细胞毒性检测方法（共10篇）
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法
实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：
1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；
3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；
5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；
6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：
1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板
4.二氧化碳培养箱
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四、方法及步骤：
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。
5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
五、实验注意事项：
·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。
·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。
·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。
·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。
六、经验总结及分享：
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括
1、种板数；
2、种板后细胞的贴壁生长时间；
3、加药后的孵育时间；
4、cck8试剂加入量；
5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
补充
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 检验样品
医用注射器活塞及其ZI-400洗液由广州禾亿硅橡胶有限公司提供,样品处理方法按检验标准相应处理。
1.1.2 试验所需仪器和材料
生物安全柜(美国Nuaire公司,型号:Nu-425-400E),二氧化碳培养箱(美国Nuaire公司,型号:Nu-4750E),小鼠成纤维细胞L-929(中国科学院上海生命科学研究院细胞库),连续波长酶标仪(美国Molecular Devices公司,型号:Versa Max),RPMI 1640培养基(GIBCO试剂公司),小牛血清(杭州四季青公司),胰酶及其它细胞培养所需耗材(广州标迈生物有限公司),高密度聚乙烯(Sigma公司,批号:04306CH),MTT(Sigma公司,批号:08797HJ)。
1.2 试验方法
按我国卫生部提出的生物学评价试验选择指南及样品提供方的意见,选择基本生物学评价中体外细胞毒性试验(GB/T 16886.5-2003)进行检测[2]。细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境,检测生物医用材料及制品或其浸提液对细胞溶解(细胞死亡)、抑制细胞生长和其他毒性作用的方法。在GB/T16886.5-2003中分为浸提液方式法、直接接触法和间接接触法三种,而目前绝大多数医疗器械及材料通过浸提液来进行检测。浸提液检测可通过显微镜观察法进行定性,MTT检测法进行定量[3]。
(1)医用注射器活塞(经洗液处理过和未经洗液处理过)浸提液试验显微镜观察法
试验分阴性组(取高密度聚乙烯适量,按0.2 g/m加入含血清培养基,37℃浸提24 h,0.22 mm孔径过滤除菌备用);阳性组(取苯酚用含血清培养基配制成浓度为64g/l的溶液备用);供试品100%浸提液组(取样品适量,按0.2g/ml加入含血清培养基,37oC浸提24 h,0.22mm孔径过滤除菌得试验液);供试品50%浸提液组共四组。L-929细胞培养至汇合期,胰酶消化后吹散制成浓度为1*105个/ml的细胞悬液,取制悬细胞点板于6孔细胞培养板,每组点3孔,2 ml/孔,37oC、5%CO2浓度培养约24 h至近汇合期,弃培养液加入各组溶液继续培养48 h,终止培养;倒置显微镜下观察,按标准根据表1评分定出材料毒性级别。
(2)医用注射器活塞(经洗液处理过和未经洗液处理过)浸提液试验MTT检测法
MTT是一种淡黄色唑氮盐。1983年,Mosroann根据活细胞在能量代谢中线粒体内琥珀酸脱氢酶将MTT还原产生甲瓒,而在毒性环境中琥珀酸脱氢酶活性会降低的原理,利用MTT比色分析法测定细胞的活性和代谢功能[4]。该方法简便、灵敏,广泛用于细胞毒性定性检测。
