蛋白质的研究方法
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是食品工业中测定蛋白质的最常用的一种方法, 它属于间接测定的一种方法, 对食品式试样中的总有机氮进行测定, 然后再根据含氮量推算出蛋白质含量的一种方法。它是一种简单、准确率高的测定方法, 是法定的标准检验方法。运用凯氏定氮法对蛋白质进行测定主要分对样品进行消化、蒸馏、吸收和滴定这四个过程。在催化剂的作用下, 利用浓硫酸对试样进行消煮把试样中的有机物破坏, 使蛋白质中的氮转变为氨态氮, 氨态氮与硫酸结合生成硫酸铵, 利用强碱的作用进行蒸馏使氨逸出, 用硼酸把逸出的氨吸收再用酸进行滴定, 算出试样中氮的含量, 然后再乘以换算系数计算出蛋白质的含量。可是这种方法需要的时间特别长, 而且还会产生有毒有害的气体, 所以要在通风橱中进行实验。随着科学的进步, 宗留香等人对传统的测定方法进行了改进, 利用Se作为催化剂来进行消化过程, 这样就实现了环保消化, 可以不用在通风橱中进行, 并且消化效率也得到了提高。
2 分光光度法
双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法。含有两个或者两个以上的肽键与碱性的硫酸铜反应形成紫色的络合物, 生成的颜色产物在紫外可见分光光度计在540nm波长下测定吸光度。把不同浓度的标准物质和待测试样加入双缩脲试剂, 反应生成的颜色产物在紫外可见分光光度计在540nm波长下测定吸光度测出的值对蛋白浓度作图得出标准曲线, 对于需要测定的试样中蛋白质的含量根据吸光度的值可以查出蛋白质浓度。紫外光吸收法是以分子吸收光谱为基础测定蛋白质组成中含有的色氨酸、络氨酸以及苯丙氨酸等芳香族氨基酸在紫外光280nm出最大吸收峰的一种测定方法。可是核酸在260nm处有有光吸收, 会对测定造成一定的干扰。考马斯亮蓝法另一种常用的光度法。考马斯亮蓝具有快速、稳定与蛋白质结合的特点, 反应进行2分钟左后就可以达到平衡, 并且它的结合物在室温下可以在1h内保持稳定, 它是目前灵敏度最高的一种测定蛋白质的方法, 最低蛋白质检测量可以达到1ug, 并且这种方法操作起来也比较简单, 所用的试剂也比较少, 所用到的显色剂的配制方法也比较简单, 干扰物质少, 缓冲液还原剂、糖等都不会对显色造成影响。近几年利用金属离子与有机染料形成配合物结合光度法测定蛋白质含量得到了发展。金属离子与有机染料相遇形成稳定配合体系, 在酸性条件下, 遇到蛋白质分子, 互相极化形成新的大分子团, 从而定量测定蛋白质的含量。这种方法灵敏度高, 干扰离子少, 操作起来也比较简单。
3 电泳法
电泳是指在电场的作用下, 带电粒子向电荷相反的电荷的移动的现象, 对于蛋白质进行电泳分离时一种重要的分离纯化技术, 主要有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和淀粉凝胶电泳等。在测定过程中对样品的制备是最为关键的步骤, 要最大限度的获得所有的蛋白质。在合适的盐浓度下, 要保持蛋白质的最大溶解度和可重复性, 要选择合适的表面活性剂和还原剂, 才能把所有的共价键二硫键都进行破环, 形成一个各自多肽的溶液, 要把多糖、核酸以及脂类等干扰分子都尽量去除。这种方法的缺点就是所有的试剂多为有害试剂, 会对人体健康造成伤害。唐萍等运用毛细管电泳法测定奶制品中的蛋白质含量, 采用柠檬酸体系对牛奶中蛋白质进行分离, 采用涂层毛细管柱, 在一定的条件下, 对样品缓冲液稀释的奶制品在20分钟内得到了很好地分离。这种方法准确快速, 并且没有污染, 为奶粉的配方改善以及牛奶质量监控提供了一个新的途径。
4 高效液相色谱法测定蛋白质含量
高效液相色谱法就是把蛋白质进行水解, 然后用高效液相色谱法测定每一种氨基酸的组成以及含量, 然后就可以推算出试样中蛋白质的含量了。这种方法的特点就是会受到游离氨基酸的干扰。通过碱水解反应、酸水解反应以及酶水解反应可以准确的测定食物中蛋白质的总氨基酸, 通常情况下, 在进行酸水解后试样中的氨基酸回收率高达95%。氨基酸在通过柱前或者柱后衍生后, 用高效液相色谱检测可以得到很高的灵敏度。利用这种方法的特点就是成本比较高, 因为仪器是比较昂贵的。由于这种方法主要是由仪器来测定的, 所以很好地减少了认为误差, 因此, 它具有可靠和准确的特点, 所以利用高效液相色谱法来测定食品中的蛋白质将会被更多的人采用。
结语
目前食品行业中测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、分光光度法、电泳法和高效液相色谱法, 最准确的测定方法为高效液相色谱法, 运用最广泛的为凯氏定氮法, 随着科学的进步, 对于这几种方法也在不断改进提高, 以后将会出现更准确、快捷的测定方法。但是食品安全问题却只能从源头上解决, 提高检测水平完善检测方法能有效地减少检测的误差却不能保证食品的安全。
摘要：蛋白质是人体生长需要不可或缺的大分子, 与人体生命息息相关。对蛋白质的测定方法研究一直是生物学家和化学家最为关注的问题, 它的测定在各个领域都具有非常重要的意义, 尤其是在三鹿奶粉事件发生后, 我们对于食品中蛋白质测定方法不得不进行反思, 对食品中蛋白质测定方法进行研究具有更为重要的意义。
关键词：蛋白质,食品,测定方法
参考文献
[1]王雅.蛋白质测定实验的研究[J].实验室研究与探索, 2011, 24 (41) :58-59.
[2]邓小超, 吕爱娜, 潘永丽.食品中蛋白质测定方法的改进[J].职业与健康, 2011, 21 (36) :133-134.
