杂交育种与诱变育种教学反思（精选8篇）
张丽萍
生物组
《杂交育种与诱变育种》是人教版生物必修二第六章的内容，基于学生已经学习了第五章，对于变异有了一定的认识，也学习了两种育种方法，多倍体育种与单倍体育种，相对而言，本节课的教学任务要轻松一些，本周，我在我所任教的三个理科班上了本节内容，现就讲我的基本设计与教后反思整理如下。
一、教学设计
引言：我们小的时候都学过唐朝李绅的一首《悯农》诗，大家还记得吗？“锄禾日当午，汗滴禾下土。谁知盘中餐，粒粒皆辛苦。”（同学齐声背诵）这首诗描写的是烈日当头，劳动人民辛勤劳作的情景。我们已经学习了遗传变异的知识，那么如何提高农作物的产量和品质，使农民不再辛苦呢？今天我们就共同走进第六章《从杂交育种到基因工程》（书写章标题）。
大约在一万年以前，我们古人就开始栽培植物，驯化野生动物，在生产实践中，人们总是选个大品质好的个体来传种，这样通过长期选择，汰劣留良，就形成了品质好的优良个体。这种育种方法我们称之为“选择育种”，选择育种经历的周期长，可供选择的范围也是有限的。育种学家们又摸索出更好的育种方法———《杂交育种和诱变育种》（板书节标题）
现在我手头有两种材料，一种是高秆抗锈病的小麦，一种是矮秆不抗锈病的小麦，已知小麦的高秆D对矮秆d是显性，抗锈病T对易染锈病t是显性。假如你是袁隆平，如何培育出能稳定遗传的矮秆抗锈病的新品种？（找学生到黑板前面写出遗传图解，老师总结）
像这样的育种反思就叫做杂交育种，给出杂交育种的含义，方法（杂交—自交—选优—自交），学生归纳优点与不足。这种方法也可以用在培育家禽和家畜上（引导学生阅读教材），举出实例。杂交育种除了用于选育新品种之外，有的时候是利用的是它的“杂种优势”。分析我们当地大田种植的玉米，农民年年要购买种子，说明玉米种子是杂合子，利用的 就是杂种玉米籽粒饱满，长势整齐健壮，成熟期早的优点。还有家畜中的骡子也是利用的杂种优势，具有个体健壮，体力好，耐力好的马与驴兼之的优点。
杂交育种不能产生新的基因，只是原有的基因的重新组合，而且育种时间比较长，那么有没有更好的育种方法可以弥补这种缺陷呢？（引入诱变育种）
引导学生分析诱变育种的含义、方法、优点与缺点，其中物理诱变中提出用各种射线处理生物，联想到太空的环境，于是育种学家们利用太空资源成为了现实。从1987年开始，我们国家利用自己研制的返回式卫星和“神舟”号飞船先后进行了11次实验。其中“神舟六号”飞船载着两位英雄宇航员返航时，一批特殊的旅客也返回地球，那就是“生物菌种、作物组培苗、农作物和花卉种子”，科学家们还将对它们继续在大地上做试验。除了这些例子之外现实中你还知道哪些利用诱变育种的实例呢？（引导学生思考，举例太空椒，青霉素高产 菌株的培育）
本节课我们学习了杂交育种和诱变育种的方法，联系我们上节课学习了单倍体育种和多倍体育种，比较一下各有什么不同。（还是以上课时提出的两种实验材料为例，找同学说出如果利用单倍体育种，如何操作？找同学到黑板前面写出育种方案），诱变育种的方向，我们是无法控制的，那么有没有一种变异能按照我们的意愿改变呢，那就是基因工程育种，是下节课要学习的内容。
二、教后反思
杂交育种中的很多性状都是由基因控制的，学生理解有一定的难度，且在书写遗传图解的时候，很多学生由于第一章的基本功不扎实，暴露出各种各样的问题，因此，在教学过程中，灵活的处理，着重强调基本功，要求学生人人动手画，才能起到一定的作用。
为了培育出优质谷子品种, 实现高新科技自主创新, 我单位一直把谷子作为主要任务来研究, 并协助高新所承担了国家“谷子空间环境诱变育种与关键技术研究”课题。通过航天育种创研高产、优质、多抗、广适性强的谷子新品种, 进一步提高谷子的产量和品质。几年来, 我们从航天卫星搭载的变异后代中, 已选育出8个优秀新品系:
有朝谷5号后代的黄苗变绿苗新品系;有朝谷2号后代的高秆、长穗型新品系;有晋谷27变异后代的早熟紧码型新品系;有稀有品种毛毛斗谷子变异后代的抗倒伏、活秧熟、优质大粒白米新品系;有山西红变异后代的早熟黄谷子新品系;以及从吨谷1号变异后代的红穗红秆新品系等等。在这些变异材料中, 有的是颜色变化, 有的是形态变化, 有的是生物性状变化等等, 变异形式多样。
