蛋白质分离纯化及鉴定（精选11篇）
家蚕抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分离纯化及性质鉴定
经大肠杆菌 E.coli K12D31诱导后的家蚕幼虫,其免疫血淋巴经CM-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析及HPLC分离后,得到2种抗菌蛋白,经液相色谱-电喷雾质谱(ESI-MS)分析鉴定,纯化的2种抗菌蛋白分别是家蚕抗菌肽cecropin D和溶菌酶lysozyme.酸性电泳(A-PAGE)测活免疫血淋巴得到抗菌蛋白活性谱:cecropin D在8 h无显著表达,12 h有较强抗菌活性,30 h达到最高,以后逐渐降低;lysozyme在8 h后检测到表达,12 h到达高峰,之后逐渐下降,48 h的血淋巴中未检测到明显的表达.研究认为抗菌蛋白lysozyme和cecropin D是家蚕幼虫感染细菌8 h后大量表达的抗菌蛋白,主要参与细菌感染12～30 h的`血淋巴对细菌的清除,是参与家蚕幼虫抗菌免疫的重要蛋白.
作 者：陈玉清 李保存 吴希 张双全 Chen Yuqing Li Baocun Wu Xi Zhang Shuangquan 作者单位：江苏省分子医学生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏,南京,210097刊 名：南京师大学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：200629(3)分类号：Q966关键词：家蚕(Bombyx mori) cecropin D lysozyme 纯化 活性
关键词：蛋白质,分离,纯化,展望
蛋白质在生物体的生命活动的过程中发挥着重要作用,他参与了催化代谢反应、物质运转、兴奋的传导、生长与发育的调控等。蛋白质广泛存在于动植物体系中,大多数的蛋白质在动植物细胞内的含量极低。欲将蛋白质从生物体系中提取分离出来,同时保证蛋白质组成成分、结构性质和生物活性均不变,目前还存在较大的难度。本文根据蛋白质的理化性质特点,主要针对近几年蛋白质分离纯化的方法做了一个综述。
1蛋白质分离纯化的材料选择和预处理
以蛋白质的结构特点和功能为基础,在实际操作中,根据所分离纯化原材料性质差异,而采取不同方法进行预处理。对于材料的选择,微生物、动物和植物都可做为制备蛋白质的原材料,对于微生物,应重点观察生长期,主要原因为处于对数生长期的微生物,其中含量较高的时酶和核酸,可以获得高产量。动物材料必要对结缔组织和脂肪组织进行处理除去,植物材料除要经过去壳、脱脂的同时,对其细胞壁也要进行破碎, 细菌的细胞壁可以选取不同方法对其破碎。破碎法目前较常用超声波振荡、研磨、高压挤压或酶处理等方法。
2蛋白质分离纯化方法
2.1粗提
2.1.1沉淀法
2.1.1.1盐析沉淀法
盐析沉淀法将不同蛋白质加入一定浓度的盐溶液中,根据其溶解度降低程度的差别,从而达到彼此分离的方法,是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用,到现在仍广泛应用的此方法。蛋白质分子表面亲水基团越多,水化层越厚。章亮[1]采用盐析法提取羔羊皱胃酶的条件进行研究,系统分析了不同因素对盐析效果的影响。
2.1.1.2等电点沉淀
等电点沉淀其原理是利用不同的蛋白质其等电点不同来分离蛋白质。王发祥等[2]提出了一种以等电点沉淀方法纯化苏云金杆菌Cryl Ac蛋白的原毒素,再用分子筛层析纯化其活性毒素的方法。
2.1.1.3有机溶剂沉淀法
有机溶剂沉淀法是向蛋白质等生物大分子的水溶液中加入多倍有机溶剂,从而使蛋白质分子的溶解度显著降低,使其沉淀析出。Lee等[3]用99% 乙醇桅子果实浸渍数月,提取后并经硅胶柱层析,最后获得其中的糖蛋白。
2.1.2离心
2.1.2.1差速离心法
差速离心法其原理是通过不断增加相对离心力,大小不同的颗粒沉降速度差异,通过离心速度和时间不同进行多次离心,从而达到分离。差速离心法的优点是样品的处理量较大, 可用于大量样品的初分离。其缺点是分离复杂样品和要求分离纯度较高时,离心次数多,操作繁杂。由于沉淀的多次清洗、 溶解、再沉淀,容易引起中间损失,所以离心分辨力差。
2.1.2.2密度梯度离心
密度梯度离心法又称为区带离心法。此法可以使样品中几个或全部组分分离,具有良好的分辨率。魏颖娟等[4]采用两步蔗糖密度梯度离心法纯化质膜,结合双水相和蔗糖密度梯度离心作为两种不同的提取及纯化质膜的方法,可以进一步纯化质膜得到更好的分离效果。
2.2精提
2.2.1层析
2.2.1.1离子交换柱层析
离子交换层析是以离子交换剂为柱填充物,在中性条件下, 依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。近几年亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化的应用中具有广泛性。罗轻蕾等[6]采用硫酸铵沉淀和Sephadex G - 200凝胶层析相结合的方法,分离纯化出美国红鱼血清免疫球蛋白。
2.2.1.2疏水相互作用层析