L-929细胞培养至汇合期,胰酶消化后吹散制成浓度为1*104个/ml的细胞悬液,用微量移液器以100 ml/孔置于96孔板中,复种6孔96孔板边缘孔全部加入无菌PBS填充,在5%CO2、37oC的标准环境下以含10%小牛血清的RPMI1640培养液孵育,24h后换液。空白对照用新鲜1640培养液交换。阴性对照用高密度聚乙烯含血清培养基浸提液(取高密度聚乙烯适量,按0.2 g/ml加入含血清培养基,37oC浸提24 h,0.22 mm孔径过滤除菌备用)交换,阳性对照用天然乳胶含血清培养基浸提液(取天然乳胶适量,按0.2g/ml加入含血清培养基,37℃浸提24h,0.22 mm孔径过滤除菌备用)交换。试验组分别用体积分数100%、50%(即按1:1用含血清培养液稀释)的样品浸提液每孔100 ml交换,置于培养箱中继续培养。48h后每孔加入20 ml 5 mg/ml MTT溶液,继续培养5 h,小心吸去孔内液体,每孔加入200 ml二甲基亚砜(DMSO),慢速振荡10 min,用连续波长酶标仪570 nm波长处检测OD值,取六孔平均值。按下列公式计算相对增殖率(relative growth rate,RGR,RGR=实验组OD值/空白对照组OD值×100%)。根据RGR值,按表2评分定出材料的毒性级别。
(3)医用注射器活塞ZI-400洗液细胞毒性试验显微镜观察法
含血清培养基改为正常浓度3倍的浓缩培养基,供试品处理方法为:将ZT-400洗液用无菌PBS缓冲液按3:10 0稀释(该比例为厂家提供的该洗液最终用于清洗该医用注射器活塞的终浓度),稀释液作为供试溶液,供试品100%溶液组为每孔加入667 ml浓缩培养基+1333ml稀释液、供试品50%溶液组为每孔加入667 ml浓缩培养基+666 ml稀释液+666 ml PBS缓冲液;其它按医用注射器活塞浸提液试验显微镜观察法操作。
2 结果与讨论
2.1 显微镜形态学观察
培养48 h后,在倒置显微镜下观察细胞形态,结果发现:(1)厂家所送经ZI-400洗液清洗干燥后的活塞所制备的浸提液(100%和50%)所处理培养的细胞圆缩,基本不贴壁,基本死亡,细胞层几乎被完全破坏,按标准判断为3分,呈重度细胞毒性;阴性对照组细胞形态正常,贴壁生长良好,细胞基本上呈梭形或不规则三角形的典型形态,与正常细胞形态相似;阳性对照组细胞基本全部死亡,细胞层被完全破坏,死亡细胞被溶液粘贴在培养板底。(2)厂家所送ZI-400洗液为样品(100%和50%)进行的细胞试验中,样品组细胞圆缩,基本全部死亡,细胞层被完全破坏,按标准判断为3分,呈重度细胞毒性;阴性对照组细胞形态正常,贴壁生长良好,细胞基本上呈梭形或不规则三角形的典型形态,与正常细胞形态相似;阳性对照组细胞基本全部死亡,细胞层被完全破坏,死亡细胞被溶液粘贴在培养板底。
2.2 MTT定量检测法
检测结果见表3。由表3可以看出:
(1)经洗液处理过医用注射器活塞细胞毒性为4级,呈重度细胞毒性;
(2)未经洗液处理过医用注射器活塞细胞毒性为1级,极微细胞毒性。
经过对经洗液处理过和未经洗液处理过的医用注射器活塞及其所用的ZI-400洗液的细胞毒性试验,结果ZI-400洗液呈重度细胞毒性,经洗液处理过的医用注射器活塞也呈重度细胞毒性,结果不合格。未经洗液处理过的医用注射器活塞呈极微细胞毒性,为合格结果。我们了解到的一些情况表明,不少检验机构在检验医用注射器活塞体外细胞毒性项目时,经常发现呈重度细胞毒性,判为不合格产品,原因归结为可能其制造材料为再生材料。但从我们的试验结果判断,可能是生产过程中使用洗液洗涤的结果,导致对产品质量作出误判。建议以后检验这类经过洗液浸泡的材料时增加对其洗液的细胞毒性试验,以较全面评价产品质量,并督促厂家改进生产工艺,清除残留洗液,以保证产品合格。
摘要：检测机构对一次性使用医用注射器活塞进行生物学评价时,多发现其呈细胞毒性。我们按卫生部提出的生物学评价试验选择指南及样品提供方意见,选取了基本生物学评价中的5项试验,对一批一次性使用医用注射器活塞进行了系统生物学评价,发现其有细胞毒性。进一步对其进行综合检测和分析后,发现原因可能是厂家清洗活塞后的洗液残留所致。此研究为客观评价一次性使用医用注射器活塞的产品质量,督促厂家改进生产工艺,保证产品安全提供了参考。
关键词：一次性使用医用注射器活塞,生物学评价,细胞毒性
参考文献
[1]奚廷斐.医疗器械生物学评价[J].中国医疗器械信息,1999,5(3):4-9.
[2]GB/T16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验[S].医疗器械生物学评价标准汇编.北京:中国标准出版社,2003:80.
[3]贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况[J].实用美容整形外科杂志,2001,10(5):253-255.
【关键词】尿沉渣红细胞检测方法联合
【中图分类号】R446.12【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0152-01
在对尿沉渣中的红细胞进行临床检验时，相关医护人员主要应用了DiasysR/S2003尿沉渣工作站以及UF-100全自动尿沉渣分析仪，将这两种检测方法进行联合应用，可以提高尿液分析的质量，而且有利于提高我国尿液分析的规范化与标准化程度。这两种检测方法的工作原理、操作方法以及检测结果有着一定差异，本文对联合使用尿沉渣红细胞检测方法的应用意义进行了探讨，希望可以对相关工作者有所帮助。
一材料与方法
1、一般资料
1.1仪器.DiasysR/S2003尿沉渣定量分析工作站（美国Di-asys公司）、UF-100型全自动尿沉渣分析仪及配套试剂（日本Sysmer公司）。
1.2对象。随机收集了某医院泌尿科及肾内科，住院送检尿标本460例。
2、方法