“HG207” (暂用代号) 是我们采用航天诱变技术育成新品系之一。本品系原型是晋谷27号。晋谷27植株高大、茎秆粗壮、抗病抗倒、产量高、绿秧熟、白谷黄米, 米质上好。其缺点是生长期长, 在我地区125~130天, 稍遇晚播或低温寡照就成熟欠好。如何选育出既能保持其优良特性, 又能早熟的新品系, 是我们的目标。2004年这一品种经航天卫星搭载;2005年扩繁为一代 (SP1代) , 2006年将SP1代全部作群体观察圃, 以晋谷27为原型对照。在SP2代中出现了大量的矮化变异株, 从矮化株中选出一些株高株型基本一致的优良单株作为SP3代。到2007年的时候, SP3代长相已趋于一致, 再经过严格的纯化选择, 作为SP4代留种。2008年, SP4代田间表现十分整齐, 无一杂株, 长相十分喜人, 秋季测产487.6千克/亩。2009年, 在本所品比试验中, SP5代小区产量比对照增产72%, 差异极为显著。而对照晋谷27也属高产品种, 由于当年播种偏晚 (6月10日) , 又遇特大旱灾而影响了产量。这也显示出“HG207”抗逆性强, 适应性广的特征。
摘 要：采用甲基磺酸乙酯、叠氮化钠、吖啶橙3种诱变剂处理青檀幼苗茎尖生长点。结果表明：化学诱变剂对青檀幼苗成活具有明显的抑制作用，随浓度增大，抑制作用增强，青檀对不同诱变剂的敏感程度不同；甲基磺酸乙酯诱变率最高，叠氮化钠次之，吖啶橙最低；其中甲基磺酸乙酯诱变获得特异单株中黄色叶、花斑叶青檀表现突出。
关键词：青檀；化学诱变剂；诱变育种
中图分类号：S792.99 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.034
Abstract： In this study， EMS， sodium azide and acridine orange was used as mutagen at growing point stem apices of Pteroceltis tatarinowii. The result showed that seeding was significantly inhibited by chemical mutagens， the affection increased with increasing concentration. And Pteroceltis tatarinowii was with different sensitivities to different mutagens. For mutagenesis rate， EMS was the highest， followed by sodium azide， while acridine orange was the lowest. Yellow leaves and spotted leaves were outstanding in mutagenesis treated by EMS .
Key words： Pteroceltis tatarinowii Maxim.； chemical mutagens； mutation breeding
青檀（Pteroceltis tatarinowii Maxim.），榆科青檀属落叶乔木，为我国特有的单种属。青檀是珍稀的乡土树种，树形优美，具有极高的生态及观赏价值[1]。青檀是石灰岩山地造林的先锋树种，具有寿命长、耐瘠薄、耐干旱的特点。檀皮是制造宣纸的重要材料[2-3]。
目前，国内对于青檀的研究主要集中在抗性与种质资源调查方面，在青檀育种试验及种质创新方面仅有笔者做过部分研究[4]，青檀育种仍处于初始阶段。因此，对青檀进行化学诱变处理，对于青檀种质创新具有重要意义。与常规育种相比，植物诱变育种能有效缩短植物育种周期。利用化学诱变剂对植物材料进行处理，诱发植物的基因突变，从而使植物形态特征发生变异。通过观察变异植株，选择和培育后代一致且稳定的特异单株，最终获得新品种[5-6]。大量的实践证明，化学诱变剂在创造植物新种质方面具有出色的表现。如甲基磺酸乙酯（EMS）已在杜梨[7]、杉木[8]等植物诱变育种中得到广泛应用，获得多种观赏价值高的优良突变体；叠氮化钠（NaN3）在杉木诱变育种中也取得较高成效，其他诱变剂在植物诱变方面均有报道。
本试验使用甲基磺酸乙酯、叠氮化钠、吖啶橙对青檀进行化学诱变育种，以期得出适合青檀诱变育种的诱变剂及适宜浓度，为乡土树种育种提供理论数据及科学依据。
1 材料和方法
1.1 时间与地点
本试验于2014—2016年在泰山林业科学研究院试验温室中进行。
1.2 试验材料
将2014年9月上旬收集的青檀种子，经沙藏出芽后播种在穴盘内，翌年4月上旬幼苗出土，子叶展平待真叶萌动时，选择生长健壮、无病虫害的幼苗为试验材料。
1.3 试验方法
本试验采用3种诱变剂，分别为甲基磺酸乙酯（0，1.2%，1.5%，1.8%）、叠氮化钠（0，0.05%， 0.07%，0.1%）、吖啶橙（0，0.1%，0.15%，0.2%）。将蘸有不同浓度诱变剂溶液的脱脂棉球放在幼苗的茎尖生长点上，处理48 h。每天早晚各滴1次，每次1～3滴，然后盖上塑料薄膜和遮阳网，每个处理500株，3次重复，整个过程持续保湿并遮光。从第1次滴液开始，到预定时间后去除脱脂棉球，并用清水冲洗，解除药液作用，常规管理。定期观察生长情况，记录幼苗死亡情况，对变异植株统计观察。