根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。 吴银飞等[7]采用疏水作用层析法纯化小鼠腹水来源的抗乙肝核心抗原单克隆抗体,并且对其分离的条件进行了优化。
2.2.1.3置换层析
置换层析,是目前常用得一种非线性的层析技术,与传统的洗脱层析技术比较,有上样量高、产率高、分辨率高等优点,对分离组分含量较少成分的的作用较明显的特性,研究表明,置换剂的相对分子质量越低,越容易于与固定相结合,因此在分离相对分子质量较小的多肽时,需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
2.2.1.4亲和层析
亲和层析其原理主要是通过偶联蛋白对目的蛋白选择性的吸收和分离,可对目的蛋白有较高的纯化效果。王霞等[9]采用亲和柱层析方法,对太阳鱼 ( Lepomis gibbosus) 脑部乙酰胆碱酯酶进行分离纯化,纯化倍数高,效果较好。
2.2.1.5高效液相色谱
高效液相色谱是利用物质在两相之间的吸附或分配的微小差异达到分离的目的。戴旭青[10]等人采用几种柱层析,高效液相色谱等方法,得到纤维素酶系中三个组分的纯化倍数和酶活回收率。
2.2.2电泳
电泳技术作为分离纯化蛋白质的手段之一,其与其他蛋白质分离与纯化方法相比较,具有电泳时操作温和、较高的特异性、高分辨率的优点。现已广泛应用于各种生物大分子的分离、纯化、分析、制备等。
2.2.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酞胺电泳主要以聚丙烯酞胺为介质的区带电泳,目前广泛应用与分离蛋白质。其原理为两方面,一是基于蛋白质的电荷密度,即在恒定缓冲系统中不同蛋白质的同性电荷差异; 一是分子筛选效应,即与蛋白质分子大小和形状有关。它的优点是设备简单、操作方便、能获得较高纯度的蛋白质组分。
2.2.2.2等电聚焦电泳
等点聚焦其原理是采用等电聚焦技术使蛋白质混合物得以分离,条件一般具有p H值梯度的介质中进行,在外电场作用下,各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的p H值梯度处形成一个窄条带[11,12,13]。黄秀丽等[14]采用了液相等电聚焦电泳的方法,大大的提高了纯化时间,提高了效率。
2.2.2.3毛细管电泳
毛细管电泳是一种新的分离技术,其原理主要是将电泳技术和色谱技术相结合,其驱动力为高压电场,分离通道是毛细管,根据待分离样品中各组分之间分配上的差异而实现分离的一类液相分离技术。它分离技术具有简单、高效、快速、样品用量极小等优点[15]。
2.3其他
2.3.1双水相萃取技术
双水相萃取技术是一种新型的分离技术,又称水溶液两相分配技术,是近年来出现的既引人注目。赵新颖等[16]采用PEG / ( NH4)2SO4双水相体系,结合液相色谱分离分析多种蛋白质的方法,达到蛋白质的选择性分配目的,使高丰度和低丰度蛋白通过其富集作用可得到预分离。
2.3.2浊点萃取法
浊点萃取法是近几年来出现的一种新型的液—液萃取技术,它不使用挥发性有机溶剂,不影响环境。Minuth等已经成功的进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试探性研究。
2.3.3反胶团萃取
反胶团萃取分离原理是表面活性剂在非极性的有机相中超过临界胶团浓度而聚集形成反胶团,在有机相内形成分散的亲水微环境。该技术的有点表现为选择性高、萃取过程简单,正萃、反萃可同时进行,并能有效防止生物大分子物质失活、变性等特性[17]。Hidetaka等[18]在反萃过程中,采用降温促使蛋白质从反胶团中转移到水相中。
3展望
摘要：构建FOXA1的原核表达载体，诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段，为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA，逆转录成cDNA，设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA，再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX4T1，构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21 Rosetta DE3，经IPTG诱导，Glutathione Sepharose 4B亲和纯化，通过SDSPAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育，进行GSTPull down试验，检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX4T1FOXA1C和 pGEX4T1FOXA1N的原核表达载体；在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达；经Glutathione Sepharose 4B纯化后，获得了人FOXA1的C端蛋白片段GSTFOXA1C与N端蛋白片段GSTFOXA1N；证实GSTFOXA1C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.