用一次性尿杯收集患者洁净随机尿，充分混匀后分二管倒进有凸头专用离心管中，第一管以400G相对离心力（RCF）离心沉淀5min，倾弃上层尿液9.8ml，留下尿沉渣0.2ml，通过R/S工作站的可调加样器把沉渣全部吸入流动计数室中。通过摄像显微镜将计数池的格子打到计算机上计数10个小格（0.1μl）的红细胞数，以单位体积报告混匀尿结果。第二管用于UF—100尿沉渣全自动分析法检测。DiasysR/S2003尿沉渣定量分析工作站结果男性RBC≥5个/μl、女性RBC≥7个/μl为阳性；UF-100型尿沉渣全自动仪结果RBC≥15个/μl为阳性。本次实验采用了两样本率χ2检验。
二结果
在本次实验中，有460例标本，应用DiasysR/S2003尿沉渣工作站以及UF-100全自动尿沉渣分析仪这两种不同的方法进行检测，检测结果如表1所示。这两种检测方法测得RBC阳性率分别为48.3%、61.1%，利用两样本率χ2进行检验，得出P<0.01，说明二者有着显著性差异。
表1两种方法的检验结果对比
将DiasysR/S2003尿沉渣工作站的定量分析法的检测结果，与UF-100全自动尿沉渣分析仪检测结果相比，UF-100红细胞测定阳性的尿液中，真性RBC尿占总沉渣的例数为222、草酸钙结晶为36、无定形结晶为9，酵母样菌为8，细菌为4，其他沉渣为2，总合计为281，假RBC尿占12.8%，其中草酸钙结晶、无定形结晶、酵母样菌和细菌样本分别占7.8%、2.0%、1.7%和0.9%。，而其他沉渣的比例可以忽略不计。
三讨论
在临床实验中，对尿液进行分析，多会采用显微镜检测法，在检测的过程中，要对优化操作技术，避免出现操作失误的现象，对尿液分析的准确性，影响着临床诊断的正确性以及鉴别诊断的可靠性。显微镜检验可以有效检测出尿液中含有的有形成分，但是应用这一方法对操作的精确度要求比较高，而且比较耗费时间，重复性差，无法对检测结果进行定量分析，这不利于对患者的临床动态观察。在尿沉渣红细胞的临床检测中，医护人员多使用的是DiasysR/S2003尿沉渣工作站以及UF-100全自动尿沉渣分析仪这两种方法，由于这两种方法的检测方法、结果以及原理有着较大差异，所以，在联合应用的过程中，一定要提高操作的规范性，还要制定统一的标准，这样才能降低手工操作时出现个体差异以及失误的概率。
DiasysR/S2003尿沉渣工作站的工作原理主要是动力装置产生的吸力，这种吸力可以将尿沉渣提供提取到显微镜仪器特定的计数池中，而且具有计数后自动冲洗的功能，这种方法提高了观测图像的清晰度，而且提高了计数结果的准确度。在将尿沉渣从试管中提取到显微镜下进行观察时，计数结果主要是以细胞数的形式制定定量报告的。而UF-100全自动尿沉渣分析仪DiasysR/S2003尿沉渣工作站以及UF-100全自动尿沉渣分析仪的工作原理是流式细胞原理以及阻抗原理，实验人员利用荧光染色材料，荧光幅波幅等技术，可以准确的对尿液中有形成分进行识别与技术。通过对比发现，DiasysR/S2003尿沉渣工作站的检测结果更加直观，但是操作比较复杂，存在较多的人为误差，所以，这种方法检测尿沉渣中的红细胞，准确值以及可靠性并不高。UF-100全自动尿沉渣分析仪，由于自动化程度比较高，所以，操作较为简单，提高了尿沉渣检测的效率以及质量，还减少了尿样的传递时间，缩短了样本放置的时间，有助于提高测定结果的精密性，并且这种方法携带污染率低，有助于提高实验过程的安全性。
结果还表明，UF-100全自动尿沉渣分析法的敏感性显著高于DiasysR/S2003尿沉渣工作站分析法，尿沉渣分析仪的敏感性较高，且其特异性也较好与显微镜涂片结合起来对红细胞的共同检出敏感度很高，漏检率很低。在临床上应该把这两种方法结合起来，消除了DiasysR/S2003尿沉渣工作站沉淀法中残留体积不准、细胞成分附壁，细胞离心破坏变形以及人工显微镜计数等引起的一系列误差。尿液中草酸钙结晶大小形态与红细胞相似，染色敏感度也类似，在散点图中与红细胞交叉分布而形成的假阳性；细菌的体积较红细胞小，但成堆细菌颗粒其大小与红细胞相似，当细菌细胞膜对荧光染色的通透性较低时，荧光强度下降，有可能被误认为红细胞；集聚成团的非晶形尿酸盐结晶、磷酸盐结晶等，同样也可使红细胞测定结果呈假阳性升高。总之，尿液中大量细菌、酵母样菌和各种结晶均会不同程度影响红细胞测定，且误认率达26.6%（59/281）为红细胞，其中草酸钙，无定形结晶以及酵母样菌为主要干扰成分，与其他学者的相关报告相符。
综上所述，临床检验工作中利用UF-100型尿沉渣分析仪检测尿沉渣是尿常规筛检的一个重要的过筛手段。但是当尿样中出现上述各种可能影响到UF—100检测细胞结果的有形成分，或尿液电导率过低时，必须结合干化学分析和显微镜检查综合分析，以保证检测结果的准确性。
参考文献
[1]李小龙，郭仁勇，陈晓东.Diasys尿沉渣测定方法的参考值确定[J].临床检验杂志.2003（01）
[2]武蓉珍，刘胜勇，徐丽珍，陈东红，吴日荷.草酸钙结晶对UF-100尿沉渣分析仪测定红细胞的影响[J].临床检验杂志.2002（04）
甲基汞对未分化型PC12细胞的毒性机制