1.4 数据处理
数据采用EXCEL、SPSS13.0进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 不同诱变剂对青檀幼苗死亡率的分析
由表1可以看出，诱变处理后青檀幼苗对不同诱变剂刺激的反应不同。3种诱变剂对幼苗的生长起到了明显的抑制作用，随浓度升高，抑制作用增强。在使用甲基磺酸乙酯对青檀幼苗进行处理时，不同浓度之间死亡率具有显著差异。随着浓度的升高，死亡率逐渐上升，当浓度为1.8%时，死亡率最高，为69.33%。使用叠氮化钠、吖啶橙进行诱变处理时，死亡率表现出与甲基磺酸乙酯相同的结果。诱变育种中一般采用植株半致死剂量作为诱变的最佳浓度[9-10]。使用1.5%甲基磺酸乙酯处理时，死亡率56.33%，接近半致死量，因此，半致死剂量应该略低于1.5%。使用0.1%叠氮化钠进行诱变时，死亡率最高，为46.25%，接近半致死量。使用0.2%的吖啶橙进行诱变时，死亡率最高，为61.32%；浓度为0.15%时，死亡率为46.14%，推测半致死剂量在0.15%～0.2%之间。
在用3种诱变剂对青檀幼苗进行诱变处理时，除吖啶橙外，甲基磺酸乙酯与叠氮化钠诱变处理皆获得变异单株。其中，使用浓度为1.5%的甲基磺酸乙酯进行诱变处理，得到12棵变异植株，变异率为2.4%，变异效果更好；叠氮化钠仅有少量的变异单株；吖啶橙未得到变异植株。因此，在本试验中，使用浓度1.5%的EMS诱变青檀叶色变异效果最佳。
2.2 3种诱变剂对青檀幼苗的诱变效果
甲基磺酸乙酯诱变处理共得到23株变异幼苗，可分为两种变异类型，第一种为叶片黄化，叶形未发生变异（图1），第二种表现为花斑叶，叶片上有黄色斑块，边缘颜色比中间淡（图2）。叠氮化钠处理青檀幼苗得到3株突变体，可分为两种变异类型，第一种表现为叶片上有白斑（图3），第二种表现为叶缘白化，且存在一定程度的卷曲（图4）。在本试验中吖啶橙未得到变异幼苗，说明吖啶橙不适合青檀叶色诱变处理。在表现效果上，甲基磺酸乙酯诱变效果更好，获得的突变体观赏价值更高，稳定性好。
3 讨 论
甲基磺酸乙酯作为一种高效、稳定的化学诱变剂，通过直接修饰碱基的化学机构而改变植物遗传物质的化学性质，被广泛应用于各种植物的诱变研究。其产生的突变类型很多，具有突变频率较高、突变谱稳定等优点，且多为点突变。张晓勤等[11]利用EMS诱变处理大麦，产生丰富的表型变异突变体，其中产生16株白化和黄化突变体，另外，还有白条叶和累病斑突变体。安学丽等 [12]用EMS处理玉米种子，M1代出现大量的畸变株，其中有畸变形状表现为叶片上有黄色、白色条纹或黄色斑块。颜志勤[8]采用不同浓度EMS诱变剂处理杉木种子，出现3种类型变异：子叶卷曲型、花叶型和叶片白化型。本研究采用不同浓度的EMS处理青檀幼苗生长点后，得到大量叶色变异突变体，与前人对其它植物研究的效果基本一致。突变体在形态方面表现出黄叶、花叶效果，这对观赏植物的育种具有重要的影响。
作为常用的化学诱变剂，颜志勤[8]在使用叠氮化钠对杉木进行诱变处理时，发现叠氮化钠对杉木苗形态学上的影响主要表现在子叶和真叶上，出现两种类型的变异：叶片完全白化型，针叶一半白化一半正常型。在本试验中青檀叶片也出现了不同程度的白化效果，与叠氮化钠对杉木的诱变效果相似。但在本试验中，使用0.1%叠氮化钠时死亡率最高，为46.25%，接近半致死量，因此，仍需要进一步使用叠氮化钠对青檀进行诱变试验。
吖啶橙可以镶嵌于两个相邻的碱基对之间，当DNA进行复制时，会使DNA增加或缺失碱基，造成移码突变[13]。在本试验中，吖啶橙诱变的青檀植株中，死亡率随浓度上升而升高，但并没有引起明显的变异效果，初步确定吖啶橙不适用于诱变青檀叶色变异。
4 结 论
通过试验得出，使用化学诱变剂对青檀进行诱变育种是可行的。但不同诱变剂对青檀的诱变效果不同，青檀对不同诱变剂的敏感程度不同。使用甲基磺酸乙酯对青檀进行诱变处理，获得两种变异类型：黄色叶、花斑叶，半致死剂量在1.2%～1.5%之间；使用叠氮化钠诱变处理青檀幼苗，得到2种类型：叶片上呈现白斑；叶缘白化卷曲，半致死剂量在0.1%以上；而吖啶橙没有引起明显的青檀叶色变异。通过诱变试验初步认为，甲基磺酸乙酯诱变获得特异后代的机率更高，叠氮化钠次之。由于本试验初次采用化学诱变剂，后期还需通过进一步的试验探索适合青檀的诱变育种方法，筛选优良突变体，为青檀品种改良与种质创新提供技术支持。
参考文献：
[1]陈有民.园林树木学[M].北京：中国林业出版社，2007：328.
