛查输血传染因子的检测方法主要针对的是HIV、HCV和HBV, 我国通过核酸方法检测HBV正逐渐被推广应用。有相关研究表明[6,7], 在献血者血液筛查中应用核酸检测技术能有效提高输血安全。同时也有相关研究资料发现, 经核酸检测能够缩短HIV、HBV、HCV的ELISA“窗口期”, 大幅度降低病毒经输血传播的风险。本文研究结果显示, 两种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的HBs Ag均呈阴性的79050份无偿献血标本, 经核酸检测呈阳性12份, 检出率为0.015%。其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份。由此可以看出, 乙肝“二对半”检测全阴性的3份标本是处于ELISA窗口期在核酸检查时被发现且有HBV感染现象;其余9份标本则属于HBV的隐匿性感染[8], 这进一步说明核酸检测对血液筛查具有重要的意义。另从HBs Ag单试剂阳性的19份标本, 核酸检测呈阴性者18份, 阳性者1份;HBs Ag双试剂阳性的20份标本, 核酸检测呈现阳性18份, 阴性2份的结果可以看出:使用HBV核酸检测方法和ELISA方法检测HBs Ag对无偿献血者进行血液筛查, 均存在单一方法或单试剂漏检情况, 尤其在病毒载量较低的情况下运用核酸筛查难以准确检测出。因此它不能完全替代ELISA, 只能作为其补充, 二者共同应用可提高检测准确性和血液安全性。此外, 在应用核酸检测时所使用的试剂要求具备高度特异性和灵敏性且实验环境比ELISA检测要求更为严格[9]。
综上所述, 应用核酸检测对献血者血液进行乙型肝炎病毒筛查, 不仅具有较高的敏感性, 能有效缩短ELISA方法检测HBs Ag的窗口期, 而且能有效降低隐匿性乙型肝炎病毒的输血传染风险, 但两者不能相互取代, 使用两种方法共同对无偿献血者进行血液筛查, 相互补充, 能够进一步提高血液的安全性。
摘要：选取采用两种酶联免疫法吸附试剂检测无偿献血标本的乙肝表面抗原 (HBs Ag) 均呈阴性的79050份进行核酸检测, 核酸检测结果呈阳性的标本进行乙肝“二对半”检测。此外, 选取HBs Ag单试剂阳性标本19份、双试剂阳性标本20份, 进行核酸检测。HBs Ag双试剂检测均呈阴性的79050份标本, 核酸检测呈阳性12份, 检出率为0.015%, 其中乙肝“二对半”检测全阴性3份, HBs Ab单独阳性1份, HBc Ab阳性8份;HBs Ag单试剂阳性19份标本, 核酸检测呈阴性18份, 阳性1份;HBs Ag双试剂阳性20份标本, 核酸检测呈现阳性18份, 阴性2份。应用核酸检测献血者乙型肝炎病毒有较高的敏感性, 能有效降低隐匿性乙型肝炎病毒的输血传染、缩短HBs Ag检测的窗口期, 一定程度上弥补了ELISA的局限性;另从HBs Ag单试剂阳性标本19份, 核酸检测呈现阴性18份, 阳性者的1份;HBs Ag双试剂阳性20份标本, 核酸检测呈阳性18份, 阴性2份的结果可以看出, 使用HBV核酸检测方法和ELISA方法检测HBs Ag对无偿献血者进行血液筛查, 均存在单一方法或单试剂漏检情况, 因此不能相互取代, 使用两种方法共同对无偿献血者进行血液筛查, 相互补充, 能够进一步提高血液的安全性。
关键词：献血者,乙肝炎病毒,核酸检测
参考文献
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【摘要】目的：了解检测慢性乙型肝炎乙肝病毒血清标志物的临床价值。方法：采用HBV-DNA定量和乙型免疫五項对我院118例慢性乙型肝炎患者进行检测，对检测结果进行统计学分析处理。结果：大三阳检出率最高为96.1%，其次为小三阳检出率为77.9%，再次为HBsAg（+）HBcAb（+），检出率为63.9%。其中大三阳的检出率与HBV-DNA的含量同其他乙型免疫五项模式相比，均有统计学意义（p<0.05）。结论：对慢性乙型肝炎患者采用HBV-DNA与乙型免疫五项模式检测，并分析其检测结果可为患者病情早期的诊断、治疗及预后判断提供有效的理论依据。
【关键词】乙肝病毒标志物；HBV-DNA；乙型免疫五项
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）06-0015-02
乙型肝炎自上世纪以来便成为严重威胁人类健康的世界性疾病，同时也是我国目前流行性最为广泛、危害性最严重的一种传染性疾病[1]。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测乙型免疫五项简便易行，为临床检查最常用方法。近年来随着分子生物学技术的发展及其在临床应用方面的推广，应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HBV病毒载量已成为目前临床诊断HBV感染的常用指标[2， 3]。本文对我院2014年1月至2015年6月就诊的118例慢性乙型肝炎患者均采用HBV-DNA定量与乙型免疫五项检测，对检测结果进行统计分析，以了解慢性乙型肝炎乙肝病毒血清标志物检测的临床价值。