关键词：转录因子FOXA1；原核表达；相互作用蛋白
中图分类号：Q786文献标识码：A
转录因子FOXA1属于叉头框（Forkhead Box， Fox）转录因子家族的FOXA亚家族[1].FOX基因广泛地分布于从酵母到人的各种真核生物中，构成一个庞大的转录因子家族.其中在哺乳动物中就拥有40个以上成员，分别参与细胞分化、增殖、代谢及细胞凋亡等生理过程的调节[2]. FOXA1是该家族最早被克隆的成员[3].
FOXA1蛋白介导许多蛋白的相互作用，调节发育、代谢和肿瘤的发生.FOXA1的功能区域由 DNA结合区和转录激活区构成.作为先锋转录因子，FOXA1的羧基端能与核心组蛋白H3，H4相互作用[4] 加强了FOXA1蛋白与核小体的结合能力.有研究表明转录因子FOXA1 羧基端的转录激活区可以招募TLE3/GRG3结合到染色质上[5].而FOXA1 DNA结合区可以干扰转录因子NKX2.1与DNA的结合功能从而抑制NKX2.1转录复合物的形成，抑制脑肺和甲状腺的发育[6].此外，FOXA1的DNA结合区还介导FOXA1与雄激素受体（AR）的相互作用[7]，而在乳腺癌细胞株中，雌激素的应答在一定程度上依赖于FOXA1的表达[8-9].
为了进一步研究FOXA1在细胞中扮演的角色，本研究通过基因工程技术体外构建表达载体，诱导可溶性融合蛋白 GSTFOXA1C和GSTFOXA1N 的高效表达并亲和纯化.利用 GSTPull down技术，在乳腺癌细胞MCF7中证实GSTFOXA1C可与已知的FOXA1结合蛋白TLE3发生相互作用，证明纯化蛋白结构正确且能与其互作蛋白发生互作，为进一步寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.
1材料与方法
1.1菌种、质粒、细胞系
大肠杆菌DH5α感受（北京鼎国），大肠杆菌BL21 Rosetta（DE3）感受态（广州百恩维），质粒pGEX4T1由本实验室保存，乳腺癌细胞MCF7为本实验室冻存.
1.2主要试剂
限制性内切酶BamHI，XhoI，T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司，MMLV逆转录酶购于Promega公司，DNA高保真聚合酶购于TOYOBO公司，PCR 引物由上海生工生物公司合成，Glutathione Sepharose 4B购于GE，GST抗体购于碧云天，V5抗体购于Millpore公司.
1.3重组质粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的构建及其鉴定
根据NCBI检索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空载体PGEX4T1的多克隆位点确定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物为CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG，下划线为BamH I 酶切位点，下游引物为CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG，下划线为EcoR I 酶切位点.以人的乳腺癌细胞MCF7提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃ 2 min ；98 ℃ 10 s，68 ℃ 90 s，68 ℃ 10 min，32个循环.将 PCR产物克隆入pGEX4T1质粒中，双酶切鉴定后送上海生工测序.以测序正确的pGEX4T1FOXA1为模板，FOXA1C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA，FOXA1C下游引物GCG CCT CGA GTC ATT GGT AGT ACG CCG GCT CCA G；FOXA1N上游引物GCG CGA ATT CAT GTC CTA GGC CAA CCC GG，FOXA1N下游引物GCG CCT CGA GCT AGG CGT GCG GGT AGC TGC GC.分别克隆FOXA1的C端（第397到第461个氨基酸）、N端（第66到第218个氨基酸）.