关键词：黑莓果酒；蛋白质；提取方法；SDS-PAGE
中图分类号： TS262.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0349-03
随着人们生活水平提高和保健意识增强，以葡萄酒为代表的果酒，其营养价值得到广泛认可。黑莓果实柔嫩多汁、营养丰富，富含锌、硒等多种矿物质，氨基酸种类齐全，且花色苷和总酚含量较其他浆果高，被誉为第三代“黄金水果”。其所含的多酚类化合物在体内发挥抗氧化作用，可以降低心脏病、癌症和其他慢性病的发生率[1-2]。但是黑莓的果实皮薄多汁，易发生霉烂，耐储运能力较差，室内条件下存放2～3 d后果实即变软发黏，而且果实不耐搬运和翻动，因此对黑莓鲜果必须及时加工处理，并且黑莓为高酸型水果，不宜鲜食，有较强的加工属性，将其制成黑莓果酒将具有巨大的市场潜力。
作为一种商品，果酒的澄清度是决定其品质的一个重要指标，澄清透明、颜色清亮的果酒商品容易吸引消费者的眼球。虽然浑浊或带有沉淀的果酒对人体健康没有影响，但影响消费者的购买欲，进而影响销售市场，因此，不论储存条件如何，果酒必须保持较高的澄清度和稳定性才能保持果酒的商品价值。果酒的澄清工艺及澄清剂的研制是目前的研究热点[3-6]。
总体来说，引起果酒浑浊沉淀的因素分为生物因素和非生物因素。针对生物因素，在加工和储存的过程中须严格控制卫生管理。非生物因素是引起果酒浑浊及沉淀的主因，也是在酿造工艺上必须重点探讨解决的技术难点。从已有的研究结果来看，果酒中的蛋白质是引起果酒浑浊的一个主要非生物因素，果酒中的蛋白质含量较低，不是果酒中的主要营养成分，但对果酒的澄清度和稳定性有重要影响，因为果酒装瓶储存过程中蛋白质的缓慢降解导致蛋白质絮凝和聚集成颗粒，最终导致果酒的浑浊和沉淀[7-9]。大部分研究者认为果酒中蛋白质是引起果酒浑浊的一个必要因素，且蛋白质的含量越高，果酒越容易不稳定，越易发生浑浊沉淀现象，因此，果酒中的蛋白质对果酒的浑浊和沉淀都具有贡献作用[10-11]。
目前对葡萄果酒中蛋白质的提取主要采用的方法有无水乙醇沉淀法、丙酮沉淀法、TCA沉淀法、硫酸铵沉淀法、冻干透析法、十二烷基磺酸钠和氯化钾沉淀法（KDS）[12-13]。本研究选择常用的无水乙醇沉淀法、透析冻干法、十二烷基磺酸鈉和氯化钾沉淀法（KDS）对黑莓果酒中的蛋白质进行提取，通过比较3种方法中蛋白质提取率和提取纯度，旨在找出一种简便快捷高效的黑莓果酒蛋白质提取方法，为研究黑莓果酒中蛋白质组分如何引起黑莓果酒沉淀提供可靠的方法，同时对充分开发利用我国的黑莓资源、提高农产品经济价值有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
黑莓初酒为江苏省农业科学院农产品加工研究所酿造。果酒酿造采取2种方式：一种为在黑莓打浆后添加0.1%果胶酶45 ℃酶解2 h；另一种位黑莓打浆后不添加果胶酶。其他的酿造条件一致。果酒未经澄清剂处理。
1.2 试剂与仪器
试剂：无水乙醇、丙酮、SDS均购自南京化学试剂有限公司；KCl，西陇化工股份有限公司；考马斯亮蓝，上海蓝季科技发展有限公司；以上试剂均为分析纯。3.5 ku的透析袋，USA。
仪器：FDU-1200真空冷冻干燥机（东京理化/EYELA）；UV-1600PC分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；SDS-PAGE电泳仪（BIO-RAD公司）；Tanon3500全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能公司）。
1.3 方法
1.3.1 黑莓果酒的前处理 分别取适量未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒样品4 ℃条件下3 000 g离心10 min，去除不溶性的大颗粒物质。弃沉淀，上清备用。
1.3.2 无水乙醇沉淀法 参照Lambri等的方法[14]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒样品，加入200 mL 无水乙醇，于4 ℃条件下沉淀72 h后，10 000 g 离心20 min，收集沉淀，重悬于超纯水中，于3.5 ku的透析袋中透析48 h，，每隔4 h换1次双蒸水。然后于真空冷冻干燥机中冻干，用5 mL蒸馏水分别溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。
1.3.3 透析冻干法 参照Marangon等的方法[15]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒于3.5 ku的透析袋中，透析48 h后，于真空冷冻干燥机中冻干，用5 mL蒸馏水分别溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。
1.3.4 十二烷基磺酸钠和氯化钾沉淀法（KDS） 参照Fusi等的方法[16]，稍作修改，具体操作步骤如下：分别量取经离心处理的50 mL未加果胶酶和加果胶酶的黑莓酒，10%（质量浓度）十二烷基磺酸钠（SDS）加入到黑莓酒样品中，使其终浓度为0.2% （质量浓度），沸水浴5 min，然后将2 moL/L的KCl溶液加入到样品中，使其终浓度为400 mmol/L，轻轻混匀样品后将混合液在4 ℃条件下放置45 min，4 ℃条件下14 000 g 离心15 min，收集沉淀，即为提取的蛋白质样品。将所得样品自然干燥后，分别用5 mL蒸馏水溶解未加果胶酶和加果胶酶黑莓酒的蛋白质冻干样品，所得蛋白质样品放置在-20 ℃冰箱中备用。
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1.3.5 蛋白质含量测定 参照Lambri等的方法[14]对提取的总蛋白质含量进行测定，以牛血清蛋白质（BSA）作为标准蛋白质，考马斯亮蓝G-250染色，然后于595 nm波长处比色，标准曲线方程为y=0.0083x-0.0009，r2=0.9964，结果用 mg/L表示。提取蛋白质样品冷冻干燥后加入一定体积的蒸馏水溶解，再用考马斯亮蓝G-250染色，在595 nm波长处比色。每个样品蛋白质含量均取3次测定结果的平均值。
1.3.6 蛋白质提取率 蛋白质提取率=（提取液的蛋白质含量×蛋白质提取液体积）/（黑莓酒蛋白质含量×黑莓酒样品体积）×100%。
1.3.7 SDS-PAGE分析提取的果酒蛋白質 SDS-PAGE电泳采用12.5%（体积分数）的聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，5% （体积分数）的聚丙烯酰胺凝胶作为浓缩胶。冻干的蛋白质提取样品加入一定量的蒸馏水溶解，5×样品缓冲液[0.5 mol/L Tris-HC1，pH值6.8，20%（体积分数）甘油，4%（质量浓度）SDS，0.005% （质量浓度）溴酚蓝，10% （体积分数）β-巯基乙醇]稀释5倍后，与蛋白质提取液按1 ∶ 1的体积比混合，沸水浴5 min，使蛋白质变性，上样量为20 μL，浓缩胶内电泳时设置电压为80 V，当溴酚蓝线到达分离胶时把电压提高到120 V，当溴酚蓝线到达分离胶底部时停止电泳。蛋白质检测用硝酸银溶液染色，再用Tanon3500全自动数码凝胶成像分析系统拍照分析。
2 结果与分析
2.1 总蛋白质提取效果的比较
从表1可以看出，在3种方法中，透析冻干法提取的蛋白质含量和提取率最高，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（484.34±23.51） mg/L，提取率达到66.01%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（630.60±29.74） mg/L，提取率达到67.01%（质量分数）；无水乙醇沉淀法提取的蛋白质含量较高，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（438.37±23.68） mg/L，提取率达到60.65%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（596.39±32.73） mg/L，提取率达到62.43%（质量分数）；KDS沉淀法的提取量和提取率最低，未加酶黑莓酒蛋白质含量为（278.57±17.02） mg/L，提取率为30.19%（质量分数），加酶黑莓酒蛋白质含量为（314.02±11.54） mg/L，提取率仅为32.87%（质量分数）。 因此，从蛋白质含量和提取率的比较结果可以看出，无水乙醇沉淀法和透析冻干法的效果较好，KDS法的提取效果最差。
2.2 SDS-PAGE分析提取的蓝莓酒蛋白质
3种方法提取的蛋白质质量检测和图谱分析分别见图1和表2。从图1、表2可以看出，提取蛋白质的相对分子质量分布在40～170 ku，但3种方法所获得的蛋白质在凝胶电泳中显示的条带数目、背景颜色以及清晰度均存在差异。无水乙醇沉淀的蛋白质条带最多、最清晰，背景颜色也较浅，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在100、70、20 ku左右，显示3条带，加酶黑莓酒的条带较多，蛋白质的分子质量多集中在40～170 ku，显示5条带；透析冻干法提取的蛋白质不纯，背景颜色很深，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在100 ku和70 ku左右，显示2条带，加酶黑莓酒的条带较多，蛋白质的相对分子质量多集中在40～170 ku，显示4条带；KDS法提取的蛋白质SDS-PAGE图谱中呈现的条带最少、最不清晰，加酶和未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量在70 ku和 20 ku左右，只显示2条带。果胶酶的条带多且集中，相对分子质量多集中在40～170 ku，与加酶黑莓酒中的条带较一致，说明在酿酒工艺的酶解过程中所添加的果胶酶是黑莓酒中的蛋白质的一个重要组成部分。从蛋白质的SDS-PAGE电泳结果来看，无水乙醇沉淀法提取的蛋白质的纯度最高，杂质最少；透析冻干法提取的蛋白质里的杂质较多；KDS法提取的蛋白质质量最差。
3 结论
本研究通过无水乙醇沉淀法、透析冻干法和KDS法提取黑莓酒中的蛋白质，对得到的总蛋白质样品进行定量和SDS-PAGE电泳检测，结果显示如下：
（1）蛋白质含量和提取率的分析结果显示，透析冻干法提取效果最高，无水乙醇法次之，，两者的提取率都在60%以上；KDS法的提取效果最差，提取率为30%左右。
（2）SDS-PAGE电泳显示黑莓果酒的蛋白质相对分子质量分布在40～170 ku，未加酶的黑莓酒蛋白质的相对分子质量多集中在70～100 ku。在果酒的酿造过程中酶解处理会增加果酒中的蛋白质含量和蛋白质种类。
（3）无水乙醇沉淀法获得的蛋白质纯度最高，条带最清晰；冻干透析法获得的蛋白质，冻干后有很大一部分黏稠物不能复溶，杂质太多，虽然含量最高，但其背景颜色太深，条带不清晰；KDS法获得的蛋白质含量最低，条带最少，染色最弱，最不清晰。
样品制备是关键环节，直接影响后续的SDS-PAGE电泳效果，尤其针对黑莓果酒这样低蛋白质含量的原料，确定理想的蛋白质提取方法对蛋白质电泳非常重要。综合以上结果，确定无水乙醇沉淀法为黑莓果酒中总蛋白质提取的最适方法。
参考文献：
[1]Bowen-Forbes C S，Zhang Y J，Nair M G. Anthocyanin content，antioxidant，anti-inflammatory and anticancer properties of blackberry and raspberry fruits[J]. Journal of Food Composition and Analysis，2010，23（6）：554-560.