摘要：应用未分化型PC12细胞为体外模型,研究甲基汞对多巴胺能神经元的毒性作用机制.利用MTT法检测甲基汞的.细胞毒性,Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化,流式细胞术定量分析细胞周期分布和凋亡比率,并进一步通过比色法评价各项氧化应激指标.结果显示,甲基汞以剂量依赖性方式降低了细胞存活率,干扰细胞周期,造成S期细胞阻滞,细胞出现典型的凋亡性死亡特征.另外,甲基汞暴露导致PC12细胞内O-.2、H2O2和・OH等活性氧含量急剧增加,脂质过氧化程度升高,且SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性降低.因此,甲基汞对多巴胺能神经元具有强烈的毒性,毒性作用机制涉及到干扰细胞周期、诱导细胞凋亡和引发严重的氧化损伤.作 者：张鹏 徐永平 李晓宇 金礼吉 ZHANG Peng XU Yongping LI Xiaoyu JIN Liji 作者单位：大连理工大学环境与生命学院生物工程系,大连,116024期 刊：环境科学学报 ISTICPKU Journal：ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAE年，卷(期)：,29(6)分类号：X171.5关键词：甲基汞 细胞凋亡 氧化应激 未分化型PC12细胞
1.基本治疗：治法祛风解表。以手太阴、手阳明经及督脉穴为主。主穴列缺合谷大椎太阳风池
操作主穴用毫针泻法。风寒感冒，大椎行灸法;风热感冒，大椎行刺络拔罐。配穴中足三里用补法或平补平泻法，少商、委中用点刺出血法，余穴用泻法。方义感冒为外邪侵犯肺卫所致，太阴、阳明互为表里，故取手太阴、手阳明经列缺、合谷以祛邪解表。督脉主一身之阳气。温灸大椎可通阳散寒.刺络出血可清泻热邪。风池为足少阳经与阳维脉的交会穴，“阳维为病苦寒热”，故风池既可疏散风邪，又与太阳穴相配可清利头目。
2.其他治疗
(1)拔火罐法选大椎、身柱、大杼、肺俞，拔罐后留罐15分钟起罐，或用闪罐法。本法适用于风寒感冒。
(2)刺络拔罐法选大椎、风门、身柱、肺俞，消毒后，用三棱针点刺，使其自然出血，待出血颜色转淡后，加火罐于穴位上，留罐10分钟后起罐，清洁局部并再次消毒针眼。本法适用于风热感冒。
(3)耳针法选肺、内鼻、下屏尖、额，用中、强刺激。咽痛加咽喉、扁桃体，毫针刺。
MTT法在检测细胞增殖方面的探讨
目的` 了解MTT(四甲基偶氮唑盐)法在检测细胞增殖性方面的作用.方法 采用酶标仪在570 nm波长附近(500-600 nm)处测定光吸收值,以反映活细胞的数目.结果 吸光度值在0.75-1.25时,这样才能保证数据有线性关系,MTT比色法才可灵敏、准确地反映出细胞数量上的变化.结论 MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖性方面有效的方法,具有操作简便、经济、快速、易自动化的优点.
作 者：赵嘉惠 张华屏 王春芳 作者单位：山西医科大学医学实验中心分子生物学实验室,太原,030001 刊 名：山西医科大学学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF SHANXI MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 38(3) 分类号：Q-331 关键词：比色法 细胞增殖 MTT1 材料
1.1 样品及对照材料[1]
1.1.1 样品
鼻通贴, 规格:7.5cm×1.8cm, 批号:20100408, 由哈尔滨市天地仁医药科技有限公司提供, 同一批号至少取3个供试品。
1.1.2 阴性对照材料
经确认的不产生细胞毒性反应的高密度聚乙烯。
1.1.3 阳性对照材料
经确认的可重现细胞毒性反应的含有有机锡添加剂的聚氯乙烯。 (琼脂扩散试验阳性对照液为20%苯酚溶液) 。
1.2 细胞系
小鼠成纤维细胞ATCC (L 929) , 从建立的细胞系并已认可的贮源中获取。本试验使用的细胞系购自中国医学科学院上海细胞库, 使用的是无支原体污染细胞。
1.3 仪器与试剂
Sunrise酶标仪、CO2孵箱。超净工作台、冰箱、倒置光学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液氮瓶、电热恒温水浴锅、96孔细胞培养板、移液器, 可调式微量加样器。MEM培养基、RPMI1640培养基 (美国GIBCO公司) , 胎牛血清 (美国GIBCO公司) , 二甲基亚枫 (Dimethyl Sulphoxide DMSO) (美国sigma公司) 、消化液 (0.25%Trypsin&0.02%EDTA (吉诺生物医药技术有限公司) 、磷酸盐缓冲液 (吉诺生物医药技术有限公司) 、 (四唑盐[3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetr-azolium bro2mide]) 。
MTT溶液:MTT磷酸盐溶液, 浓度为5mg/m L、中性红磷酸盐溶液, 浓度为0.01%,
2 方法[2]
2.1 四唑盐 (MTT) 比色法
哺乳类动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色, 用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解后, 用酶标仪测定其浓度, 从而定量测定细胞的存活比例。
2.1.1 样品浸提液制备
浸提介质为含10%新生牛血清的RPMI1640培养基 (空白对照液) 。按照每毫升浸提液覆盖6cm2样品进行浸提。浸提条件为 (37±2) ℃浸提24h。采用相同条件制备阴性、阳性对照材料浸提液。
2.1.2 试验步骤