1.4GSTFOXA1C，GSTFOXA1N融合蛋白的纯化及其鉴定
将测序正确的pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C转化入BL21 Rosetta DE3感受态细胞，挑取阳性单克隆，加入含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，37 ℃，培养至OD值在0.6～1.0之间，加入终浓度为0.8 mmol/L IPTG，32 ℃诱导4 h后收集菌液，溶菌酶酶解30 min，超声破碎，取上清加入GSTbeads室温孵育30 min后，加入Elution Buffer洗脱，收集洗脱后的蛋白，考染和免疫印迹鉴定.
1.5GST pull down
MCF7细胞培养至60%～90%时，脂质体转染带V5标签的TLE3真核表达质粒，48 h后收集转染后的细胞，加入500 μL IP裂解液冰上裂解1 h，13 000 r/min，4 ℃，离心15 min，收集上清，即为总的细胞裂解液.向收集的细胞裂解液中加入20 μL GSTbeads，4 ℃，孵育2 h，离心收集上清，一分为二，分别加入20 μL GSTbeads和纯化后的GSTFOXA1C，GSTFOXA1N蛋白，4 ℃旋转结合2 h，4 000 r/min离心收集珠子，用预冷的GST Lysis Buffer漂洗3次，加入Elution Buffer洗脱，收集洗脱后的蛋白，进行考染和免疫印迹鉴定.
2结论
2.1人FOXA1基因全长的扩增
MCF7细胞 RNA的提取按照Total RNA KitI试剂盒（Omega，USA）进行，运用MMLV逆转录酶（Invitrogen，USA）将RNA反转录为cDNA.通过NCBI查询人FOXA1的cDNA序列设计一对引物，再以cDNA为模板PCR扩增人的FOXA1全长（图1）所示，通过PCR扩增出来的FOXA1 cDNA大小为1 400 bp左右，与NCBI查询的大小基本一致.
2.2重组质粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的构建
再以此为模板扩增FOXA1C/FOXA1N，大小分别为196 kb，459 kb，与预期大小一致.将PCR克隆获得的片段克隆至表达载体PGEX4T1，进行双酶切鉴定如图2所示.我们已经讨论了FOXA1的结构域蛋白在生物体内发挥了重要作用，为了进一步研究其在生物体内的功能，所以克隆出人FOXA1的羧基端和氨基 端蛋白，为后续试验奠定材料基础.
2.3GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白的表达及鉴定
将pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3个质粒分别转化进BL21 Rosetta DE3感受态细胞，挑取阳性克隆大规模培养，经IPTG诱导后，收集菌液，Western blot法检测显示，GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白均能有效表达（图3）.
2.4GSTFOXAC与GSTFOXA1N融合蛋白的纯化
将pGEX4T1，pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C 3个质粒分别转化进BL21 Rosetta DE3感受态细胞，挑取阳性克隆大规模培养，经IPTG诱导后，收集菌液，酶解，超声破碎.上清用GSTSepharose4B亲和珠纯化后，经考马斯亮蓝染色结果显示，虽出现不同程度的降解，但均能有效地获得较高浓度的目的GSTFOXAC及GSTFOXA1N融合蛋白（图4）.
2.5GSTpull down结果分析
将带有GSTFOXA1C与GSTFOXA1N融合蛋白的珠子与过表达的V5TLE3蛋白的MCF7细胞裂解液孵育后，用V5抗体进行Western blot 法检测（图5）结果显示，GSTFOXA1C融合蛋白可以与TLE3 蛋白发生结合，而GST蛋白和GSTFOXA1N融合蛋白在同一位置无此条带，说明FOXA1C端蛋白结构域能够有效的与TLE3 蛋白特异地相互作用，具有与FOXA1全长蛋白部分相似的生物学功能.