[2]Elisia I，Hu C，Popovich D G，et al. Antioxidant assessment of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J]. Food Chemistry，2007，101（3）：1052-1058.
nlc202309010032
[3]王 英，周剑忠，黄开红，等. 皂土在黑莓果酒澄清中的应用研究[J]. 中国酿造，2012，31（8）：47-51.
[4]徐 春. 壳聚糖在白葡萄酒澄清中的应用研究[J]. 中国酿造，2006，37（1）：21-23.
[5]周文化，周 晔，周其中，等. 壳聚糖在荔枝果酒澄清中的应用研究[J]. 中南林业科技大学学报，2007，27（3）：106-108.
[6]邓学良，周文化，付 希. 壳聚糖在草莓果酒澄清中的应用研究[J]. 中国酿造，2009，34（12）：83-85.
[7]Achaerandio I，Pachova V，Guell C，et al. Protein adsorption by betonies in a white wine model solution：effect of protein molecular weight and ethanol concentration[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2001，52：122-126.
[8]Esteruelas M，Poinsaut P，Sieczkowski N，et al. Characterization of natural haze protein in sauvignon white wine[J]. Food Chemistry，2009，113（1）：28-35.
[9]Pocock K F，Waters E J. Protein haze in bottled white wines：How well do stability tests and bentonite fining trials predict haze formation during storage and transport？[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research，2006，12（3）：212-220.
[10]Batista L，Monteiro S，Loureiro V B，et al. The complexity of protein haze formation in wines[J]. Food Chemistry，2009，112（1）：169-177.
[11]Waters E J，Wallace W，Williams P J. Identification of heat-unstable proteins and their resistance to peptidases[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40：1514-1519.
[12]Moreno-Arribas M V，Pueyo E，Polo M C. Analytical methods for the characterization of proteins and peptides in wines[J]. Analytica Chimica Acta，2002，458（1）：63-75.
[13]Vincenzi S，Mosconi S，Zoccatelli G，et al. Development of a new procedure for protein recovery and quantification in wine[J]. American Journal of Enology and Viticulture，2005，56：182-187.
[14]Lambri M，Dordoni R，Giribaldi M，et al. Heat-unstable protein removal by different bentonite labels in white wines[J]. LWT-Food Science and Technology，2012，46（2）：460-467.
[15]Marangon M，Vincenzi S，Lucchetta M，et al. Heating and reduction affect the reaction with tannins of wine protein fractions differing in hydrophobicity[J]. Analytica Chimica Acta，2010，660（1/2）：110-118.
[16]Fusi M，Mainente F，Rizzi C，et al. Wine hazing：a predictive assay based on protein and glycoprotein Independent recovery and quantification[J]. Food Control，2010，21（6）：830-834.童 斌，楊薇红，洪文龙，等. 即食风味金针菜的加工工艺[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：352-355.
采用正交试验探讨三氯乙酸、Sevag、蛋白质等电点等方法去除草本刺嫩芽多糖中的.蛋白质杂质.试验结果表明:草本刺嫩芽多糖脱蛋白的最佳条件为三氯乙酸浓度为9%,pH值为8,Sevag法次数为3次,其中1 g中含蛋白质为0.173%,最终多糖得率为12.85%.