1资料与方法
1.1一般资料
本组118例慢性乙型肝炎患者，其中男46例，女72例；年龄16～71岁，平均45.3岁。所有就诊病历均符合中华医学会肝脏病学分会与感染病学分会中慢性乙型肝炎的诊断标准。
1.2方法
所有受检者用一次性负压采血管取清晨空腹静脉血5ml，用真空保凝剂分离胶管分离血清，2h内送检。HBV-DNA采用FQ-PCR检测，按说明书从病人血清中提取HBV-DNA，再用PCR仪扩增，由电脑分析出结果，仪器为FQD-48A扩增仪，试剂由杭州艾康生物公司提供；乙型免疫五项检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，按说明书进行，仪器为KHBST360型酶标分析仪，试剂由上海科华有限公司提供。
1.3结果判定
HBV-DNA测定值小于1×103 Copies/ml为阴性，反之为阳性。HBsAg：S/CO小于1为阴性，反之为阳性；HBeAg：S/CO小于1为阴性，反之为阳性；抗-HBe：S/CO大于1为阴性，反之为阳性；抗-HBc：S/CO大于1为阴性，反之为阳性；抗-HBs：S/CO小于1为阴性，反之为阳性。
1.4统计学处理
采用SPSS软件统计分析处理，采用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
大三阳[HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）]的检出率最高为96.05%，其次为小三阳[HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）]检出率为59.55%， HBsAg（+）HBcAb（+）检出率为92.59%，详情见表1。其中大三阳的检出率与HBV-DNA的含量同其他乙型免疫五项相比，均有统计学意义（p<0.05），详情见表2。
3讨论
血清乙肝 5项标志物乙型免疫五项定性测定始于80年代中期，对乙肝的疾病诊断 、病程监测及疗效观察具有一定作用 。血液HBV-DNA拷贝数可真实反映HBV感染的状况 ，对感染HBV的判断更直接和重要 ，可用于判断血液中是否有病毒复制以及传染性[4-6] 。
HBV-DNA可直接灵敏、准确的反映乙肝病毒复制情况，对早期的诊断、治疗及预后提供了临床依据。HBV-DNA呈阳性，则说明HBV复制、有传染性。HBV-DNA Copies/ml越高则表明病毒复制越厉害，传染性越强[7， 8]。ELISA是我国临床用血HBsAg筛查指定的方法，试剂改进使ELISA法HBsAg检测灵敏度已达0.2 ng/ml甚至更高。2010年10月血液检测试剂改为孵育总时间不少于120 min的两步法后，国产试剂灵敏度又有明显提高。本文通过118例慢性乙型肝炎HBV-DNA定量和乙型免疫五项检测结果可知，HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）检出率最高为96.05%，HBV-DNA平均值（Copies/ml）为5.02×107，其次HBsAg（+）HBeAg（+）HBV-DNA检出率为92.59%，HBV-DNA平均值（Copies/ml）为3.51×107。说明这两种复制活跃，传染性较强。HBsAg（+）HBcAb（+）HBV-DNA检出率为7.89%，HBV-DNA平均值（Copies/ml）为4.25×104，HBsAb（+）HBcAb（+）HBV-DNA检出率为2.70%，HBV-DNA平均值（Copies/ml）为1.12×103，HBsAb（+）HBeAb（+）HBcAb（+）HBV-DNA检出率为7.72%，HBV-DNA平均值（Copies/ml）为2.12×103，说明这三种的传染性降低。结果表明HBeAg为反映HBV复制活跃的重要指标，HBeAg/抗HBe转换或HBeAg阴性时其病毒仍在复制，HBeAg不易形成与HBV前c区基因突变有关。
HBsAg为肝炎病毒的外壳部分，其不含病毒核酸成分，临床上HBsAg无法反映病毒的复制情况及传染性的程度，故临床上HBsAg为HBV感染的一项标志。临床上使得HBsAg检测结果出现错误性差异的因素主要如下：HBsAg浓度较低使其在检测时不易测出[5， 9]，造成漏检；HBsAg浓度过高，因出现钩状效应呈假阴性；乙肝病毒的S基因突变；HBsAg的表达因其他病毒的复制或重叠感染而受到抑制。