1：过表达V5TLE3蛋白的MCF7细胞裂解物（Input）；2：GST蛋白与Input孵育后的Pull down产物；3：GSTFOXA1N融合蛋白与Input孵育后的Pull down产物；4：GSTFOXA1C融合蛋白与Input孵育后的Pull down产物
2.6Pull down结果的考马斯亮蓝分析
将带有GSTFOXA1C融合蛋白的珠子与MCF7细胞裂解液孵育后，同时用GST蛋白与MCF7细胞裂解液孵育的结果作为对照，再用洗脱液将Pull down产物洗脱下来，经考马斯亮蓝染色发现，GSTFOXA1C融合蛋白能够拖下许多与FOXA1C端相结合的互作蛋白，从而为后面的实验奠定材料基础（图6）.
1：Protein Maker；2：Input：MCF7 cell lysis；3：对照组GST Pull down 洗脱产物；4：对照组 GST Pull down 上清；5：实验组GSTFOXA1C Pull down洗脱产物；6：实验组GSTFOXA1C洗脱上清；7：GSTFOXA1C蛋白；8：GST蛋白
3讨论
GST Pull down技术是体外确定两个已知蛋白是否相互作用以及筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法. 本实验成功构建GSTFOXA1结构域蛋白的表达载体，这种构建基因的某一段的结构域蛋白研究其生物功能并不少见，有文章报道过构建转录因子FOXO基因的结构域蛋白研究它与目的蛋白的甲基化作用[10].再摸索诱导条件后以比较优化的条件诱导出GSTFOXA1C和GSTFOXA1N融合蛋白，作为后续试验的诱饵蛋白.将高表达V5TLE3的MCF7细胞裂解液中与GSTFOXA1C诱饵蛋白以最佳时间孵育后，成功捕捉与其已知的结合蛋白TLE3，证实实验制备的融合蛋白具有生物活性.随后再次在MCF7裂解中以GSTFOXA1C为诱饵蛋白进行GST Pull down，将产物进行SDSPAGE后考马斯亮蓝染色发现成功捕捉到相互作用的蛋白.
FoxA1是Fox转录因子家族中的一员，该转录因子属于“螺旋转角螺旋”类蛋白的一个亚群.Fox家族蛋白功能涉及胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、生物老化、免疫调节等多种生物学过程， 其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生有关[11-12].已有文章得出结论FOXA1与TLE3在乳腺癌中相互作用，本文通过进行GST Pull down成功验证这一结论并证实制备的蛋白具有生物活性.
TLE基因最早在1968年被发现，现已知的家族成员共有19个[13]，是典型的转录辅助抑制因子家族蛋白.在哺乳动物中，它包括TLE（transducinlike enhancer of split）1～4（人类）.Gro / TLE蛋白家族不能直接与DNA结合，而是被各种不同类型的转录因子所招募[14].有研究证实转录因子FOXA1 羧基端的转录激活区可以招TLE3/GRG3结合到染色质上.本实验通过利用GSTFOXA1C与TLE3的体外相互作用验证两者相互作用.
乳腺癌现已成为人类的一大杀手，越来越多的研究证明FOXA1在乳腺癌中发挥了重要的作用，使其有望成为肿瘤治疗的新靶点[15-16].本文成功克隆了人的FOXA1，FOXA1C，FOXA1N基因并获得有活性的人FOXA1C和FOXA1N蛋白，为后续进一步寻找FOXA1的互作蛋白和制备抗体奠定了良好的基础.
参考文献
[1]KAESTNER K H， KNOCHEL W，MARTINEZ D E. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors[J]. Genes Dev， 2000，14（2）： 142-146.
[2]HANNENHALLI S， KAESTNER K H. The evolution of fox genes and their role in development and disease[J]. Nat Rev Genet， 2009，10（4）： 233-240.
[3]LAI E.HNF3A， a hepatocyteenriched transcription factor of novel structure is regulated transcriptionally[J]. Genes Dev， 1990，4（8）：1427-1436.
[4]CIRILLO L A.Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 （FoxA） and GATA4[J]. Mol Cell， 2002，9（2）： 279-289.