作 者：李峰 刘延吉 宗绪岩 于瑞洪 祝寰宇 作者单位：沈阳农业大学生物技术与科学学院,辽宁,沈阳,100116刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：34(1)分类号：Q599关键词：草本刺嫩芽 多糖 脱蛋白
从双螺旋结构——>单链的线团状结构
260nm紫外光吸收度升高，粘度下降
在一个狭窄的温度范围内发生并迅速完成4.简述Km值的意义。（5分）
反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度
5.简单介绍ＲＮＡ的分类和功能。（5分）
1.mRNA 信使RNA 功能：蛋白质合成的模板
2.tRNA 转运RNA 功能：在蛋白质合成中转运氨基酸
3.rRNA 核糖体RNA 功能：核糖体的主要组成成分
6.简述根据蛋白质在水溶液中的哪些性质来分离蛋白质混合物。（5分）
分子大小不同
利用溶解度差别
根据pro的吸附性质
根据对配基的生物学特异性分离
根据pro带电状态
7.8.简述维持蛋白质三级结构的作用力。（5分）氢键疏水键离子键范德华力 简述酶作为生物催化剂的特性。（4分）
极高的催化效率
反应条件温和，但容易失去催化活性
酶催化活性与辅酶和金属离子有关
酶的催化活性在体内受调节控制
酶有高效专一性
9.简述酶的可逆抑制作用的类型和特点。（6分）
竞争性抑制：特点，这类抑制作用中抑制剂，在分子结构上与底物相似，在酶促反应中与底物【S】竞争，从而阻止底物与酶结合非竞争性抑制剂：特点，底物和抑制剂同时和和酶发生结合两者无竞争作用
反竞争性抑制：反竞争性抑制剂不与游离酶结合，只能与ES复合物合成无活性的三元复合物ESI，但ESI不能分解成产物P
10.简述tRNA的二级结构组成及各部分的特点。（5分）
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随着生物信息学的迅速发展, 有关蛋白质序列和结构的信息正急剧增长, 但是由于蛋白质结构解析所要求的实验条件比序列测定要严格和困难很多, 使得越来越多的已测蛋白质序列没有相应的确定结构信息[1]。若已知蛋白质序列, 但不知其结构时, 需利用一些预测方法。蛋白质结构一共分为四级, 三级和四级结构的预测建立在二级结构预测的基础之上[2,3], 因此蛋白质二级结构的预测成为研究蛋白质结构及其功能的一个关键问题。
遗传算法 (Genetic Algorithm, GA) [4,5]是模拟自然界生物进化机制的一种算法, 遵循适者生存、优胜劣汰的法则。该算法由美国密西根大学的Holland教授和他的学生在20世纪60年代创立, 算法基于自然进化与遗传机理, 用以模拟自然界的自适应现象, 后来被引向广泛的工程问题, 而快速发展成为一种应用广泛且高效的随机全局搜索与优化的自适应智能算法。目前, 其已被广泛应用于自动控制、机器人学、计算机科学、模式识别、模糊人工神经和工程优化等设计领域。
1993年, Unger和Moult[6]首次将遗传算法应用到蛋白质二级结构预测中, 之后遗传算法一直是蛋白质二级结构预测的研究领域中的一个非常重要的工具。遗传算法在蛋白质二级结构预测问题的应用主要实现途径有两种:一是首先建立氨基酸序列和氨基酸间相互作用的优化模型, 如二维晶格蛋白质模型, 通过遗传算法寻找最佳构象, 以此确定蛋白质二级结构, 属于从头预测方法[7];二是利用已知二级结构的样本集, 通过遗传算法寻找高适应度模式, 建立模式集合, 从而预测未知二级结构的蛋白质的结构, 属于比较建模法。针对基于遗传算法的从头预测的蛋白质二级结构预测方法综述文章有所介绍[8,9,10], 但基于遗传算法的比较建模的蛋白质二级结构预测方法并没有。笔者在前人综述的基础之上, 补充近几年的基于遗传算法的从头预测的蛋白质二级结构预测方法, 重点介绍基于遗传算法的比较建模的蛋白质二级结构预测方法, 介绍两种方法在蛋白质二级结构预测中取得的一些新的研究进展, 同时给出其它方法与遗传算法混合在蛋白质二级结构预测中的研究进展。
1 遗传算法
遗传算法是模仿自然界生物进化机制发展起来的随机全局搜索和优化方法, 它借鉴了达尔文的进化论和孟德尔的遗传学说。其本质是一种高效、并行、全局搜索的方法, 它能在搜索过程中自动获取和积累有关搜索空间的知识, 并自适应地控制搜索过程以求得最优解。遗传算法操作使用适者生存的原则, 在潜在的解决方案种群中逐次产生一个近似最优的方案。在遗传算法的每一代中, 根据个体在问题域中的适应度值和从自然遗传学中借鉴来的再造方法进行个体选择, 产生一个新的近似解。这个过程导致种群中个体的进化, 得到的新个体比原个体更能适应环境, 就像自然界中的改造一样。归纳出基本遗传算法步骤如下:
1) 采用二进制编码对搜索空间进行编码, 随机产生N个个体组成初始群体;
2) 采用适应度函数评估个体适应度;
3) 采用轮盘赌选择方法来选择出N个个体进行繁殖;
4) 随机配对, 按一定交叉概率Pc进行单点交叉操作, 生成两个子个体;
5) 按照一定变异概率Pm进行基本位变异, 生成子个体;
6) 若不满足终止条件, 转到2) , 否则, 终止运算, 输出最优解。
上述过程为基本遗传算法步骤, 根据实际问题, 应选取适当的适应度函数, 编码方式, 种群规模、选择、交叉和变异操作, 以达到收敛于全局最优解的目的。在蛋白质结构预测的实际应用中, 算法将根据问题的本身予以改进。
2 从头预测的蛋白质二级结构预测方法
从头预测法利用氨基酸序列和模拟氨基酸间相互作用的模型来预测目标蛋白质的结构, 适用于找不到同源蛋白质, 或同源性较低情况。从头预测法主要有两个思路:一是采用已有的模型, 应用新的自适应方法进行构象的搜索[11]; 二是构建新的模型[12,13], 并采用与其配合的自适应算法, 从而更好地发挥算法的优点。本部分介绍在选取合适的蛋白质结构模型情况下, 遗传算法在蛋白质二级结构预测方法中的应用的一些研究进展。
最早使用遗传算法在二级结构预测方面取得成功的是Unger和Moult[6]在1993年所作的工作。主要利用由Lau和Dill提出的简单二维晶格蛋白质模型, 比较了寻找全局最小能量值的蒙特卡洛法 (Mont Carlo, MC) 和GA的不同效果。在该模型中, 定义两类残基, 即疏水和亲水残基。能量函数的表示如下:每对不相连但相邻的疏水残基间的能量记为-1。链长有8种不同长度, 分别由20个残基到64个残基组成。为了充分反映比较结果, MC方法采用了3种不同的类型。GA中的种群规模为200, 链上的键角组成串以代表一个构象。MC步长和变异操作可以随机选用, 以改变随机选出的键角, 交叉位点也是随机选择的。在上述条件下, GA方法远比MC方法有效。对于最短的肽链, 两种方法都找到了全局最小值。GA的成功之处可能在于一旦肽链接受了一个紧密构象, 它就能够为肽链找到可接受的移动。
之后, 学者们分别以蛋白质肽链的两个二面角、同一序列的不同构象和蛋白质主链的碳原子的空间相对坐标为变量构造蛋白质结构能量模型, 对蛋白质空间结构加以预测取得成功, 通过上述优化变量可以准确推导出蛋白质二级结构, 在此介绍部分遗传算法利用蛋白质能量模型预测蛋白质结构的研究进展。Sun S.[14]将蛋白质分子简化为由全长主链和代表侧链的虚原子组成的模型。从已知蛋白质结构中导出的平均势用于评估适应值。从蛋白质结构数据库中选取得2～5个残基长的肽链片段构成初始种群, 种群规模为90。数据库是已知蛋白质结构的集合。对种群作变异操作, 附加约束是旋转现象的实验半径, 结果表明它与实验结构最终的标准差很低。Bowie和Eisenberg[15]构造了小蛋白质的初始构象, 9个残基长的片段从片段构象库中根据环境编码原则选取, 用相同的原则选取一些更长的有15～25个残基的片段, 并注意从库中排除同源结构。用GA对结构加以改进, 其中每个基因由结构的一组二面角组成, 变异在其中的一个角上发生, 一个基因片段用另一个片段代替而重新组合成串。变异和交叉在片段连接处以较高的概率发生。适应度函数包括了结构的剖面配合、疏水性、可及表面区域、原子重叠和球状化的贡献。势函数中各项的权重根据实验结果确定。
2008年梁欢[16]对遗传算法进行改进提出基于结构分类和位矩阵编码并行遗传的蛋白质二级结构预测方法, 采用多维位矩阵编码形式, 对20种氨基酸采用5位二进制编码, 将构象链分成4个方向, 每个方向用一个4位二进制表表示。采用疏水作用力作为衡量自由能的唯一标准的能量函数E= (E (i) -Emin) / (Emin-Emax) 。其中, E (i) =-1×X为构象能量;Emin为该次迭代中构象的最低能量, 是一个小于或等于0的整数;Emax为该次迭代中构象的最高能量, 是一个小于或等于0的整数。交叉策略采用位交叉和根据适应度函数评估而定的交叉策略。利用三态准确率、整体准确率和Motthew函数3个评价指标进行评价, 本方法收到较好结果, 准确率达到了84.1%。
3 比较建模的蛋白质二级结构预测方法
基于遗传算法的比较建模的蛋白质二级结构预测方法是首先从已知二级结构的蛋白质数据库中, 通过遗传算法寻找某种二级结构的模式规则, 建立模式规则集合, 从而预测未知二级结构的蛋白质的结构。
2003年Huang H.C.[17]首次将遗传算法应用到寻找某种二级结构的模式规则中, 首先随机产生具有一定长度蛋白质切片, 每个蛋白质切片对应3个不同二级结构, 形成3个个体, 按此建立初始种群, 适应度函数主要通过每个个体在已知二级结构的蛋白质数据库中对应的个数, 个数越多, 适应度值越大;变异、交叉和选择采用基本操作方式, 从而提取某些二级结构的模式规则。根据这些规则来预测蛋白质的二级结构, 虽然Q3准确率没有以前的方法高, 但可以让人们深刻理解蛋白质折叠后的内在驱动力。