HBeAg是乙肝病毒核壳蛋白的分泌型，主要为前c区分泌性信号的一种随行物[10， 11]。HBeAg在因在血液中有较高的传染性指标，故采用HBeAg能更敏感、更准确的对其HBV复制进行评价。过去临床上认为乙肝患者出现HBsAb 阳性 、HBeAg阴转是HBV复制减弱 、传染性降低和预后良好的象征 ，但诸多研究表明 ，在HBsAg阴性的慢性乙肝患者中，部分患者临床HBeAg检测呈阴性 ，但HBV-DNA仍为阳性，HBV仍然在复制[12-14]。本实验中HBsAb（+）、HBeAg（-）患者91中有3例（3.30%）HBV-DNA检测为阳性，拷贝数在103Copies/ml左右，与其他报道一致[6， 12， 15]。所以HBsAb（+）出现和HBeAg阴转并不能作为HBV复制终止或者减弱的判断依据 ，相反 ，这种慢性乙肝更容易被忽视 ，给患者造若HBeAg转阴，HBeAb呈阳性则说明病毒复制能力降低，传染性能减弱，而非无传染性。
综上所述，对慢性乙型肝炎患者采用HBV-DNA与乙型免疫五项检测，并分析其检测结果可为患者病情早期的诊断、治疗及预后判断提供有效的理论依据。
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新冠病毒核酸检测流程及注意事项
检测流程:
注意事项:
核酸检测应知应会
【什么是核酸检测？】
【什么是抗体检测？】
【谁可以申请核酸检测，个人可以申请吗，费用是多少？】
【哪里可以进行核酸检测？】
【检测如何进行，检测过程中我有感染风险吗？】
【检测呈阳性意味着确诊吗？】
【检测前我需要准备什么】
新冠病毒核酸检测流程及注意事项
为满足社会各方和群众对新冠病毒核酸检测的需求，进一步落实“外防输入、内防反弹”的总要求，推进核酸检测“应检尽检、愿检尽检”的原则，XX县人民医院面向社会提供新冠病毒核酸检测服务，现将检测流程及注意事项告知如下:
检测流程:
1.请使用电子健康卡就诊;
2.感染楼一楼发热门诊开具检测单;
3.感染楼一楼东大厅检验窗口打印采集条码;
4.感染楼一楼西大厅采集咽拭子;
5.核酸检测一般于当天或第二天出结果。
注:因近日核酸检测人数较多，我院检验科力争在24小时内出具检测结果，如未在上述时间内查询到结果，还请您耐心等待，或拨打电话咨询。检验科咨询电话:XXXXXXXXXXX,XXXXXXXXXXX
注意事项:
1.在做核酸检测前2小时尽量避免进食，以免引起呕吐;
2.在采集口咽拭子时检测者头后仰，张口发出「啊」音，有助于暴露咽喉，但过程中会出现刺激性干咳、恶心、呕吐等症状，检测者可配合采集人员尽量放松、深呼吸;
3.请做好个人防护，注意手卫生，全程戴口罩，只有在核酸检测采样时才能取下口罩，采样完毕请立即戴好口罩;
4.为了您的安全，请自觉排队，尽量减少交谈，保持1米以上的距离;
5.前来检测人员需如实向医生提供自己的既往病史、流行病学史等，这将是后续诊疗的重要依据。
咨询电话:XXXXXXXXXXXX
检测地址:XX县人民医院感染楼一楼
核酸检测应知应会
【什么是核酸检测？】
即采集人体分泌物后，在实验室条件下，通过分析病毒的RNA基因序列，利用PCR扩增的方法进行检测，进行临床病原学的诊断。目前，核酸检测是及早确定病人是否感染病毒，早发现、早治疗最有效的检测方法。
【什么是抗体检测？】
血清抗体检测就是抽血检测人体对病毒的免疫反应，如果近期有感染新冠病毒，人体会及时产生抗体与病毒抗衡。抗体检测操作简单方便，适用于大量疑似病例、既往感染者和无症状感染者检测初步筛查。
【谁可以申请核酸检测，个人可以申请吗，费用是多少？】
可以。除国家规定的新冠肺炎确诊病例、出院病例、疑似病例、密切接触者等人群必须进行核酸检测外，建议有国内外疫区旅居史的居民或曾直接、间接与确诊、疑似病例短暂接触过的市民进行检测。有工作、就医需要的人员也可以自愿自费进行核酸检测。一般费用在150-200元左右。因疫情形势和地区不同，有的地区免费检测！
【哪里可以进行核酸检测？】
目前国内大部分省级、地级城市的三级医疗机构均可提供新冠病毒核酸检测及新冠病毒核酸抗体检测，具体可咨询当地医疗机构。
【检测如何进行，检测过程中我有感染风险吗？】
采样过程，医生会用一根像棉签一样的拭子去擦拭咽部及扁桃体、或是鼻腔周围的分泌物，只要“轻轻一抹”，快捷、无痛苦。医疗机构会针对检测区域消毒，医护人员会也进行手部消毒，避免交叉感染。一般来说，采样过程安全清洁，无需担心感染风险。
【检测呈阳性意味着确诊吗？】
目前核酸检测试剂的灵敏度和特异性还有限，可能出现假阳性或假阴性，一次检测阳性并不就是确诊。根据国家卫健委发布的诊疗方案，需要结合肺部CT诊断和临床症状才能确诊新冠肺炎。
【检测前我需要准备什么】