[5]SEKIYA T，ZARET K S.Repression by Groucho/TLE/Grg proteins： genomic site recruitment generates compacted chromatin in vitro and impairs activator binding in vivo[J]. Mol Cell， 2007，28（2）： 291-303.
[6]MINOO P.Physical and functional interactions between homeodomain NKX2.1 and winged helix/forkhead FOXA1 in lung epithelial cells[J]. Mol Cell Biol， 2007，27（6）： 2155-2165.
[7]GAO N.The role of hepatocyte nuclear factor3 alpha （Forkhead Box A1） and androgen receptor in transcriptional regulation of prostatic genes[J].Mol Endocrinol，2003，17（8）：1484-1507.
[8]CARROLL J S.Chromosomewide mapping of estrogen receptor binding reveals longrange regulation requiring the forkhead protein FOXA1[J]. Cell， 2005：122（1）： 33-43.
[9]LUPIEN M.FOXA1 translates epigenetic signatures into enhancerdriven lineagespecific transcription[J].Cell，2008，132（6）：958-70.
[10]YAMAGATA K.Arginine methylation of FOXO transcription factors inhibits their phosphorylation by Akt[J].Mol Cell， 2008，32（2）： 221-231.
[11]TAN Y，RAYCHAUDHURI P，COSTA R H.Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes[J]. Mol Cell Biol， 2007，27（3）：1007-1016.
[12]LEHMANN O J.Fox's in development and disease[J]. Trends Genet，2003，19（6）：339-344.
[13]CHEN G，COUREY A J.Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression[J]. Gene， 2000，249（1/2）： 1-16.
[14]FISHER A L，CAUDY M.Groucho proteins： transcriptional corepressors for specific subsets of DNAbinding transcription factors in vertebrates and invertebrates[J]. Genes Dev，1998，12（13）：1931-1940.
[15]CANCER Genome Atlas N. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours[J]. Nature，2012，490（7418）： 61-70.
一、目的与要求
1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。
二、实验原理
血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：
C2H5
H
纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2
纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4
H++H2PO4
DEAE纤维素离子交换柱
COOH
C2H5
α、β、γ球蛋白
NH2
COO
H
经过盐析和脱盐的球蛋白液
纤维素-O-(CH2)2-N+…α和β
G
PH6.3
NH2
交换到柱上的α和β-球蛋白
H2PO4
COOH
γ-球蛋白
NH3+
被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白
被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
三、仪器和材料
仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。
材料：马血清，Sephadex
G-25×200g，DEAE-32×200g。
四、实验步骤
（一）分离纯化步骤
1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL
4℃预冷的饱和硫酸铵。边滴边摇。
2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。
3、将剩余的样品上Sephadex
G-25柱，用0.02
mol/L
pH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3
mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。
4、将剩余的蛋白质溶液上已平衡好的DEAE-32柱（装一半的柱子），用0.02
mol/L
pH6.5
NH4AC缓冲液洗脱，用干净的试管收集，并用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，并绘制洗脱曲线，收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白（留少量电泳用，0.5ml测[Pr]）。
5、柱子再生。先用0.3mol/L高盐缓冲液，再用0.02mol/L缓冲液平衡。
（二）电泳步骤
1、安装垂直板电泳槽，按表配制分离胶溶液。用滴管吸取分离胶溶液，沿管壁注入玻璃板至距上端3cm处(插梳为准)