①培养细胞达到其对数生长期末细胞趋于融合, 用细胞消化液消化分散细胞, 用细胞培养液配制成1×104个/m L的细胞悬液。取96孔培养板, 每孔加入100μL的细胞悬浮液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔表面。②置于含5%二氧化碳培养箱内, (37±2) ℃下培养24h。③弃去原培养液, 每孔加入100μL的空白对照液、阴性对照液、阳性对照液、供试品浸提原液并以培养基作稀释剂的i=1.5系列浸提稀释液。每组至少设8孔。SI5置含5%二氧化碳培养箱, (37±2) ℃下培养。培养间期为48h。⑤培养间期后, 每孔加入PBS–Ca 100μl洗两次, 弃去孔内液体, 每孔分别加入MTT溶液20μL, 置含5%二氧化碳培养箱, (37±2) ℃培养5h。⑥弃去孔内液体, 每孔分别加入150μl DMSO, 将培养板放置振荡仪上振荡10min使孔内溶液颜色均匀。⑦用酶标仪测定吸光度, 采用双波长测定法, 选用的波长为570nm, 630nm。⑧结果计算细胞相对增殖率RGR (%) =试验样品组 (阴性对照组, 阳性对照组) 的吸光度/空白对照组的吸光度×100%。⑨结果判断:根据RGR值, 判定细胞毒性见表1。结果阴性对照组细胞毒性反应为1级。阳性对照组细胞毒性反应为3级。试验样品组反应见表2。
2.2 琼脂扩散试验
在细胞处于生理状态时, 用中性红活体染色剂使细胞着色, 但又对细胞无毒。用来研究观察样品对细胞形态和生理状态影响。
2.2.1 样品浸提液制备
浸提介质为含10%新生牛血清的RPMI1640培养基 (空白对照液) 。浸提比例与MTT法相同。将滤纸剪成1.5cm×1.5cm小块, 用浸提介质浸透备用。采用与试验样品相同条件及方法制备的阴、阳性对照材料浸提液。
2.2.2 试验步骤
①培养细胞达到其对数生长期末细胞趋于融合, 用细胞消化液消化分散细胞, 用细胞培养液配制成3×105个/m L的细胞悬液。制备平板细胞单层:每只培养皿加入10m L制备好细胞悬液, 轻轻转动培养皿使细胞均匀的分布在培养皿底部。②放入含5%的二氧化碳培养箱培养24h使其成为融合但不稠密的网状的细胞单层。③弃去原培养液, 将混合的MEM琼脂培养基加入培养皿中10m L/皿放冷凝固后。④每个培养皿加入10m L新配制的0.01%中性红活体染色液10m L, 37℃避光染色15min;⑤弃去染色液每个皿放置3个试样, 放入含5%的二氧化碳培养箱培养24h;⑥细胞反应=褪色指数/溶解指数结果;⑦镜下观察结果评分, 评判标准见表3。细胞毒性反应见表4。结果阴性对照组细胞毒性反应为1级。阳性对照组细胞毒性反应为4级。试验样品组反应见表5。
3 讨论
细胞毒性试验可观察生命细胞在外源性有害物质的作用下所发生的一系列结构与功能的改变, 根据所采用的方法不同, 可观察到体外培养细胞受某种化合物刺激后细胞的凋亡、衰亡直至死亡的全过程。研究内容涉及外源性有害物质对机体的细胞毒性作用、特异的细胞毒作用、细胞毒物代谢和毒物的细胞毒作用机理以及致癌性等, 范围十分广泛, 研究方法也各不相同。细胞毒性试验有很多种方法GB/16886.5-2003规定方法有直接接触试验 (MTT法) 、间接接触试验 (琼脂覆盖法) 本次试验目的是以期从琼脂覆盖法、MTT法中筛选出适合本样品细胞毒性的方法, 建立一套简便、快速的体外细胞毒性检测方法。通过试验两种方法的细胞毒性测定结果基本吻合, 但是琼脂覆盖法操作过程较MTT法复杂。并且结果判断人为因素大, 不能定量, 而MTT法法的优点是简便、快速、所需细胞数较少, 试验周期短。其原理是根据哺乳类动物细胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色, 用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解后, 用酶标仪测定其浓度, 从而定量测定细胞的存活比例。所以四唑盐 (MTT) 可用于鼻通贴的细胞毒性的测定方法简单可靠。
参考文献
[1]GB/T16886.12–2000.医疗器械生物学评价—第12部分:样品制备与参照样品[S].2000.
[2]GB/T16886.5–2003.医疗器械生物学评价—第5部分:细胞毒性试验:体外法[S].2003.
关键词：石化工业污水；小麦；遗传毒性
中图分类号 X74 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）05-13-02
Abstract：To explore teratogenic effects of petrochemical industrial wastewater on plant cell，using micronucleus method of wheat root cell，micronucleus，mitotic index，and chromosomal aberrations were studied in cell mitosis of wheat root tip cultured in petrochemical industry sewage.The results indicated that teratogenic effects of petrochemical industrial wastewater on wheat root tip cells： the appearance of micronuclei，double micronuclei，chromosome lagging，chromosome fragment，and inhibition of mitosis in root tip cells.