党政主要领导带头在先、靠前指挥，来到各村核酸检测现场，详细了解各村现场调度、样本采集、组织协调、后勤保障等情况，强调各采样点要严格落实防疫要求，强化现场个人防护工作的宣传、提醒，防止人员扎堆、聚集，做好人员分流，落实安全间隔、佩戴口罩等防疫措施，规范采样点工作流程，做好服务和秩序维护，确保全员核酸检测细致科学、安全有序进行。
各核酸检测采样现场，带队领导、镇村干部、志愿者、医护人员，严格按照分工和要求，积极开展“敲门行动”，组织群众有序排队，进行信息采集，落实好佩戴口罩、“一米线”等防疫措施，医护人员按照规范流程，消毒、取管、采样、封装，大家责任明确、各司其职，全力保障核酸检测工作安全有序开展。对于行动不便、年老体弱的人群对其进行上门服务，切实做到应做尽做，不漏一户，不漏一人。
一、4月12日，三更村区域核酸开展前，崖州区总工会四级调研员胡春和、党支部书记王艳昌、驻村第一书记李静川组织所有村工作人员、志愿者、联防队员等召开临时会议，根据三更村基本情况进行讨论后部署工作安排，分工明确，确保全员核酸不漏一人，顺利完成。
二、会后，我村所有工作人员立即布置好场地。
三、4月13日早上7点，由区总工会四级调研胡春和带领总工会工作人员一同协助三更村全面开展区域核酸工作。
四、崖州区纪委刘金红书记、政协副主席伍扶民视察三更村全民核酸检测，并指导工作。
1 材料与方法
1.1 材料
2010年1月1日-2010年8月1日本市各大医院传染科住院的433名手足口病患者的咽拭子标本。仪器:高速微型离心机 (杭州汇尔仪器设备有限公司) 、小型漩涡振荡器 (北京华尔博科技有限公司) 、全自动荧光定量PCR检测仪 (广州市炳阳生物科技有限公司-美国) , ClassⅡTypeA2生物安全柜 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) 。试剂:北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 ( 硅胶膜吸附法) 。
1.2 方法
标本保存:取患者的咽拭子标本和大便标本立即放-20℃保存。RNA提取:采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法) 。反应体系:RT-PCR反应液 19 μl、聚合酶1 μl、 逆转录酶0.35 μl、 标本RNA 5 μl。设置循环条件:逆转录及变性50℃ 30 min;95℃ 3 min;预扩增95℃ 15 s, 50℃ 30 s;72℃ 1 min。扩增及荧光收集95℃ 10 s, 55℃ 40 s。
1.3 结果判断
阴性质控品:扩增曲线无对数增长期或无Ct值显示;阳性质控品:扩增曲线有明显对数增长期, 且Ct<30;表示实验有效。如果检测样品的扩增曲线无对数增长期或Ct>37, 判断样品为阴性;如果检测样品Ct≤37, 且曲线有明显的对数增长期, 判断样品为阳性。
2 结果与讨论
用荧光PCR法对433份咽拭子标本进行肠道病毒核酸检测, 结果有253例呈肠道病毒核酸阳性, 阳性率为58.4% (253/433) 。在253肠道病毒核酸阳性病例中经分型检测, EV71型为146例, Cox.A16型为107例, 未见有混合感染。手足口病是以手掌、脚掌、口腔黏膜上发生疱疹和溃疡为特征的一种病毒感染性疾病, 但有些患者没有典型病症, 病情发展很快。因此及时检出和发现患者是否感染EV71和Cox.A16, 可为临床提供实验诊断依据。而常规诊断方法存在一些弊端, 如病毒分离培养对技术要求较高, 费用较昂贵, 耗时需要4~15 d, 而且各实验室分离的阳性率各不相同, 无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要;中和抗体检测常需比较患者急性期血清与恢复期血清的中和抗体滴度, 有时仅靠检测单份血清的中和抗体滴度很难做出诊断;RT-PCR技术虽然克服了以上缺点[2], 已成为快速诊断的重要手段, 但PCR后需要进行凝胶电泳分析, 操作也较繁琐。今年年初本市手足口病又有抬头趋势, 为了及时控制疫情笔者采用实时荧光定量PCR法对433例可疑患者做了EV71和CA16检测, 为及时控制疫情发挥了作用。本文使用的实时荧光定量PCR法操作简单快速, 整个操作只需两步, 不到3 h, 即可获得高质量的数据;具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点, 该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
关键词：荧光PCR,手足口病,肠道病毒
参考文献
[1]金奇.医学分子病毒学〔M〕.北京:科学出版社, 2000:606-613.