2004年, Chun Y.W. 和Sun C.T.[18]利用具有稳态策略的遗传算法从PDB中提取某种二级结构的模式规则, 在充分考虑两端氨基酸对中间氨基酸结构的影响因素, 定义了新模式规则。适应度函数主要利用个体的偏好度来描述, 每个个体偏好3个结构各不相同, 定义适应度函数为个体偏好于某种结构的最好偏好度与偏好于另一种结构的次偏好度之比的对数, 此定义能够较好区别个体。选取稳态策略选择操作, 选取均匀交叉和多点变异操作。从PDB中124个蛋白质中获取904个有用模式, 模式的平均信度达到70%以上, 最后给出了部分有用模式的生物学意义, 有效说明了寻找某种二级结构模式规则的重要意义。
2006年, Chun Y.W. 和Sun C.T.[19]再次利用混合遗传算法从PDBSELECT中提取某种二级结构的模式规则。首先利用滑动窗口技术对已知二级结构的蛋白质进行长度为9的切片, 按照中心氨基酸所对应的二级结构进行分群, 对每个群进行独立遗传操作。适应度函数的设计中, 为了找到的模式代表性强, 故定义自信度函数。为了找到的模式其对应到某一种二级结构的分数能比其它两种有很明显的差距, 定义了鉴别率函数。适应度函数为自信度函数与鉴别率函数之积。采用分群的思想大大减少了运算量, 使得Q3准确率提高了12%。同时, 分析了切片长度和分群数量对蛋白质二级结构预测准确率的影响, 给出最佳切片长度为9～13, 分群数量为60～70, 最后同样给出了部分模式规则所对应的生物学意义。
2006年, 邹先霞和陈孝卫[20]在利用遗传算法提取某种二级结构模式规则时, 充分考虑蛋白质亲疏水性对蛋白质二级结构的影响, 将氨基酸序列转化为疏水级序列, 对疏水级序列进行模式提取, 对于每个个体疏水级分4级, 每个级别用两位二进制编码, 对应结构采用Q8标准, 每种结构用三位二进制编码;适应度函数采用支持度与置信度之和形式;其它各操作均采用基本操作。最后给出利用提取的基于疏水级的模式规则来预测蛋白质二级结构的算法, 并给出了整个蛋白质二级结构预测系统架构, 本方法相对于上述方法使得搜索空间从20L降到了4L, 极大地提高了运算效率。
在这里利用参考文献[15,16,17,18,19,20]4种蛋白质二级结构预测方法对PDBSELECT25%预测, 分析结果如表1所示。
4遗传算法与其它方法混合的蛋白质二级结构预测方法
在本部分介绍遗传算法与其它方法混合使用在蛋白质二级结构预测中取得的一些研究进展。
2007年, 王晓明[21]将遗传算法与模拟退火算法相结合, 提出了一种新的混合遗传算法, 采用HP格子模型, HP格子模型是一种粗粒化的模型, 可以将蛋白质中的氨基酸分别放到空间的格子中, 那么这个蛋白质的氨基酸链就由二维或三维的正方形格子空间中的自回避行走轨迹表示。 采用混合遗传算法对HP格子模型优化, 得到能量更小的蛋白质二级结构, 有效说明采用混合遗传算法是一个求解蛋白质二级结构问题的一个高效算法。
2007年, P.Chopra和A.Bender[22]首次将元胞自动机应用到蛋白质二级结构预测中, 利用遗传算法对元胞自动机中迭代权重和次数进行优化获得最大平均Q3准确率, 通过对RS126和CB513样本集预测准确率达到58.21%和56.51%, 收到较好效果。
5 结论与展望
蛋白质二级结构预测是一项长期的战略任务, 虽然已取得了可喜的进展, 但到目前为止的研究还没有完整蛋白质二级结构预测方法可以说是没有偏差的。本文中从从头预测、比较建模和与其它方法混合3个方面阐述了近年来遗传算法在蛋白质二级结构预测中的应用, 旨在说明遗传算法作为一种工程优化方法在蛋白质二级结构预测中的重要意义, 推动遗传算法在蛋白质二级结构预测中的深入应用, 有效提高蛋白质二级结构预测的准确率。
对于基于遗传算法的从头预测的蛋白质二级结构预测来说, 为了提高预测准确率, 应建立新型有效的蛋白质分子模型, 更加有效说明影响蛋白质结构的因素;利用已有蛋白质分子模型的基础上, 改进随机搜索算法, 提高运算效率。
对于基于遗传算法的比较建模的蛋白质二级结构预测来说, 为了提高预测准确率, 充分考虑影响蛋白质二级结构的影响因素, 提高寻找某种二级结构的模式规则的有效性;改进遗传算法搜索方式, 例如采用并行遗传算法, 提高运算率, 降低算法复杂度。
对于基于遗传算法与其它方法混合的蛋白质二级结构预测来说, 为了提高预测准确率, 应将其它方法融合到遗传算法中。例如, 将数据挖掘中关联规则和聚类分析一些数据分析手段融入算法中, 能够有效提高预测准确率。
摘要：蛋白质二级结构预测方法的研究目前已成为生物信息学研究的重要课题之一。为此, 从从头预测、比较建模和混合方法3个方面阐述了近几年遗传算法在蛋白质二级结构预测中的应用研究进展, 并分析了算法的效果和特点, 最后展望了遗传算法在蛋白质二级结构预测中应用的前景与方向。
关键词：蛋白质含量测定；方法；特点
蛋白质含量的测定是目前生物化学中常用的一项指标测定。目前国内外所采用的检测方法主要有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲分光光度法、考马斯亮蓝法（Bradford法）、Lowry法、二辛可酸比色法（BCA法）、荧光光度法、电流法、毛细管电泳分析法、罗丹明生物探针法以及高效光谱遥感技术分析法等。
每种测定法都有其优势，但也不可避免存在一定缺点。实验中，应综合考虑各方面因素再选择最佳使方法。实验对测定所要求的灵敏度和精确度、蛋白质的性质、溶液中存在的干扰物质、测定所要花费的时间等因素都会影响最终实验方法的选择。
本文主要就几种常见的蛋白质测定方法的原理及特点作一简单概述、比较。
1 凯氏定氮法
1.1基本原理
凯氏定氮法包括微量定氮法和全量定氮法两种方法，其测定蛋白质含量的过程主要包括消化、蒸馏、吸收、滴定等步骤。
含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程称为“消化”。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，溶液中氢离子浓度降低。用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，即可根据所用标准酸的当量数计算出待测物中的总氮量。蛋白质中的氮含量一般为16%，据此推断蛋白质含量。
1.2 方法特点
该方法仪器装置简单，试剂用量少且廉价易得。精密度、准确度高，最低可检出0.05mg氮，且样品用量少。但操作较繁琐费时，不利于大批样品的测定，且测定的结果只能是粗蛋白质的含量，处理未知样品时，其误差还有变大的危险。
1.3适用场合
适用于一切形态的食品与生物样品。对于不溶和浑浊的样品，其他许多方法不能进行测定，凯氏定氮法是唯一可行的分析方法。
2双缩脲法
2.1基本原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，都有双缩脲反应。蛋白质发生双缩脲反应时，紫色络合物颜色的深浅与其浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用以测定蛋白质含量。
2.2方法特点
该方法操作简便，试剂单一，可快速测定蛋白质含量，测定受蛋白质种类和环境温度的影响小。但灵敏度差，测定范围仅为1～20mg蛋白质。
2.3适用场合
适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。
3紫外吸收法
3.1基本原理
蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的能力。在280nm具有吸光度是蛋白质的一种普遍性质。一定范围内，蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比。
3.2方法特点
该方法不消耗样品，测定后样品仍能回收，低浓度盐类不干扰测定，且简便、灵敏、快速。但也存在缺点：①在测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会对结果产生较大干扰。③蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有變化，因此样品与标准蛋白溶液的pH值若不同，会影响样品中蛋白含量的测定。
3.3 适用场合
适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。
4 考马斯亮蓝法
4.1 基本原理
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，在蛋白质含量为1～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比。
4.2方法特点
该法易于操作，干扰物质少，所用试剂较少，显色剂易于配制。同时考马斯亮蓝与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡，其结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好。
但由于各种蛋白质中的碱性氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
4.3适用场合
该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。
5总结
蛋白质测定方法有十几种，在常用测定方法中，考马斯亮蓝法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍。凯氏定氮法测定结果较为准确，灵敏度高，故往往以该法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。但凯氏定氮法操作过程比较复杂繁琐，测定也较费时，且会产生大量有毒有害气体，危害操作者的身体健康，污染环境。紫外吸收法和考马斯亮蓝法都是较为快速的测定方法。另外，不同方法下不同物质对蛋白测定的干扰也不同。故对于不同样品，应选择合适方法测定，如对测定结果要求较高，则往往需要结合多种方法测定，并分析测定结果，最终得出最准确蛋白含量值。
参考文献：
[1]王宗乾，程龙，邱小永，姬树人，陈维国. 凯氏定氮法测定牛奶纤维蛋白质含量[J]. 印染，2008，12：32-34.