[2]李金昌，王秀滨，邢示辉. 青檀的综合开发利用研究[J]. 中国水土保持，1996（5）：37-38.
[3]高慧，徐斌，邵卓平.青檀树皮的化学组成与细胞壁结构[J].经济林研究，2007，25（4）：28-33.
[4]张林，王峰，孙忠奎，等.青檀多倍体诱变试验初报[J].中国农学通报，2015，31（13）：1-4.
[5]郭建秋，雷全奎，杨小兰，等.植物突变体库的构建及突变体检测研究进展[J].河南农业科学，2010 （6）：150-155.
[6]马惠平，赵永亮，杨光宇.诱变技术在作物育种中的应用[J].遗传，1998，20（6）：41-43.
[7]慎家辉，秦安，李甲明，等.甲基磺酸乙酯诱变杜梨种子突变的鉴定与分析[J].浙江农林大学学报，2014，31（6）：892-897.
[8]颜志勤.三种化学诱变剂在杉木育种中的应用研究[D].福州：福建农林大学，2013.
[9]王园珍.甘蓝型油菜不同诱变方式诱变后代的遗传变异评价[D].武汉：华中农业大学，2007.
[10]陈学林，李卫锋，王丹，等.我国菊花核技术诱变育种研究进展[J].福建林业科技，2007，34（4）：259-263.
[11]张晓勤，薛大伟，周伟辉，等.用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变的大麦浙农大3号突变体的筛选和鉴定[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2011，37（2）：169-174.
[12]安学丽，蔡一林，王久光，等.甲基磺酸乙酯（EMS）对玉米自交系诱变效应的研究[J].玉米科学，2003，11（3）：74-75， 84.
C．大幅度改良某些性状
A．染色体变异）。
B．育种年限显著缩短 D．需大量处理供试材料
C．基因自由组合）。
④抑制细胞有丝分裂中纺锤
D．基因突变 2．单倍体育种和多倍体育种主要依据的遗传学原理是（）。
B．基因连锁互换
3．用秋水仙素处理幼苗，所不能引起的变化是（体的形成 ⑤获得单倍体植株 A．①②③）。
A．单倍体育种 B．多倍体育种）。
C．杂交育种
D．诱变育种
5．下列各项中，可能产生新基因的是（A．用离体花药培养玉米植株
C．通过杂交培养抗病小麦品种 B．②④⑤
C．⑧⑤
D．①③
４．在育种上既要得到更多的变异，又要使后代的变异性状较快地稳定，最好应该采用（①提高突变频率 ②获得无子果实 ③大幅度改良某些性状
B．用低温处理诱导染色体加倍 D．用Ｘ射线处理链孢霉
６．经过杂交育种培育的优良品种连续种植几年以后品质会下降，其根本原因是 A．发生基因突变
B．发生基因重组 C．发生基因分离
D．发生性状分离 ．2003年我国载人航天飞船“神舟”号飞行成功。“神舟”号飞船曾携带一部分 植物种子，进行诱变育种，这是利用太空中的（）因素诱发变异。A．射线等物理因素
B．化学物质等化学因素 C．太空中的微生物
D．自然突变
8．番茄是自花授粉植物，已知红果（R）对黄果（r）为显性，正常果形（F）对多 棱果（f）为显性。以上两对基因分别位于非同源染色体上。现有红色多棱果品种、黄 色正常果形品种和黄色多棱果品种（三个品种均为纯合体），育种家期望获得红色正常 果形的新品种，为此进行杂交。试回答下列问题：（1）应选用以上哪两个品种作为杂交亲本？
（2）上述两亲本杂交产生的F，代具有何种基因型和表现型？
（3）在F：代中表现红色正常果形植株出现的比例有多大？凡代中能稳定遗传的红 色正常果形植株出现的比例有多大？
9．良种对于提高农作物产量、品质和抗病性等具有重要作用。目前培养良种有多种途径。其一是具有不同优点的亲本杂交，从其后代中选择理想的变异类型，变异来源于
用心
爱心
专心 _______________，选育过程中性状的遗传遵循___________、____________等遗传定律。其二是通过射线处理，改变已有品种的个别重要性状，变异来源于__________，实质上是细胞中DNA分子上的碱基发生改变。其三是改变染色体数目，例如用秋水仙素处理植物的分生组织，经过培育和选择能得到________________植株。
10．现有三个番茄品种，A品种的基因型为AABBdd，B品种的基因型为AAbbDD，C品种的基因型为aaBBDD。三对等位基因分别位于三对同源染色体上，并且分别控制叶形、花色和果形三对相对性状。请回答：
（l）如何运用杂交育种方法利用以上三个品种获得基因型为aabbdd的植株？（用文字简要描述获得过程即可）
(2)如果从播种到获得种子需要一年，获得基因型为aabbdda的植株最少需要几年？
(3)如果要缩短获得aabbdd植株的时间，可采用什么方法？（只写出方法的名称即可）11．在家兔中黑色（B）对揭色（b）为显性，短毛（E）对长毛（e）为显性，这些基因是独立分配的。现有纯合黑色短毛兔和褐色长毛兔。请回答下面的问题。（1）试设计培育出能稳定遗传的黑色长毛兔的育种方案（简要程序）： 第第第一二三