2、立即用滴管沿凝胶管壁加人蒸馏水约0.5cm高度，加水时应注意减少胶液表面的震动与扩散。加蒸馏水的目的，隔离空气中的氧和消除凝胶柱表面的弯月面，使凝胶表面平坦（加水时切勿呈滴状滴入胶液）。
3、静置30分钟，在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示聚合已完成（注：刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等再看出清晰界面时，表明凝胶已聚合）。用滴管吸去凝胶管的水层，并用滤纸条（无毛边）轻轻吸去凝胶表面残留的水分，注意不要损伤已聚合的凝胶表面。
4、按表制备浓缩胶，沿管壁加入浓缩胶，插上梳子，静置15分钟，待凝胶聚合后，待用。
5、加入10倍稀释的甘氨酸一Tris缓冲溶液于电泳槽中，用注射针排除样品孔中的气泡，样品与样品处理液1：1混合后，用微量注射器上样。
6、将上电泳槽的电极接至电泳仪的负极，下电泳槽的电极接至电泳仪的正极，接通电源，刚开始5分钟内6-7
mA／板，待示踪染料迁移到下口约0.5cm处时，就可停止电泳，切断电源（电泳时间约为
2／小时左右）。
7、剥胶
取下玻璃板，用带有10cm长的注射针头，内盛蒸馏水作润滑剂。将针头插人胶与玻璃板之间，边注水边慢慢推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻璃板与凝胶分开。
8、固定，染色与脱色
固定染色液染色过夜，用脱色液脱色.9、染色，加入染色液，染色过夜。
10、拍照，记录结果。
五、实验结果与分析
**
血清样由于蛋白质种类较多，区带不清。脱盐后，样品中剩余蛋白质为α、β、γ-球蛋白，从结果中可以看到几条较为明显的区带。γ-球蛋白的电泳结果显示其分离的较为纯净。
六、注意事项
1、上样前要将使用过的柱子重生。
2、上样时要注意3个相切：缓冲液与柱床表面相切；样品与柱床表面相切；洗样时缓
冲液与柱床表面相切。
3、用琼脂糖封胶时一定要封延时，防止漏胶。
4、配胶时要按照顺序加样，配完后要立刻混匀。
报道了重组大肠杆菌表达的别藻蓝蛋白的下游生产工艺研究,并对产物进行了分析鉴定.工程菌株P1先在NBS BioFlo3000型5 L自动发酵罐进行高密度发酵,融合蛋白获得了高效表达,且主要在细胞内以可溶形式存在.纯化前先将获得的菌体超声破碎,然后经硫酸铵沉淀、疏水层析和离子交换层析三步纯化,接着对纯化的重组别藻蓝蛋白(rAPC)进行SDS-PAGE、PAGE、Western blot等电点分析.证明已获得纯度为96.4%的.rAPC,其等电点为6.0,并且具有与天然APC相似的抗原性.
作 者：唐志红 李富超 吴少杰 葛保胜 林凡 任育红 秦松 TANG Zhi-hong LI Fu-chao WU Shao-jie GE Bao-sheng LIN Fan REN Yu-hong QIN Song 作者单位：唐志红,TANG Zhi-hong(中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071;中国科学院,研究生院,北京,100039;烟台大学,海洋学院,山东,烟台,264005)李富超,吴少杰,葛保胜,林凡,任育红,LI Fu-chao,WU Shao-jie,GE Bao-sheng,LIN Fan,REN Yu-hong(中国科学院,海洋研究所,山东,青岛,266071;中国科学院,研究生院,北京,100039)
内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质
利用AKTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶.分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%.经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400.酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL・min)/mg.并确定了FPLC层析缓冲液的`离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳.
作 者：孟广荣 杨树林 曾亮亮 李新柱 蔡凤 MENG Guang-rong YANG Shu-lin ZENG Liang-liang LI Xin-zhu CAI Feng 作者单位：南京理工大学,生物工程研究所,江苏,南京,210094刊 名：食品与生物技术学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200625(2)分类号：Q814.1关键词：黑曲霉 纤维素酶 内切β-葡聚糖苷酶 分离纯化 酶学性质 动力学
从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T SimpleVector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化.经测序,构建的`克隆质粒pMD-MPT83与GenBank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Westernblotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功.
作 者：鲁俊鹏 罗满林 宋延华 邹潍力 LU Jun-peng LUO Man-lin SONG Yan-hua ZOU Wei-li 作者单位：鲁俊鹏,罗满林,邹潍力,LU Jun-peng,LUO Man-lin,ZOU Wei-li(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642)
宋延华,SONG Yan-hua(广东温氏食品集团有限公司,广东,新兴,527439)
研究从烟草叶片分离原生质体的若干影响因素.通过酶解法降解细胞壁释放出原生质体,利用离心和蔗糖漂浮法从粗提取液中纯化出原生质体,并通过血球计数板计数来比较制备的`效果.结果表明:酶的种类、质膜稳定剂、渗透压稳定剂、pH及酶解时间是影响原生质体制备的重要因素.纤维素酶含量2%,果胶酶含量1%,2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)浓度50 mmol/L,Ca2+与甘露醇作为渗透压稳定剂,pH6左右,温度28℃,酶解时间4h时原生质体的分离效果最佳.