[2]杨正坤， 王秀丽， 龙施华， 郝再彬， 单展展， 周菲菲. 考马斯亮蓝染色法测定大豆茎叶中蛋白质含量[J]. 湖北农业科学，2012，20：4610-4612.
[3]钱博. 乳粉蛋白质快速检测方法的研究[D]. 浙江大学，2006.
健康人24小时尿中蛋白质排出小于150毫克，有时青少年可达300毫克。除外生理性蛋白尿，可分为肾小球性蛋白尿、肾小管性蛋白尿、溢出性蛋白尿、组织性蛋白尿、混合性蛋白尿。
阳性可见于急、慢性肾炎、肾盂肾炎、肾病综合征、结缔组织病肾脏损害、各种药物、肾毒性物质造成的肾损害、妊娠等。如果尿蛋白持续阳性，往往代表肾脏发生了病变，故临床可依据尿蛋白阳性的多少来判定肾病损伤的程度以及肾病治疗的效果。因此，如果出现异常尿蛋白，就一定要有效控制并消除，防止病情恶化进展。
静注人免疫球蛋白中IgG含量检测方法的探讨
为了更好地进行生产质量控制,快速、准确的测定静注人免疫球蛋白中的`IgG含量.实验中对～的静注人免疫球蛋白中的IgG含量检测结果进行了抽样统计分析.分析结果表明:样品40倍稀释后测得的吸光值与标准曲线第三点的吸光值无显著性差异;样品40倍稀释后测得的IgG含量与样品进行20、30、40倍三个稀释度测得的IgG含量的平均值无显著性差异.从而证明,样品40倍稀释后测得的IgG含量可以代表该批样品的IgG含量,无需进行20、30倍的稀释.检测方法会更省时、省力、省材料.
作 者：徐英 冯泓 高雪军 何彦林 周海云 作者单位：兰州生物制品研究所,兰州,730046 刊 名：微生物学免疫学进展 英文刊名：PROGRESS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY 年，卷(期)： 37(4) 分类号：Q512+.2 关键词：静注人免疫球蛋白 免疫球蛋白 吸光度关键词 美藤果 ；种仁 ；酶法除杂浓缩法 ；碱溶酸沉淀法 ；蛋白质功能 ；蛋白质性质
中图分类号 TS225.1 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.021
Abstract Through enzymatic removal of impurity concentration method and alkali soluble acid precipitation method to extract proteins in Plukenetia volubilis linneo seed from defatted powder， getting protein concentrate （PPC） and protein isolate （PPI）. Results showed that their isoelectric point is pH 4.5. When the value of pH is increasing， the solubleness of protein is decreasing and then increasing. PPI has better solubility and viscosity than PPC. PPC has better water imbibition， oil absorption and foaming ability than PPI. The oil absorption capacities of PPI and PPC reach the highest when temperature was around 50℃， the value are 293% and 165%， respectively.
Keywords Plukenetia Volubilis Linneo ； seed ； enzymatic removal of impurity concentration method ； alkali soluble acid precipitation method ； protein function ； protein property
美藤果（Plukentia volubilis Linneo）为被子植物门双子叶植物纲大戟目大戟科的木质藤本多年生油料作物，又名印加花生、山花生、南美油藤、长寿果、印奇果、星油藤、印加果等，原产南美洲安第斯山脉的亚马逊河流域巴西的雨林地区，当地土著居民食用了几千年[1-2]。课题组在海南三亚引种种植美藤果，1 年就可以结果。美藤果种仁中不仅含有丰富的不饱和油脂、人体必需蛋白质和优质氨基酸，而且还含有多种维生素和酚。油脂、蛋白质、氨基酸、维生素、醇等物质是组成美藤果种仁的主要部分，也是研究开发利用的主要方向[2-7]。在其种仁榨完油之后，还剩余大量的美藤果饼粕未被利用，这不符合绿色环保的理念和可持续发展的战略[3]。对废弃的美藤果饼粕来说，不仅是一种资源的浪费，而且还造成环境污染。目前，对美藤果所含蛋白质的研究不多[2，7-11]，工业上提取蛋白质的方法主要有酶法除杂浓缩法[8]和碱溶酸沉淀法[9-12]。本实验采用这2种生产工艺美藤果的蛋白质性质进行比较和分析[3]。
1 材料与方法
1.1 材料
美藤果种仁，采摘于海南启星生物科技有限公司美藤果种植示范基地，去壳机械榨油后的美藤果饼粕，保存于零下25℃冰箱中备用。
仪器：pH试纸、培养皿、离心管、玻璃棒、量筒、烧杯、锥形瓶、铁架台、天平、高速离心机 、紫外可见分光光度计、高速万能粉碎机、碳氮分析仪、快速干燥机、恒温水浴锅、匀浆机、烘箱、奥氏粘度计等。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
1.2.1.1 美藤果饼粕处理
将美藤果种仁饼粕于-25℃的冰箱中取出，自然风干2 h，捣碎包装好放入烘箱，95℃ 烘干5 h。取出于高速粉碎机中粉碎，过60目筛，所得粉末在45℃水浴锅下用石油醚浸泡脱脂 6 h，然后置于通风橱中风干24 h 以上，挥干石油醚所得美藤果种仁脱脂粉，再次放入80℃烘箱中烘干3 h，再用高速粉碎机粉碎，过100目筛，所得美藤果种仁蛋白质粉末，于阴凉干燥处保存备用。
1.2.1.2 2种美藤果蛋白粉的制备
酶法除杂法提取美藤果蛋白质粉末流程：取干燥的美藤果种仁脱脂粉→85%乙醇除去多余的糖→α-淀粉酶除去干扰实验的杂质（淀粉酶用量为1.5%，提取温度为水浴50℃）→95%乙醇洗涤→高速离心机离心（离心速率4 000 r/min，离心时间20 min）→烘干沉淀（烘干温度为50℃）→美藤果浓缩蛋白粉末（PPC）[5]。
碱溶酸沉法提取美藤果蛋白粉末流程：取干燥的美藤果种仁脱脂粉→用碱NaOH溶解[其中配置NaOH溶液pH为11.5，NaOH溶液与美藤果种仁脱脂粉液料体积质量比为25∶1（mL∶g），提取时间150 min，提取的水浴温度60℃]→离心机离心（离心速率4 000 r/min，离心时间20 min）→蛋白粉溶液等电点沉淀→静置分离沉淀→洗涤沉淀→风干干燥→继续烘干干燥→美藤果碱提蛋白粉末（PPI）[5]。
nlc202309091009
1.2.2 项目测定
1.2.2.1 美藤果种仁脱脂粉蛋白等电点测定