Key words：Petrochemical industrial wastewater；Wheat；Genotoxicity
微核是染色体在细胞有丝分裂间期时候的一种畸变表现形式，根尖分生区细胞在外界诱变因子的作用下，在有丝分裂时形成的染色体片段不能随细胞分裂进入细胞核从而形成微核。微核率的大小与致畸因子的剂量或辐射累积效应是呈正相关性的，其在环境诱变和致癌因子的检测研究，特别是在水质污染和致突变剂检测研究中得到了广泛应用。例如，傅思颖等研究染发剂对蚕豆根尖细胞遗传毒性效应[1]，庄昉成等利用蚕豆根尖细胞微核技术检测化工污水的遗传毒性[2]，这种方法被越来越多的研究应用。小麦是黑龙江省重要的粮食作物之一，在黑龙江省北安农场、革求山农场等地种植比较多，是我国重要的粮食作物之一。小麦细胞DNA含量多，染色体数目较多，其根尖分生区细胞分裂旺盛，对环境诱变物的损伤较为敏感，微核效应比较容易观察，例如，高汝勇等利用小麦微核方法研究黄顶菊对小麦根尖细胞的遗传毒性[3]，结果表明，黄顶菊浸提液对小麦有明显的遗传毒性。张志雯等的硫酸铜对小麦根尖细胞的遗传毒性研究[4]，结果表明，硫酸铜对小麦根尖细胞有丝分裂的影响表现为明显的剂量效应，说明CuSO4能导致小麦根尖细胞多种畸变的发生，具有明显的致畸效应。而目前有关石化工业污水对小麦遗传毒性的研究尚未见报道，为此，本研究根据染色显微观察测定的小麦根尖细胞微核的统计，检测石化工业污水对小麦根尖细胞的遗传毒性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 小麦种子 供试的小麦种子于2015年12月购自大庆新华种子商店。
1.1.2 主要仪器 光学显微镜、电热恒温培养箱、数码照相机、4℃冰箱。
1.1.3 主要试剂 卡宝品红染液、乙醇、冰醋酸、盐酸；供试的石化工业污水取自大庆某化工厂。
1.2 方法
1.2.1 种子发根及处理 种子在25℃下自来水处理24～36h，发芽至露白，恒温培养至根尖长大约1cm，转移至石化工业污水的3种不同浓度（原液、稀释10倍、稀释100倍）处理液中23.5℃进行处理培养27.5h，以蒸馏水为对照，3次重复，之后剪取小麦根尖。
1.2.2 根尖材料固定及制片 剪下2～3cm长度的根尖，卡诺固定液于4℃的冰箱固定24h；卡宝品红染色制片，显微镜下观察有丝分裂相，染色体畸变，微核，每组处理观察10个根尖，每根尖观察统计约500个细胞。
1.2.3 镜检照相 移动显微镜视野寻找到有微核出现的细胞，照相并计数。
2 结果与分析
2.1 不同浓度处理液培养下的微核 经蒸馏水（对照）培养的根尖细胞微核数为0；经3种不同浓度处理液的培养处理结果，用石化工业污水原液培养的根尖细胞微核，见图1；用稀释10倍、100倍的处理液培养的根尖细胞均可见微核，如图2、图3。石化工业污水原液培养的根尖细胞微核数目明显多于稀释后处理的，而且污水原液培养的根尖出现双微核现象也比稀释后的多。
3 结论与讨论
本研究表明，石化工业污水对小麦根尖细胞的致畸作用表现在出现微核、双微核、染色体落后、染色体断片、抑制根尖细胞有丝分裂；污水经过稀释10倍、100倍后致畸作用有所减小，但稀释后还存在毒害作用。在以石油化工为主产业的地区，石化工业污水是影响当地农作物种植、畜牧养殖的一个重要因子[6]，石化工业污水经过污水处理系统再排放，对当地作物栽培、植被保护、生态修复是重要的影响因素。
参考文献
[1]傅思颖，杨民和.染发剂对蚕豆根尖细胞遗传毒性效应的研究[J].山西师范大学学报（自然科学版），2014，28（02）：34-39.
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[3]高汝勇，高小宽，李会芬，等.黄顶菊对小麦根尖细胞的遗传毒性[J].麦类作物学报，2013，33（5）：1035-1038.
[4]张志雯，秦素平，陈于和，等.硫酸铜对小麦根尖细胞的遗传毒性[J].麦类作物学报，2014，34（10）：1350-1354.
[5]丁海燕，张国发，武燕，等.利用蚕豆微核试验检测含酚工业水污染状况[J].安徽农业科学，2015，43（29）：13，120.
[6]丁海燕，李玉堂，武燕，等.石化污水处理技术分析[J].大庆师范学院学报，2014，34（6）：49-50.
红细胞平均体积在疾病检测与治疗中的临床应用
红细胞平均体积是反映红细胞体积大小和形状的指标之一.近年来,缺氧血流动力学、血液流交学,尤其是缺血缺氧对红细胞的损伤以及损伤后对机体的.影响等研究,使红细胞平均体积的临床应用更为广泛.主要包括:贫血的诊断与鉴别、新生儿缺氧性脑病中的应用、检测慢性乙肝病情和肝脏损害、监测糖尿病微血管病变、尿红细胞平均体积在鉴别血尿定位中的应用.