步步步________________________________________________________________________； ________________________________________________________________________； ________________________________________________________________________。（2）F2中黑色长毛兔的基因型有____________和____________两种，其中纯合体占黑色长毛兔总数的____________，杂合体占F2总数的____________。（3）此题属于基因的________________________定律。
12．下图纵轴表示青霉菌的菌株数，横轴表示青霉菌产生的青霉素产量，曲线a表示使用诱变剂前菌株数与产量之间的变化，曲线b、c、d表示使用不同剂量的诱变剂后菌株数与产量之间的变化。请根据图6-1回答下面的问题。
用心
爱心
专心
（1）曲线b和a相比，说明了______________________________________________。（2）b、c、d
3条
曲
线
比
较，说
明
了___________________________________________________。（3）比较
13．下图（图6-2）是表示农业生产上关于两对相对性状的两种不同育种方法的过程示意图。请根据图回答下面的问题。b、c、d3
条曲线的变化，最符合人们的菌株是__________________________________，从中我们可得到什么启示？
（1）图中A→B→C→D所表示的育种方法是_____________育种，其显著的优点是______________ ___________________________________________________________________________。
（2）从F1到F4连续多代自交的目的是提高的含量；从F2开始逐代进行人工选择是为了
用心
爱心
专心 淘汰__________，为什么这种选择必须从F2开始而不能从F1开始？__________________ __________________________________________________。
（３）图示的两种育种方法都是从亲本杂交开始，这样做的目的是___________________。．D 2．A 3．C 4．D 5．D 6．B 7．A 8．（l）红色多棱果品种和黄色正常果形品种
（2）RrFf红色正常果形（3）9／16 1／16 9．基因重组
基因分离定律
基因自由组合定律
基因突变
多倍体
10．（l）A与B杂交得到杂交一代，杂交一代与c杂交，得到杂交二代．杂交二代自交，可以得到基因型为aabbdd的种子，该种子可长成基因型为aabbdd植株。（2）4年。
（3）单倍体育种技术。
用心
爱心
专心
用心
爱心
一、课程性质、地位和任务
动物遗传育种学是高等农业院校生命科学专业的主要选修课程之一。该门课程是动物遗传学与育种学的综合，一方面研究动物生长发育中遗传与变异的现象和规律，另一方面在此基础上研究动物育种的基本原理、方法及应用，是后期动物生产各论课的铺垫。
通过对本课程的学习，要求学生获取遗传学及育种学的基本原理和定律，掌握一些必备的动物遗传实验技术和育种实习技能，培养学生灵活运用遗传育种理论和措施解决生产中实际问题的能力，为以后动物生产各论课的学习及从事相关的科研和工作奠定基础。
二、课程基本要求
1．正确理解基因、基因型、基因频率、基因型频率、遗传力、重复力、遗传相关、品种、品系、性能测定、选择差、选择反应、育种值、选配、近交、杂交、专门化品系、杂种优势、遗传多样性等动物遗传育种学基本概念；
2．深刻理解遗传学三大遗传定律，Hardy-Weinberg平衡定律，遗传参数估计，品种标准，生产性能测定，选择反应及其影响因素，个体育种值估计，品种选配与亲缘选配，品种与品系的培育，杂种优势利用等基本理论和方法；
3．熟悉动物染色体核型、遗传定律验证及其实质，群体遗传结构分析，遗传参数计算，常见家畜品种的特征和生产力类型，熟练掌握系谱编制、综合选择指数制订、近交系数与亲缘系数制订、个体选配等必备的家畜育种措施；
4．能运用遗传学定律解释基本的生命现象，评估动物群体的遗传结构，根据实际生产需求设计育种方案并确定相关的育种措施，并能利用新近发展起来的计算机或分子生物学技术来解决动物生产中的一些实际问题。
三、教学内容及安排
绪论（1学时）
（1学时，了解）
1．动物遗传育种学研究的目的和任务 2．动物遗传育种学的发展简史 3．动物遗传育种学与动物生产的关系
第1章
遗传的基本规律（6学时）