到2009年10月底为止,我国已报告HIV(艾滋病病毒)感染者和艾滋病病人近32万,全国31个省(自治区、直辖市)均已发现感染者,据估计目前存活HIV感染者和病人约74万。艾滋病在我国正处于快速增长期,传播途径从以吸毒为主转变为以性传播为主,性传播占比已超过50%,这意味着艾滋病从高危人群向一般人群传播的速度在加快。
值得关注的是,男男同性恋人群的HIV感染率正在快速上升。我们对北京、沈阳等地的男男同性恋人群调查发现,该人群中高达21%的人曾经献过血。在我们调查的3719人中,发现253名HIV感染者,感染率是6.8%;我们对尚未感染的3000多名男男同性恋者每6~8周进行一次随访检测,在14个月的观察期中,发现有75名新发HIV感染者,这其中有15名是抗体检测阴性而核酸检测阳性被发现的。
HIV进入人体后通常经历一过性的高水平病毒复制,可以出现类似感冒的症状,此时病毒复制水平高,传染能力强。随后在机体免疫应答的控制下,病毒下降到较低水平,此后经过8~10年的临床潜伏期,HIV逐渐把感染者体内的免疫细胞破坏殆尽,感染者进入艾滋病发病期。此时,病毒复制水平再次上升,出现机会性感染、肿瘤等最终死亡。
HIV感染以后,可以通过一系列检测被发现。感染者体内最早被检测到的是病毒核酸,且病毒血症呈一过性高水平,此后水平有所下降但始终存在;P24抗原出现早于抗体,但呈现一过性;IgM类抗体早于IgG类抗体,此后整个病程中抗体始终呈现阳性反应。
目前国内外针对抗体检测的试剂已经先后推出4代,其中三代试剂可以同时检测IgM和IgG类抗体,四代试剂可以同时检测P24抗原、IgM和IgG类抗体,“窗口期”已经缩短至不足3周,但这仍然不是HIV感染后最早的蛛丝马迹。
国内外研究已经证明,核酸检测可以比三代试剂的“窗口期”缩短大约11天,比四代试剂“窗口期”缩短5天左右。有研究报告,一些国家较早开展NAT的核酸检测后,对血液安全起到了重要作用。
我国政府高度重视血液安全工作,已经采取了一系列措施加强血液监管力度确保血液安全。但是由于我国艾滋病流行特点以及高危人群献血比例等因素,经血传播艾滋病的风险依然存在。因而尽快开展核酸检测,降低HIV经血传播的残余风险,就能为百姓安全用血提供强有力的保障。
(据《健康报》文/中华医学会检验分会主任委员、卫生部艾滋病专家咨询委员会委员 尚 红 )
延伸阅读
核酸检测(NAT)技术平台知识要点
◎ 混合样本检测问题
目前绝大部分商品化NAT平台(包括全部国产试剂)均为混合样本检测模式。而优化的小样本混合检测模式,能够确保每一份NAT阳性报告均经过初筛和拆分复检两次确认。这样做能有效避免因假阳性造成的血液浪费。通常由于血小板假阳性造成的损失更为严重。另一方面,还能有效保护献血者。因为按照国际惯例,NAT阳性的献血者将被排除在合格献血者人群外,意味着NAT假阳性会造成本应合格的献血者流失。
◎ HIV-2 覆盖问题
目前国家强制要求血站现有常规酶免测试项目必须包括HIV-2型。因为伴随各种国际交流与合作越来越频繁,HIV-2的感染风险已逐渐增加,将HIV-2检测纳入NAT平台很有必要。
◎ HBV(乙肝病毒)漏检问题
亚洲为HBV高流行区域,从实际血液样本中检出HBV阳性样本的能力对于NAT技术至关重要,过硬的NAT技术将能够大大降低漏检的机会。
◎ 临床应用经验问题
目前市面上有几家NAT平台,但其前期临床应用的情况差异巨大,有的只做过数量有限的注册临床试验,而有的则已借助地方支持尝试做了大量常规样本筛查。而选择合适的NAT平台,有利于保障NAT试点评估工作顺利开展,得到的结果科学、准确,有助于帮助政府部门决策。
河南省人民医院公共卫生医学中心主任康谊介绍，核酸检测是一种“进行时”检测，通过聚合酶链反应来检测病毒基因组中特定的核酸序列，从而判断被检查者此刻是否感染了病毒。康谊说，核酸检测阴性也不能保证接下来不会传染新冠病毒。目前来看，各地基本上将有效期设定为7天。
1月21日下午，在河南省胸科医院咽拭子采集室，小高拿着单子正在排队。“父亲生病住院，我来陪护，所以做个核酸检测。”小高说。“目前，每天的检测量大概是200至300人次，主要是住院患者和陪护人员。”该院相关人士介绍。而郑大三附院每天的检测量大约是1000人次。郑大二附院是400至500人次。
核酸检测一次费用多少钱?
记者走访后得知，大多数医院的检测费是80元，也有部分医院是99元。
“从去年到现在，检测费用降了有几次，只要我们采购时的试剂费用下降，我们的检测费用也会随之下降。”郑大三附院副院长赵鑫说，之前，该院的检测费是98元，从1月22日开始，这个费用变成80元。
检测需求增加后，医院能接招吗?
根据国家公布的最新要求，今年春节，确实需要返乡的人员需要持7日内核酸阴性证明。面对有可能大幅增加的检测人群，医院怎么应对?
“我们刚引进了两台核酸提取仪，同时也对300名医护人员进行了核酸采集培训，一旦来院检测的人数大增，我们会立即启动预案。”赵鑫说，当所有机器启动时，一天的检测能力可达到2万份。
为了简化核酸检测流程，缩短检测时间，减少人群聚集，避免交叉感染，即日起，河南省人民医院线上核酸检测自助申请功能正式开通，如果有需求，通过该院的官方微信“河南福音省医”或“河南省人民医院”便可直接进行线上预约。
提取咽拭子后，一般多久出结果?“一般4至6小时即可。”赵鑫说。在省人民医院，中午12点前采集的核酸标本下午5点左右可以查询，下午6点前采集的核酸标本晚上10点左右可以查询检测结果。
打了新冠疫苗，还需要核酸检测吗?