美藤果蛋白等电点的测定方法[13]：用天平称取5.0 g美藤果脱脂蛋白粉末，与蒸馏水按料液质量体积比为1∶20（g/mL）的比例于烧杯中混合搅拌均匀，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液调节溶液的pH至4.5，水浴加热到50℃，搅拌浸提1 h后，将溶液导入离心管，在室温下以4 000 r/min离心20 min。取等量上清液，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液分别调至一定pH梯度3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，装入离心管离心。离心分离后，立即采用考马斯亮蓝法测定上述清液中的蛋白质含量。所测蛋白质所残留最低的上清液的pH即是美藤果种仁蛋白的等电点。重复2次，取3次的平均数。
1.2.2.2 2种不同蛋白粉末的吸水性测定
用分析天平准确称取0.5 g的美藤果脱脂粉蛋白粉末样品各11份，分别加入装有10 mL蒸馏水的离心管中，用1 mol/L的HCl或l mol/L 的NaOH溶液调节溶液的pH分别为2～12，并标号，混合均匀后震荡，室温下静置30 min，称量离心管的重量并记录数据。放入离心机以 3 500 r/min的速度离心20 min，再小心吸除离心管上层水层后，称量离心管的重量，并记录数据。
根据公式计算吸水性：吸水性（%） =（m2-m1）/m×100%。重复2次，取3次的平均数作为结果进行分析。
1.2.2.3 2种不同蛋白粉末的吸油性测定
用分析天平称取0.5 g蛋白粉末各5份样品，分别加入含有 10 mL 蒸馏水的离心管中并标号，混合均匀后进行震荡，并在水浴锅中以30、40、50、60、70℃水浴30 min之后，称量离心管的总重量，并记录数据。然后放入离心机以3 500 r/min的速度离心20 min后取出，小心吸出上层油层后，称量离心管的总重量。根据公式计算吸油性：吸油性（%）=（m2-m1）/m×100%。重复2次，取3次的平均数作为结果进行分析。
1.2.2.4 2种不同蛋白粉溶解性测定
测定美藤果蛋白溶解性的方法[21]：分别配制2种1%（m/V）美藤果脱脂粉末蛋白质溶液于锥形瓶中，用配置标准的1 mol/L NaOH或者l mol/L HCl 溶液来调节溶液的pH，梯度分别为2～12。用玻璃棒不断搅拌并震荡，20 min后再装入离心管，以4 000 r/min的速度离心，30 min后，立即取出于锥形瓶中收集上清液。用凯氏定氮法测上清液和样品中的蛋白质含量，计算样品中的氮溶解指数（NSI）。氮溶解指数（%）=上清液中的含氮（mg）/样品中的含氮量（mg）×100。
1.2.2.5 2种蛋白质粉末起泡性测定
准确称取1.25 g蛋白样品各3份，分别加入含50 mL蒸馏水的锥形瓶中，震荡混合均匀后全部倒入高速匀浆机中，l0 000 r/min搅打2 min后，立即全部倒入500 mL的量筒中，测量泡沫体积并记录数据。蛋白质的起泡性按以下公式计算：
起泡性（%）=泡沫停止时所量泡沫体积/美藤果蛋白溶液总体积×100%。
然后，立即将量筒置于30℃恒温水浴锅中，分别于10、20、30、40、50、60 min 时段记录残留泡沫体积，并计算相应起泡性。2组实验分别重复3次。
1.2.2.6 2种蛋白质粉末黏度测定
准确称取0.5 g的2种美藤果脱脂蛋白粉末各3份，分别倒入50 mL 含有1.0%（m/V）海藻酸钠蒸馏水的烧杯中，混合震荡均匀后，分别置于水浴锅中水浴加热，在30、40、50、60、70℃温度作用下1 h后，用奥氏黏度计测定其黏度，并记录数据，取3次的平均数作为结果进行分析。
1.2.3 数据分析
采用碳氮分析仪测定美藤果种仁脱脂粉末中的粗蛋白质含量。粗灰分含量测定参照LY/T 1268-1999、粗纤维含量测定参照GB/T 6434-2006、粗脂肪测定参照GB/T 14772-2008、水溶性糖测定参照YC/T159-2002标准进行测定[7]。
2 结果与分析
2.1 美藤果种仁蛋白脱脂粉的化学成分
从图1可以看出，粗蛋白质是美藤果脱脂粉中的主要化学成分，其蛋白质含量高达63.62%，在植物中已遥遥领先。水溶性糖含量占样品总量的9.58%，但对于提取蛋白质来说，水溶性糖是生产过程中需去除的杂质；粗纤维含量5.47%，粗灰分含量6.32%，含量相近，但也是蛋白质除杂工艺必须除去的杂质。粗脂肪的含量相对最少，只有2.06%。
2.2 美藤果种仁蛋白的等电点分析
由图2可知，当美藤果脱脂粉蛋白质溶液的pH值在3～4.5时，美藤果脱脂粉蛋白溶液的吸光值随着pH值的增大而降低，然后又随着美藤果脱脂粉蛋白质溶液pH值的逐渐升高而吸光值也不断升高，只是升高的趋势不强。当pH值在4.5左右时，美藤果脱脂粉蛋白质吸光度达到最小值，所以，上清液中残留的美藤果种仁蛋白质含量最小，析出的沉淀最多，故此时即为美藤果种仁蛋白的等电点。加酸至等电点是从提取液中分离蛋白的最简便方法。它能确保提取液中蛋白质最大量的沉淀。由图2可知，美藤果种仁脱脂粉蛋白的等电点pH值约为4.5。这与文冠果（pH在4.6）[14]和茶子树（pH为4.0）相近，跟赵旻等[3]的云南星油藤种仁蛋白结果一致。
2.3 2种方法得到的蛋白的吸水性比较
图3显示，美藤果脱脂粉碱提蛋白（PPI）和浓缩蛋白（PPC）在不同梯度pH下的吸水性。在等电点pH约为4.5时，吸水性最低。其美藤果脱脂粉蛋白质分子间作用力此时最强，而美藤果蛋白质分子与水分子的结合受到一定限制，就会导致吸水性降到最低。而对于美藤果脱脂粉浓缩蛋白（PPC）并没有经过碱溶解过程，也许还会受到少量粗纤或者维粗脂肪等美藤果组分等因素的影响，所以变化呈现不规律的现象。对于美藤果脱脂粉碱提蛋白（PPI）而言，以pH=4.5为中间点，pH增高或降低时，吸水性都升高。因为蛋白质分子所带有的净电荷量增多，结合能力也会随之增强，从而导致吸水性增大。本试验研究表明：浓缩蛋白（PPC）在同等条件下，吸水性大于碱提蛋白（PPI）。
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2.4 2种方法得到的蛋白的吸油性比较
由图 4可以看出，美藤果脱脂粉PPI的吸油性低于浓缩蛋白PPC的吸油性。美藤果脱脂粉PPC和PPI的吸油性都达到最大值时的温度，约50℃，其最大值分别为293%和165%，比赵旻等[3]的云南星油藤种仁蛋白的吸油性稍大，比一般的植物蛋白要高。美藤果PPC具有较好的吸油性，因为其美藤果种仁脱脂粉浓缩蛋白质本身的疏水性基团能与油分子表面接触，使其接触面积更大，吸油性更好。当温度继续升高时，蛋白质会出现一定变性，从而使得蛋白质凝聚结块，就会在一定程度上减少与油接触的表面积，减少吸油量。另外，随着温度的升高，油的粘度也会随之降低，这些因素都会减弱油与美藤果蛋白分子与油分子的结合能力，从而导致蛋白质吸油性下降。
2.5 2种方法得到的蛋白的溶解性比较
从图5看出，在其等电点附近，即pH约为4.5时，美藤果脱脂粉溶解性最差。因为此时美藤果蛋白质分子间的作用力最小，而在其凝聚而析出的蛋白质沉淀最多，其蛋白质的溶解性也达到最低[15-19]。随着pH增加，美藤果脱脂粉蛋白质的溶解性也逐渐升高。在本实验的pH范围内，PPC比PPI的溶解性更低 。当酸碱度在等电点附近的pH时，可以明显看出这2种美藤果蛋白溶解性的差异。
2.6 2种方法得到的蛋白的起泡性比较