本章重点和难点：重点是基因、基因型、表现型与环境之间关系，显性原理，复等位基因，分离定律，自由组合定律，连锁定律；难点是三大遗传定律的实质与验证，互换率计算与三点作图。
1.1 几个基本概念
（2学时，理解）1.1.l 基因型、表现型与环境 1.1.2 显性效应及原理 1.1.3 复等位基因
1.2 分离定律
（4学时，掌握）1.2.1 一对相对性状的杂交实验 1.2.2 分离现象的假说与验证 1.2.3 分离定律在动物生产中的应用 1.3 自由组合定律
1.3.1 两对相对性状的杂交实验 1.3.2 自由组合定律的验证
1.3.3 自由组合定律在动物生产中的应用 1.4 连锁定律 1.4.1 连锁与互换 1.4.2 互换值的测定
1.4.3 基因定位和遗传连锁图谱
第2章
群体遗传学基础（2学时）
本章重点和难点：重点是基因频率与基因型频率计算，Hardy-Weinberg平衡定律的实质，影响基因频率的因素；难点是Hardy-Weinberg平衡定律的实质及其影响因素。
2.1 Hardy-Weinberg平衡定律
（2学时，掌握）2.2 群体基因频率的计算 2.3 影响群体遗传平衡的因素 第3章 数量遗传学基础（6学时）
本章重点和难点：重点是生产性能测定的内容和方法，性能测定的形式；难点是性能测定的方法。
3.1 数量遗传的遗传
（2学时，掌握）
3.1.1 数量性状的概念及特征 3.1.2 数量性状遗传的多基因假说 3.1.3 数量性状表型值与表型值方差的剖分
3.2 数量性状的遗传力
（2学时，掌握）
3.2.1 遗传力的概念 3.2.2 遗传力的估测方法 3.2.3 遗传力的主要用途
3.3 数量性状的重复力
（2学时，掌握）
3.3.1 重复力的概念 3.3.2 重复力的估测方法 3.3.3 重复力的主要用途
3.4 性状间的遗传相关
3.4.1 遗传相关的概念 3.4.2 遗传相关的估测方法 3.4.3 遗传相关的主要用途
第4章
家畜的起源、进化与品种（2学时）
本章重点和难点：重点是家畜的驯养与驯化，家畜在驯化下的变异，品种的概念及标准，家畜品种的分类；难点是家畜品种的概念及标准。
4.1 家畜的遗传与进化
（2学时，理解）
4.1.l 家畜的祖先
4.2.2 家畜的驯化及其在驯化中的变异 4.2 家畜的品种
4.2.1 品种的概念及标准 4.2.2 品种形成的条件 4.2.3 品种的分类
第5章 家畜的生产性能测定（3学时）
本章重点和难点：重点是生产性能测定的内容和方法，性能测定的形式；难点是性能测定的方法。
5.1 生产性能的测定
（1学时，理解）
5.1.1 性能测定的概念及重要性 5.1.2 性能测定的目的和内容
5.2 性能测定的形式
（2学时，掌握）
5.2.1 测定站测定与场内测定 5.2.2 大群测定与抽样测定 5.2.3 个体、同胞与后裔测定
第6章 选择的原理与方法（5学时）
本章重点和难点：重点是人工选择的实质与作用，质量性状的选择，数量性状的选择反应及选择效果的影响因素；难点是对显性基因的选择方法，选择反应及提高选择效果的措施，相关性状的选择反应。
6.1 选择的概述
（2学时，理解）
6.1.1 自然选择与人工选择 6.1.2 人工选择的实质与作用 6.1.3 数量性状与质量性状选择的区别
6.2 质量性状的选择
6.1.1 对隐性基因的选择 6.1.2 对显性基因的选择
6.3 数量性状的选择
（3学时，掌握）
6.3.1 选择差与选择反应
6.3.2 选择反应的影响因素 6.3.3 相关性状的选择反应
第7章
个体的遗传评定（5学时）
本章重点和难点：重点是育种值估计原理，单一亲属信息来源的育种值计算，综合选择指数制订，最佳线性无偏估计（BLUP）的基本原理及优势；难点是多种亲属信息来源的育种值计算，相关性状的选择指数制订，BLUP法估计育种值。
7.1 个体育种值的估计
（1学时，掌握）
7.1.1 育种值的概念及实质 7.1.2 育种值估计的基本原理
7.2 单性状的育种值计算
（2学时，掌握）
7.2.1 单一亲属信息来源的育种值计算 7.2.2 多种亲属信息来源的育种值计算
7.4 多性状的育种值计算
（2学时，理解）
7.4.1 综合选择指数与简化选择指数
7.4.2 不相关性状的综合选择指数制订 7.4.3 相关性状的综合选择指数制订
第8章
个体选配（3学时）
本章重点和难点：重点是同质、异质选配的实质及用途，近交、杂交选配的实质及用途，近交系数与亲缘系数的计算。难点是各种类型选配的实质，近交系数与亲缘系数的计算。
8.1 选配的概念、作用及分类
（2学时，理解）8.2 品质选配
8.2.1 同质选配的实质及用途 8.2.2 异质选配的实质及用途
8.3 亲缘选配
8.3.1 近交选配的实质及用途 8.3.2 杂交选配的实质及用途
8.4 近交系数的计算
（1学时，掌握）
8.4.1 个体近交系数的计算 8.4.2 群体近交系数的计算 8.4.3 亲缘系数的计算
第9章