最近一段时间，河南各地都正在有序地给重点人群接种疫苗。
38岁的刘先生在郑州一家超市工作，经常需要接触冷冻食品，1月初接种了新冠疫苗的他问：像我这种已经接种过新冠疫苗的，如果春节回老家，还需要核酸检测吗?
“接种疫苗可以在一定程度上降低感染风险，但任何疫苗的保护效果都不能达到100%，所以仍应配合相关部门进行核酸检测。”河南省疾控中心免疫规划所实验室主管技师刘倩说，从整个人群来说，目前接种疫苗的人还是少数，人群免疫屏障尚未建立，所以，这些人仍需做好戴口罩、勤洗手等防护措施。
海运冷链进口要不要核酸检测?怎么检?多少钱?要多久?
新冠疫情全球肆虐，病毒变异带来的挑战更为严峻。中国政府采取的一整套严密防控措施，事实证明高效管用。
目前，以冷藏箱方式进口的冷冻商品通关情况如何?睿库研究中心以微信文字、语音进行了访谈式调研，相关情况汇总如下，以飨读者。
Q：目前海运冷链进口主要集中在哪些口岸?
A：主要为天津、青岛、上海、厦门、广州、深圳、宁波、大连等口岸。
Q：是否所有冷链进口货物票票(箱箱)都需要进行核酸检测?
A：海关仅对进口冷冻海产品箱箱实施消毒及核酸检测，其他冷冻品，如牛肉，海关实施检疫检查的比例为20%-30%，其中进行核酸检测的为5%左右。
Q：不需要进行核酸检测的，从货物抵港到海关放行需要多少时间?
A：分两种情况，一是经单证审核径予放行的，大部分口岸不到半天;二是需要进行消毒处理的，3天左右。上海口岸表现优异，第一种情况不到1小时，第二种情况为1-2天。而同样的第二种情况，青岛口岸需要10-15天(评注：差异如此之大，原因何在?)。
Q：海关进行核酸检测的，从货物抵港到海关放行需要多少时间?
A：大多数口岸需要20来天。宁波、广州、深圳口岸表现优异，不到10天。
Q：不同口岸的通关速度相差10天，是什么原因?
A：不太清楚，估计和不同口岸的进口量、海关人手配备、仓库场地及配套处理设施等多方面因素相关联。
Q：海关放行的冷链进口商品是否可以直接投放市场?
A：不可以。所有的进口冷链产品，即便海关放行，仍需要由地方政府指定的第三方机构进行核酸检测，检测合格的方可投放市场。
Q：就是说，有一部分是海关核酸检测后，第三方还要重复进行一次 ?这项工作需要多长时间?
A：是的，有一部分需要重复进行两次核酸检测。口岸第三方检测的时间快的1-2天， 慢的4-5天。时间长短主要取决于是否集中到货以及疏运速度、冷库库位，检测能力等因素。
Q：第三方实施消毒、检测的收费标准如何?
A：下面的两个表分别是厦门口岸某第三方核酸检测和消毒的收费标准：
不同口岸以及同一口岸不同公司的收费标准有所差异，但大致上一个40尺集装箱进行消毒、检测产生的直接和间接(包括进仓、出仓、过板、搬运、处置等)费用总计5000元左右。
Q：第三方实施的消毒、检测费用由货主还是地方政府承担?
A：绝大部分口岸由货主承担，但厦门对本口岸市场销售的进口水产品的消毒、检测费用，由地方政府承担。
Q：这部分进口商品发生冷藏箱滞期的情况如何?
A：船公司的冷藏箱免费使用一般为4天，也有的给7天，实施核酸检测的箱子基本都会发生滞箱费，而且时间还都比较长。
Q：出现滞期后的费用增加多少?
A：以地中海航运(MSC)为例，如果进口商申请获得7天的免费用柜期，货物抵港到空柜还回总共花了30天，则发生的滞箱费为2万4千多元。
Q：除了滞箱费，还有其他费用吗?
A：是的，冷柜无论是在码头还是到冷库都会产生电费及冷箱堆存费，其中电费至少200元/天以上。
Q：进口企业的期望是什么?