作 者：宫春勇 胡坤 GONG Chun-yong HU Kun 作者单位：宫春勇,GONG Chun-yong(解放军第252医院检验科,河北,保定,071000)胡坤,HU Kun(邯郸市中心血站,河北,邯郸,056001)
刊 名：医学综述 ISTIC英文刊名：MEDICAL RECAPITULATE 年，卷(期)：2007 13(18) 分类号：Q24 关键词：红细胞平均体积 血/尿 诊断 治疗关键词：鱼类；病毒性出血病；中草药
中图分类号：S94文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-04-0281-2
0 前言
鱼类出血病也称为鱼类败血症、鱼类腹水病等，是指鱼类的血液成分或血管的机能和结构失常,血液从血管或心脏流出至组织间隙、体腔内或身体外面,给鱼体组织带来严重后果的疾病，分细菌性和病毒性两种。病毒性出血病是一种在鱼种培育阶段广泛流行的疾病，2.5-15cm大小的鱼体都可发病，主要危害草鱼、青鱼，1龄以上的草鱼也可发病，但严重程度稍有下降。该病涉及的鱼类比细菌性出血病少，死亡率也比细菌性出血病略低。
中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样化等优点,除了兼有药性和营养性外,还具有提高水产动物生产性能和饲料利用率的功效。中草药防治鱼类出血病，单味或复方均有疗效，但以复方疗效更为显著，本文特作介绍。
1 鱼类病毒性出血病临床症状
鱼类病毒性出血病发病过程中体表、腹腔、内脏都会发生一系列病变（如表1）。根据出血部位的不同可将该病分为3种类型：红肌肉型、红鳍红鳃盖型和肠炎型（如表2）。
表1 鱼类病毒性出血病各时期症状
2 鱼类病毒性出血病的病原体
鱼类病毒性出血病的病原体有两种，一种是呼肠弧病毒（双股RNA病毒科），主要导致“肠出血型症状”；另一种为小RNA病毒（单股RNA病毒，20-30nm，属小RNA病毒科）,主要导致“肌肉出血型”出血病。
表2 病毒性鱼类出血病的三种表现
注：以上3种类型的症状，不能截然分开，有时可混合出现。
3 鱼类病毒性出血病中草药复方
3.1 “三黄”复方：“三黄”合剂在多鱼病防治中都有应用。以下复方对草鱼出血病有特效
复方1：每100kg鱼，①直接泼洒, 用大黄、黄岑、黄柏各0.5kg，混合煮沸后取汁加500g食盐，趁热将适量面粉倒入药液中搅拌均匀，待冷却后拌饲料投喂，然后将药渣加水再煮一次，连汁带渣稀释，连喂带泼三天明显好转，第五天就停止死鱼。②制成药饵。用三黄粉500g（大黄50%、黄柏30%、黄芩20%）与食盐500g、菜饼3kg、麦麸或米糠10kg制成药饵投喂，连喂7d。
复方2：陶桂庆等（2005）报道，每50kg鱼，用大黄150g+黄柏150g+黄岑150g+地榆100g磨成粉末，制成药饵投喂，每天1次，连喂5d。
3.2 复方止血散
由袁良萃（2000年）用当归、大黄、板蓝根、赤芍、虎仗等中草药配制而成，又称“景珠牌止血散”。治疗对象：草鱼、乌鳗、黄鳝等病毒性出血病。
3.2.1 防病方法 鱼夏花7月初开始首次投喂，每月投喂一次，用量为每300-400kg鱼种投喂1kg中药(1kg中药加1.5kg水，煮沸半小时，拌入易漂浮饲料，含药渣一块拌，以散离为度)。
3.2.2 治病方法 夏花鱼种，按上述用量用药2次，同时泼洒高效、低毒消菌剂，并且l00kg鱼种喂氯霉素5-10g，连喂3d为一疗程。在入秋水质变坏时泼洒水净剂。对二龄鱼种和成鱼：防病按300-400kg鱼喂1kg中药的用量用药一次，以后每隔1个月喂1次。出血病发生后，按上述剂量连喂3次，并泼洒消菌剂，可彻底治愈。1个月后再喂1次，能防止复发。有效率在95%以上，治愈率占90%以上。对于乌鳗、黄鳝，可按水深1米，每667m2水面1kg的剂量，多加水煮沸半小时，全池泼洒二次，可有效防治此病。
3.3 清瘟败毒饮
清瘟败毒饮系白虎汤、黄莲解毒汤、犀角地黄汤等加减组合而成。治疗对象：草鱼。
方法：曹振玉（2001年）用生石膏2000g、知母750g、黄莲750g，黄苓750g、赤当750g，板蓝根2000g、大青叶1500g、生地750g、丹皮750g、元参750g、蚤休750g，共为细末按鱼体重的3‰做成饵料喂服草鱼，连喂5d。
3.4 苦木复方
治疗对象：草鱼。
高春奇（2005年）报道了两种复方，①苦木与板蓝根合剂：板蓝根70%、苦木30%；②苦木与“三黄”合剂：50%苦木+50% “三黄”（黄柏34%、大黄34%、黄苓32%）。
使用方法：每50kg鱼将每月投药饵1.25-2.5kg.其中用中药粉0.5kg，加磺胺类药物5-10g。食盐125-300g为宜，连续投喂5-7天。
3.5 水花生（空心莲子草）复方
防治对象：草鱼。
复方1：水花生-大蒜合剂：邓厚群（2003）报道，按每万尾鱼种用水花生4kg，大蒜250g，加食盐250g，与经过浸泡的适量豆饼混合磨浆，每日投喂2次，连续投喂4d。另外在施药前天用硫酸铜全池泼洒，以清洁水质，每立方米水用药0.7g。