家畜品系与品种的培育（4学时）
本章重点和难点：重点是品系培育方法，专门化品系结构及培育，杂交育种的步骤，畜群杂 交改良方法；难点是群体继代选育法，专门化品系结构及培育方法，杂交育种与杂交改良。
9.1 品系培育的概念与发展
（2学时，掌握）9.2 品系的培育
9.2.1 系祖建系法 9.2.2 近交建系法 9.2.3 群体继代选育法 9.2.4 专门化品系的培育
9.3 品种的培育
（2学时，掌握）
9.3.1 杂交育种方法分类 9.3.2 杂交育种步骤
9.4 畜群的杂交改良
9.4.1 引入杂交及其注意事项 9.4.2 级进杂交及其注意事项
第10章
杂种优势及其利用（3学时）
本章重点和难点：重点是杂种优势的来源及度量方法，杂交方式，杂种优势利用的几个主要环节；难点是杂种优势的计算，杂种优势效果的预测，配合力测定。
10.1 杂种优势概述
（1学时，掌握）
10.1.1 杂种优势的概念 10.1.2 杂种优势学说 10.1.3 杂种优势的计算
10.2 杂交的方式
（2学时，掌握）
10.2.1 固定杂交方式 10.2.2 轮回杂交方式
10.3 杂种优势利用的主要环节
10.3.1 亲本群的选择 10.3.2 杂交效果的预测 10.3.3 配合力测定
四、考核方式及成绩评定
课程考核方式：专题讨论，课程考试。
课程成绩评定：专题讨论（40％），闭卷考试（60%）。
五、教材及主要教学参考书、网站
[1] 吴仲贤主编，《动物遗传学》，中国农业出版社，1980 [2] 李宁主编，《动物遗传学》（第二版），中国农业出版社，2003 [3] 内蒙古农牧学院主编，《家畜育种学》（第二版），中国农业出版社，1990 [4] 张沅主编，《家畜育种学》，中国农业出版社，2001 [5] 张劳主编.动物遗传育种学.北京：中国广播电视大学出版社，2003 [6] 刘榜主编.家畜育种学.北京：中国农业出版社，待出版
[7] Bourdon RM.Understanding Animal Breeding.Second Edition.Prentice Hall, Inc.2000.[8] Spike PL.Applied Animal Breeding.Iowa State University.2002.[9] Sharpiro LS.Introduction to Animal Science.Prentice Hall, Inc.1998.[10] Stufflebeam CE.Genetics of Domestic Animals.Prentice Hall, Inc.1989 [11] Animal Breeding and Genetics group http://
马友记
（甘肃农业大学动物科技学院兰州730070）
摘要：文章简要回顾了我国现代绵、山羊的育种历史与现状，探讨了现代生物技术在绵、山羊育种中的具体应用情况，并对目前绵、山羊育种工作存在的几个问题进行思考，对构建我国绵、山羊育种技术体系，提高育种效率和技术水平，实现优质高效绵、山羊育种关键技术的突破具有重要意义。
关键词：绵羊；山羊；育种；生物技术；思考
Review and reflection of sheep and goat breeding work in China
MA You-ji
（Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070，China）Abstract: In this paper the history and current situation of sheep and goat breeding were reviewed, and modern biological technology application were discussed, several questions in the sheep and goat breeding work were thought.This has important significance for build sheep and goat breeding technology system, improve the efficiency of breeding and technology level, and realize high quality, high level, goat breeding breakthroughs in key technologies.Key words:sheep;goat;breed;biotechnology;reflection