A：企业对海关、地方政府采取严格管控措施十分理解，并愿意积极配合，同时有以下两点期望：
1)海关已经实施消毒、核酸检测没有问题的，检测结果可否和当地疫情管控部门进行分享，避免重复消毒，重复检测，一是可以降低成本，二是可以加快货物投入市场的时间;
2)各口岸的通关时间差异还是不小，希望耗时较长的口岸能在严格管控措施的前提下，继续努力想办法提高速度，尽量减少滞箱时间。
北京公立医院核酸检测自费多少钱
答：全市公立医疗机构核酸检测价格为120元，根据疫情需要，按照技术要求和标准实施混合检测时，5个样本混合检测，收费标准为每人次40元;10个样本混合检测，收费标准为每人次30元。
核酸检测原理
新型冠状病毒核酸检测原理
核酸检测多久出结果
最快3-4小时出结果。
目前我国广泛采用的是实时定量PCR的方法检测新冠病毒特异性的核酸片段，检测时，医生会用一个像棉签一样的拭子去擦拭扁桃体和咽隐窝附近的分泌物，也可以通过鼻腔取鼻咽后部的分泌物，然后放到试管里，再交给检验部门做相应的病毒核酸检测。经过取样、留样、保存、核酸提取、上机检测等五个步骤完成核酸检测。
而医院的检测通常是上午统一上机，到统一出结果差不多5个小时，也就到了下午，然后统一上报，不会随到随检，所以下午或晚上所送的标本是第2天做，有的医院自己不具备实验室条件，不能做，需送到上一级实验室做，保守估计时间是1-2天。
但随着现在检验的各方面效率提高，新冠检测的时间也有所缩短，有一些比较危重的、需要急诊手术，针对单个标本快速出结果，也可能在3-4小时之内出结果，需要具体情况具体对待。
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做核酸检测要多久
检测过程很快，大约几秒钟即可。
目前核酸检测包括口咽部咽拭子采样、鼻咽部咽拭子采样和肛拭子采样，前两者检测时所耗费的时间都不长，目前肛拭子还是主要运用在隔离点，重点人群的检测中。
如在采集口咽拭子时检测者需头后仰，张口发出“啊”音，有助于暴露咽喉，只要被检测者能够积极配合，几秒钟左右就可以，但过程中可能会刺激咽喉部出现刺激性干咳、恶心、呕吐等症状，采集完以后可使用免洗手消毒液或免洗酒精擦拭双手，然后戴上口罩离开采集地点。
但做核酸检测为统一人群进行，一般排队等待的时间较长，注意采样前30分钟不应吸烟、喝酒、咀嚼口香糖等，人与人之间保持1米以上距离，不要相互交流。
核酸检测前需要注意什么
每次核酸检查之前患者需要先用清水漱口，核酸检测不受饮食的限制，随时是可以检查的。
患者需要跟医生密切配合，取标本时需要张大嘴，发出啊的声音，充分暴露咽喉深部，从咽喉深部或是扁桃体部位采取标本。目前主要用于新冠病毒肺炎的筛查，这种检查适合所有的人群，属于无创伤性的检查，患者容易接受，取样本时可以出现轻微的干呕，样本取完以后会逐渐好转，是不需要特殊处理的。
核酸检测一次阴性是不能完全排除感染的，如果有临床症状，需要反复检查核酸，结合影像学的检查及临床症状是可以确诊的。
对于采集过程中可能出现的鼻咽部酸痒感，从而刺激咳嗽、打喷嚏等，被采集者可立即用纸巾(提前备好)或手肘遮挡。而在采样后，应该立即离开采集地点，避免在采集地点周围吐痰、呕吐。
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核酸检测原理
所有生物都含有核酸，核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物。新型冠状病毒出现后，我国科学家在极短的时间里完成了对新型冠状病毒全基因组序列的解析，并通过与其它物种的基因组序列对比，发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中，如果能在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列，应提示该患者可能被新型冠状病毒感染。
新型冠状病毒核酸检测原理
检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR(聚合酶链式反应)。因PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，应将新型冠状病毒核酸(RNA)逆转录为DNA。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高， Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。
我侵入人体以后，主要在肝细胞内繁殖，造成肝脏的急性炎症性损害，引起发热，乏力，尿黄，皮肤、黏膜、眼睛发黄（也就是黄疸）等。大多数人患病后，经过急性阶段，症状会漸渐减轻，直至恢复。有少数患者在我的强力攻势下，可表现为黄疸进行性加重，出现食欲减退、频繁恶心、呕吐、腹胀等重症肝炎表现，尤其是孕妇患上重症戊型肝炎后病死率高达20%。在我未被人类认识之前，可谓又风光又自在。
1983年，有位外国学者用一名肝炎患者的粪便，经筛洗后在免疫电子显微镜中，发现了我。我的外观呈球形，直径仅27～28纳米。
我喜欢在亚洲、非洲和拉丁美洲的一些国家旅游，尤其是在雨季和洪水以后，更是我兴风作浪的好机会，不论男女老幼均可受到我的侵袭。我曾有在印度、尼泊尔、阿富汗、印度尼西亚、日本和中国造成流行和暴发流行的“史绩”，给人类带来不少的灾难。