复方2：水花生-大黄粉-韭菜或生大蒜（大蒜素）合剂：①制成药饵：每100kg鱼体重用水花生10kg，捣烂，拌食盐500g、大黄粉1kg、韭菜2kg或生大蒜500g，再拌米粉、麸皮或浮萍10-20kg，连喂7-10天。②制成饲料添加剂：1%的大蒜素, 0.5%的食盐和5%的韭菜(捣烂),每天投喂1次,连续5d 。
复方3：水花生-马鞭草合剂：每50kg鱼，用150-250g马鞭草、250g水花生，混合投喂。
3.6 大青叶-贯众（两色鳞毛蕨）复方
大叶青、贯众、有清热，解毒，凉血，消炎抗菌、止血、活血散瘀功效。防治对象：草、青鱼。
防病方法（草鱼）：按每667m2水深1m,用贯众500g，板蓝根、野菊花苗各200g，先碾碎，然后用10kg开水浸泡4-6h对水全池泼洒，每25d用药1次。
治病方法1：罗青（2005）报道：每667m2水体用大青叶、贯众各300g；板蓝根、白花蛇舌草各200g，先碾粉，然后用10kg开水浸泡4-6h，对水全塘泼洒，并按每50kg鱼种用此药加黄连、地榆、金银花、连翘各100g，拌5-10kg麦麸或鲜嫩青草制成药饵投喂，每天1次，连喂3天为1疗程。
治病方法2：薛志成（1998）报道，对青鱼出血病，每667m2水体用l000g大青叶，5000g贯众加水煮沸10-15min，对水全池泼洒。
方法3：柳富荣（2007）报道：根据不同症状，按表3配制，研粉或煎水拌料投喂，连喂3d。
表3 三种病毒性出血病的中药复方 单位：g/100kg草鱼
3.7 “两花-两黄”复方
“两花”是指：金银花、菊花；“两黄”是指大黄、黄柏，治疗对象：草鱼。
复方①金银花500g、菊花500g、大黃500g、黄柏1500g共研磨成细末。每667m²水面平均水深1米，用上述细末750g混合后，加水适量，全池泼洒。
复方②金银花75g，菊花75g，大黄375g，黄柏255g，加水适量，煎煮15-20min，然后加食盐1500g混合后倒出，再加水适量，连液带渣全池泼洒（李果，2007）。
3.8 仙鹤草-紫珠草复方
仙鹤草具收敛止血，解毒功效。紫珠草有清热解毒、凉血止血、消炎生肌作用。治疗对象：草鱼。
方法1：李明锋（2002）报道：每100kg鱼用仙鹤草，紫珠草500g，大青叶500g，海金砂200g，大黄与板兰根各800-1000g，磺胺嘧啶10g。将中草药煎煮成汁，洒在青饲料上，待水汽蒸发后，再将磺胺嘧啶粉均匀地拌入精饲料品或面糊，沾在青饲料上投喂，连喂4-5d。
方法2：翟新贵等（2008）大黄和枫香树叶0.25-0.5kg研成粉末,经煎煮或热开水浸泡后,配以饵料制成药物饵料喂饲病鱼,连续5d。枫香树叶有行气止痛；解毒；止血功效。
方法3：每667m2水面平均水深1m，用夏枯草和甘草各2kg，用水煎煮3次，再对成20kg水溶液全池泼洒，每天1次，连用3-5d。防治对象：斑点叉尾鮰
4 复方中草药防治出血病的药理
研究表明，复方中草药防治鱼类病毒性出血病的主要机理如下：
4.1 通过增强免疫作用、补充鱼体营养抗出血
许多中药除了含有蛋白质、氨基酸、糖类、矿物质、维生素，还富含多糖类、有机酸类、生物碱类、甙类、挥发油类，如黄芪、当归、大蒜素等，这些成分不仅补充了鱼体营养，还有抗缺氧作用及调节增强免疫作用。
4.2 通过提高鱼体抗应激作用抗出血
有些中草药能增强鱼体对外界各种有害刺激的防御能力,如在恶劣环境中，黄芩具有抗热应激原的作用,黄芪能增强鱼体自身调节平衡的能力。
4.3 通过消炎抗菌、清热利湿，解毒等功效抗出血
有些中草药能够清除和抑制自由基的生成,提高自由基酶类的活性作用,还具有非特异抗病原微生物的作用,可直接杀菌、抑菌、抗病毒、抗原虫。如：黄芩、连翘等对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有杀灭和抑制作用；大黄中的大黄酸、大黄素等有抗菌及收敛、增加血小板,促进血液凝固的作用；金银花、板兰根、大青叶、黄连等既可以提高免疫球蛋白细胞吞噬作用,又能有效地抑制病毒的复制。
中草药在给药配伍时存在着“七情”关系:单行、相须、相使、相畏、相恶、相杀、相反等。在实际配伍中,不能机械照搬以上复方，要在了解中草药药理基础上，因地制宜选用复方，避免相恶、相反,充分利用相须、相使、相制的关系,使复方的组合方剂中各药物取长补短,互相协同,提高疗效。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].化学工业出版社,2005.
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[3] 王方華,李安兴.草鱼病毒性出血病研究进展[J].南方水产,2006(6):66-71.
[4] 王佳喜.我国鱼类出血病及其防治研究进展[J].湖北农业科学，1992:38-40.
[5] 汪长友.中草药在鱼病防治中的应用[J].水产养殖.2003,
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[7] 章秋虎.草鱼暴发性败血症与病毒性出血病之区别及防治[J].科学养鱼.2003(10):47.
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