图6表示2种不同方法提取的蛋白在不同时间的起泡性，很显然，PPC的起泡性要明显高于PPI。这可能是美藤果脱脂粉PPC比PPI更容易吸附在水面上，从而进一步降低了其表面的张力，在受到高速匀浆机的搅打过程中，反而更容易形成泡沫，所以会得出反常的实验现象[19]。
2.7 2种方法得到的蛋白的粘度性比较
由图7可知，PPI的黏度要高于PPC。当温度不断升高时，2种不同美藤果蛋白溶液的黏度也会随温度的升高而降低。可能是温度升高，分子间作用减少，粘度降低。而且当温度升高到一定程度时，美藤果脱脂粉蛋白会产生变性，使疏水作用力不断增大，从而进一步导致蛋白质溶液的黏度下降[20]。2种不同的美藤果脱脂粉蛋白在温度升高时黏度都会降低。
3 讨论与结论
实验和数据分析结果表明，美藤果种仁脱脂粉主要成分为：粗蛋白约63.62%、粗灰分约6.32%、粗纤维约5.47%、粗脂肪约2.06%、水溶性糖约9.58%；其中，粗蛋白含量高，有很大利用价值。美藤果种仁蛋白等电点在pH约4.5左右。研究范围内，在吸水性、吸油性方面，美藤果酶法除杂提取浓缩蛋白粉末（PPC）比碱提取蛋白粉末（PPI）略好；2种方法提取蛋白粉的溶解性都是随PH的升高呈先降低后升高的特点；PPI比PPC有较好的溶解性，粘度也略高于浓缩蛋白。在起泡性方面，PPC优于PPI；PPC和PPI的吸油性都达到最大值时的温度，约50℃，其最大值分别为293%和165%；如果需要吸水性、吸油性、起泡性等功能性质的蛋白质时，可以用PPC提取美藤果种仁的蛋白质。如果需要溶解性、粘度良好的功能性质的蛋白质时，可以用PPI方法提取获得美藤果种仁的碱提蛋白质。
致 谢 感谢中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室的赵晏、张萍、李秀芬、许又凯等老师在论文完成过程中提供的帮助，特此致谢！
参考文献
[1] 蔡志全. 特种木本油料作物星油藤的研究进展[J]. 中国油脂，2011，36（10）：1-6.
[2] 蔡志全，杨 清，唐寿贤，等. 木本油料作物星油藤种子营养价值的评价[J]. 营养学报，2011，33（2）：193-195.
[3] Cai Z Q. Shade delayed flowering and decreased photosynthesis， growth and yield of Sacha Inchi （Plukenetia volubilis） plants [J]. Industrial Crops and Products， 2011， 34（1）： 1 235-1 237.
[4] 张思佳，黄 璐，熊周权，等. 美藤果油研究进展[J]. 粮食与油脂，2013，26（6）：4-6.
[5] Hamaker B R， Valles C， Gilman R， et al. Amino acid and fatty acid profiles of the Inca peanut （Plukenetia volubilis）[J]. Cereal Chemistry， 1992， 69（4）： 461-463.
[6] Samanta T D， Laskar S. Chemical investigation of Erythrina variegata Linn. seed proteins[J]. Food Chemistry， 2009， 114（1）： 212-216.
[7] Du Y， Yan J， Zhu X， et al. Physicochemical and functional properties of the protein isolate and major fractions prepared from Akebia trifoliata， var. australis， seed[J]. Food Chemistry， 2012， 133（3）： 923-929.
[8] Sathe S K， Hamaker B R， Sze-Tao K W C， et al. Isolation， purification， and biochemical characterization of a novel water soluble protein from Inca peanut （Plukenetia volubilis L.）[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2002， 50（17）： 4 906-4 908.
nlc202309091009
[9] 邓 红，田芸芸，田子卿，等. 响应曲面法优化文冠果种仁蛋白的碱溶酸沉提取工艺[J]. 食品工业科技，2010，31（8）：197-200
[10] 郭雪松，黄晓杰，王 烁，等. 醇法大豆浓缩蛋白提取工艺的优化[J]. 食品工业科技，2007（5）：181-182.
[11] 谭志光，唐书泽，张志森，等. 酶法制取大米麦芽糊精和浓缩蛋白[J]. 食品工业科技，2006（10）：114-117.
[12] Sathe S K， Kshirsagar H H， Sharma G M. Solubilization， fractionation， and electrophoretic characterization of Inca peanut （Plukenetia volubilis L.） proteins[J]. Plant Foods for Human Nutrition， 2012， 67（3）： 247-55.
[13] 孙小斐，乔玉辉. 白果蛋白的提取分离及其等电点的测定[J]. 食品工业，2012（9）：156-158.
[14] 范雪层，邓 红，李招娣，等. 文冠果蛋白的功能特性及其氨基酸组成分析[J]. 中国油脂，2009，34（6）：26-30.
[15] Khalid E K， Babiker E E， El Tinay A H. Solubility and functional properties of sesame seed proteins as influenced by pH and/or salt concentration[J]. Food Chemistry， 2003， 82（3）： 361-366.
[16] 王风翼，钱 方，李 瑛，等. 大豆蛋白质的生产与应用[M]. 北京：中国轻工业出版社，2004：84-103.
[17] 盛小娜，王 璋，许时婴. 甜杏仁蛋白的功能和结构的研究[J]. 食品工业科技，2008，29（5）：133-136.
[18] 史 卿，杜研学，赵 强，等. 白木通籽分离蛋白的理化与功能性质研究[J]. 食品工业科技，2012，33（23）：76-80.
[19] 莫重文. 蛋白质化学与工艺学[M]. 北京：化学工业出版社，2007：51-57.
[20] 李志锐，刘 波，张 兰，等. 玉米醇溶蛋白功能性质的研究[J]. 中国酿造，2009（5）：28-31.
[21] 赵国华，施 树. 胡麻籽分离蛋白的溶解性与起泡性研究[J]. 食品科学，2009，30（9）：95-98.
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