我进入人体的主要方式与我的大哥——甲型肝炎病毒相似，是经粪-口途径传播，具体方式有:
1．日常生活中接触传播 这种方式主要是通过被我污染的手和物品，直接与口接触而传播。
2．水的传播 我可以通过人类的粪便排出体外，一旦有机会便污染水源，导致同一地区较短时间内发生暴发流行。
3．食物传播 食用被我污染的食物，特别是未经煮熟就吃的新鲜蔬菜、水果或贝壳类食物，使进食者在较短的时间内发病。
4．媒介传播 苍蝇和蟑螂可充当我的帮凶——传播媒介，通过它们污染食物，造成感染和传播。
1 资料与方法
1.1 一般资料
抽取疑为HCV感染的门诊及住院患者血清标本77份，男34份，女33份，年龄15～63岁，平均40.5岁;纳入标准:(1)经临床检查确诊;(2)实验室检查丙型肝炎病毒抗-HCV阳性的患者。排除标准:(1)甲、丁、戊型肝炎病毒混合感染;(2)其他疾病引起的肝脏损害。采血半小时内分离出血浆，一部分当日进行HCV-RNA和HCV-Ab检测，其余于-20℃冰箱保存用于HCVc Ag检测。
1.2 试剂和方法
HCV-Ag检测采用景达基因有限公司的HCV-Ag试剂盒;HCV-RNA检测采用匹基生物工程股份有限公司的HCV-RNA荧光定量检测试剂盒;抗-HCV检测采用英科新创科技有限公司的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒;HCV质控血清由卫生部临床检验中心提供。使用BAY-ER1650全自动生化分析仪，Opticon Monitocr2TM荧光定量PCR扩增仪，酶标仪Dragen MK3。HCV-Ab和HCV-cAg检测采用ELISA法，HCV-Ag检测设空白对照一孔，阴性对照、阳性对照各两孔，样本稀释液100μl/孔，待测标本100μl,37℃孵育90 min，洗板6次;加酶结合物200μl,37℃孵育30 min;再洗板6次，加显色剂200L，室温闭光30 min，终止;492 nm(参考波长630 nm)读板，Cut oof=NCx+01040。HCV-RNA采用RT-PCR法、检测严格按说明书要求进行。结果判断:≥1.0×106IU/L为阳性，<1.0×106IU/L为阴性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0分析软件对收集到的数据进行处理，观察和统计数据用均值±标准差表示，用t和χ2检验进行组间显著性分析P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1
HCV-RNA、HCV-Ag、抗HCV检测结果见表1。
2.2
三法阳性率(含假阴性)占总样本的比率，HCV-RNA PCR、HCV-Ag、抗-HCV阳性率分别为42.86%、44.16%、38.96%;同HCV-RNA检测结果比较，HCV-Ag及抗-HCV检测的符合率。HCV-Ag检测符合率90.91%(70/77)、假阳性率3.90%(3/77)、假阴性率5.19%(4/77);抗-HCV检测符合率84.42%(65/77)、假阳性率6.49%(5/77)、假阴性率9.09%(7/77)。
3 讨论
丙肝与肝硬化、肝癌等发生、发展显著相关，HCV在体内复制活跃，传染性强，临床症状不典型，缺乏特异性的治疗方法，尽早开始治疗有可能中止或延缓病变发展，改善患者预后，早期诊断、及时阻断HCV传播非常重要[2]。HCV-Ag、抗-HCV和HCV-RNA联合检测为HCV感染诊断的主要指标，HCV-Ag为丙型肝炎早期感染的标志，患者外周血中HCV-Ag与HCVRNA水平具有良好的相关性[3]，可作为丙型肝炎病毒复制的标志，具有高度敏感性及特异性，早期检测HCV-Ag可克服抗-HCV筛选的局限性，适用血清抗体阳转前的抗原检查，也可明显缩短HCV感染的检测窗口期[3]，利于丙型肝炎的早期诊断，减少因输血传播丙肝的发生率，同时总HCV-Ag检测可用于监控慢性丙肝患者体内病毒载量，评价抗HCV治疗效果。
ELISA法检测HCV抗体为临床最常用手段，部分患者HCVAb检测阴性而HCV-Ag阳性，经PCR检测HCV-RNA阳性，可能与患者免疫功能抑制、处于抗体检测窗口期或尚未产生HCV-Ab等有关。HCV-Ag测定和HCV-RNA PCR都能将HCV窗口期平均缩短至36 d[4],HCV-RNA PCR检测对操作要求、设备条件、工作环境要求较高，易交叉污染导致假阳性偏高;ELISA法检测HCV-Ag简捷、价廉，设备简单，适合大规模筛查和多数基层医院，与HCV-RNA PCR检测相比具有优越性。HCV-Ag检测假阴性可能与检测抗原反应系统不稳定、抽样误差、抗原出现较早与抗体结合而检测不出、恢复期患者抗原消失而抗体仍存在等因素有关。
参考文献
[1]Krajden M,Shivji R,Gunadasa K,et al.Evaluation of the core anti-gen assay as a second-line supplemental test for diagnosis of active hepatitis Cvirus infection.J Clin Microbiol,2004,42(9):4054-4509.
[2]朱灵.丙型肝炎病毒感染的研究进展.检验医学与临床,2008,5(15):939-941.
[3]洪俊,饶永彩.HCV核心抗原测定用于丙型肝炎早期诊断临床价值的评估.临床检验杂志,2005,23(2):133.