作 者：江力 孔小卫 吴晓杰 李少松 JIANG Li KONG Xiao-wei WU Xiao-jie LI Shao-song 作者单位：江力,吴晓杰,李少松,JIANG Li,WU Xiao-jie,LI Shao-song(合肥工业大学,生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009)
孔小卫,KONG Xiao-wei(安徽大学,生命科学学院,安徽,合肥,230039)
一、实验目的
1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；
5、掌握高氏一号培养基的配制方法；
6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料
高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀
三、实验原理
植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）
第 1 页 或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤
1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制 母液。
2、配制培养液时应注意：
①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；
②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；
③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。
需要注意的是，在加热琼脂，制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，第 2 页 否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH，一直调到培养基的pH为6（5.8~6.5）左右为止。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸（每块大小约为9 cm×9 cm）中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。
3、高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。
第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用报纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固后再使用。
第 3 页 4,、再在操净工上进行消毒，先用紫外线照射30MIN，然后送风，关闭紫外灯，改 用日光灯，对手用酒精进行消毒，对培养基表面也要用酒精进行消毒。准备工作好了，就进行接种。并且要在酒精灯旁边进行操作，避免污染。镊子要在双孔灭菌器上进行灭菌。
4、接种完成后要整理工作台，并且把培养瓶拿到培养架上进行日光培养。
五、放线菌的提取步骤
5、（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。
6、（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）
①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，7、分别将土壤悬液制成10-
1、10-
2、10-
3、10-
4、10-
5、10-
6、10-
7、10-
8、10-
9、10-10的土壤稀释液。
六、稀释涂布法分离土壤中放线菌
8、（1）倒平板
9、将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁
第 4 页 边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。
10、（3）涂布平板
11、用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-
4、10-
5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。
12、（4）倒置平板
13、将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d14、15、5、放线菌的纯化
16、（1）倒平板
同上
17、（2）平板划线
18、将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。
6、放线菌的观察玻璃纸法
19、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。
第 5 页 20、将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。
21、（3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。
22、（4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。
23、（5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。
7、放线菌保藏
斜面低温保藏法
长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 个月，移种一次。
将纯化培养后的放线菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生
白木香内生真菌的分离及分子鉴定
对采自广东省信宜市的白木香进行了内生真菌分离培养,共获得50个菌株,通过rDNA中内转录间隔区(ITs)序列鉴定其为20个种,其中确定至种名的`有7属8种,仅确定至属名的有8种.不能确定种属的有4种,其中A20菌株(Fimetariella rabenhorstii)为国内首次报道.剌盘孢菌(Colletotrichum)共分离到17株,占分高总数的34%,为白木香优势种群;镰刀菌(Fusarium)共分离到11株,是结香部位的优势种群.白木香内生真菌分布部位的专一性不明显,茎中分离的数量及种类最多,叶中最少;5年龄内生真菌的多样性较好,10月龄的多样性较低.
作 者：王磊 章卫民 潘清灵 李浩华 陶美华 高晓霞 WANG Lei ZHANG Wei-min PAN Qing-ling LI Hao-hua TAO Mei-hua GAO Xiao-xia 作者单位：王磊,章卫民,潘清灵,李浩华,陶美华,WANG Lei,ZHANG Wei-min,PAN Qing-ling,LI Hao-hua,TAO Mei-hua(广东省微生物研究所,广州,510070)高晓霞,GAO Xiao-xia(广东药学院,广州,510006)
刊 名：菌物研究 英文刊名：JOURNAL OF FUNGAL RESEARCH 年，卷(期)： 7(1) 分类号：Q949.761.1 Q949.32 关键词：白木香 内生真菌 分子鉴定 ITS区（1）沉淀法
沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法
离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法
固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法
超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法
生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法
随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。
供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法
（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）
供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）
供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：
①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。
②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。
③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。
3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取
供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。
操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。
②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。
③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）
pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。
离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型
用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡
将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速 通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样
略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱
加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。
二．蛋白含量测定方法
采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。
酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。