我国是绵、山羊养殖历史悠久的国家，品种资源十分丰富，2011年出版的《中国畜禽遗传资源志·羊志》共收录羊遗传资源140个，其中绵羊71个，包括地方品种或资源42个、培育品种21个、引进品种8个；山羊69个，包括地方品种或资源58个、培育品种8个、引进品种3个[1]。截止到2010年6月先后育成了28个经国家审定的品种，其中细毛羊品种13个、半细毛品种5个、羔皮羊品种1个、奶山羊品种4个、绒山羊品种3个、肉用羊品种2个[1]。根据联合国粮农组织(FAO)2011年统计资料，我国已经跨入世界养羊大国行列，羊的饲养量、出栏量、羊肉产量均居世界第一位，到2011末存栏羊
2.81亿只，其中山羊1.42亿只、绵羊1.39亿只，70%以上属于肉用或肉毛、肉皮、肉奶兼用品种，年肉产量398.9万吨。随着现代社会经济的发展，人民生活水平的不断改善，对畜产原料的需求趋于多样化，我国的绵、山羊品种资源、结构正在逐步改变，生产方向也由过去的毛主肉从变为现在的肉主毛从或肉毛兼用，因此培育出生长速度快、产肉力高的绵、山羊品种成为育种方向[3]。然而，由于目前我国绵、山羊育种技术集成创新力度不足，育种的技术水平和效[2]
作者简介:马友记（1976-），男，副教授，硕士生导师，研究方向为羊育种与繁殖, E-mail:yjma@gsau.edu.cn 项目资助：国家科技支撑计划项目（2011BAD28B05）和国家现代肉羊产业技术体系（CARS-39）资助
率还比较低下，致使拥有自主知识产权的优质肉羊品种相当匮乏，现有品种贡献率低，市场竞争力差，加上千家万户分散养殖、饲养管理粗放、生产方式落后以及良种覆盖率低，造成出栏羊胴体重仅有世界平均水平的79%，高档羊肉的比重不足5%。为此，回顾我国绵、山羊育种工作的现状，构建我国绵、山羊育种技术体系，提高育种效率和技术水平，实现我国优质高效绵、山羊育种关键技术的突破，对推动我国养羊业生产水平及其产业化进程已显得十分必要和紧迫。[4]
一、中国现代绵、山羊育种工作进展
新中国成立63年来，我国养羊生产和育种工作取得长足进展。特别是改革开放30年来，随着农业生产结构的调整和农村经济的全面发展，我国养羊生产快速腾飞，养羊业已经成为发展农村经济的一个重要支柱产业。目前，我国已经跨入世界养羊大国行列，其饲养量、出栏量、羊肉产量均居世界第一位。
新中国成立之初国家收集分散在民间的品种资源，兴办多座大型种羊场，并先后从前苏联、德国、英
国、澳大利亚、新西兰等国引进大批细毛羊、半细毛羊、羔皮羊和奶山羊，在东北、西北、中原、西南等地建立原种基地，进行纯种繁育和杂交改良。
1954年在新疆巩乃斯种羊场经20余年的杂交、选育，培育出我国第一个毛肉兼用细毛羊品种—新疆细毛羊，结束了我国没有细毛羊品种的历史。与此同时，开始了对湖羊、滩羊、济宁青山羊、中卫山羊等裘羔皮羊本品种选育工作。
1957年农业部召开绵羊改良座谈会，明确了当时绵羊改良的工作重点就是把粗毛羊改造成为同质细毛羊。1959年成立东北细毛羊育种委员会，20世纪60年代引入半细毛羊万余只，在内蒙古、安徽、山东、湖北、青海、甘肃、四川、云南等省区进行纯繁，开展杂交试验，以期望获得羊毛细度48/50、56/58支的半细毛羊，并制定了本品种选育和新品种培育计划。
1965年全国畜禽育种工作会议上提出了不同地区羊的选育方向。1972年引进澳洲美利奴羊29只，与波尔华斯羊、新疆细毛羊杂交，培育高质量的良种细毛羊；1973年召开全国半细毛羊育种经验交流会，制定了《全国半细毛羊育种协作计划》和《关于半细毛羊育种若干技术问题的意见》。
1977年，国家相关部门联合制定《全国家畜改良区域规划》，提出要大力发展细毛、半细毛改良羊，提高绵山羊的产品率和质量，对我国良种应设种羊场和良种繁育基地，开展本品种选育和繁殖推广工作。这是新中国成立后制定的最全面的一个羊的改良方案，促进了此后的绵山羊育种工作和
地方品种的改良。
1979年6月，成立“全国半细毛育种委员会”。1981年该委员会决定创办《中国半细毛羊》杂志，1984年更名《中国养羊》。
1982年8月在北京召开“中国羔皮羊、裘皮羊研究会”，研讨了育种和生产方面的重大问题，对我国羔皮、裘皮羊生产的发展起了一定的推动作用。
1985年新疆、内蒙、吉林联合育成了中国美利奴羊，实现了细毛羊品种质的飞跃，使中国细毛羊开始进入世界优质细毛羊的行列。接着又开展培育中国美利奴羊毛密品系（新疆、内蒙、吉林）、多胎品系（新疆）、体大毛质好品系（新疆）、无角类型（新疆）以及建立中国美利奴羊品种结构新体系（吉林）等研究工作。
1987年在山东文登召开“全国奶山羊生产工作会议”，提出了进一步开展中国萨能奶山羊选育的技术方案。
进入20世纪90年代，国际市场对细度在21.5微米以下羊毛的用量和羊肉需求量逐年增加，我国养羊业的发展方向开始从“养羊为产毛，淘汰才吃肉”的传统方式，向“以肉为主，肉主毛从，肉毛兼顾，综合开发”的生产方向发展，并形成了优质细毛羊和专门化肉用品种两个绵羊选育方向，养羊结构发生了相应的变化。
当前，肉羊产业以投资少，见效快影响着世界养羊业的发展，相继从国外引入多个绵、山羊品种来改良我国的地方羊种，目的就是生产质优价廉的羊肉和为新品种培育提供育种素材。利用国内外绵、山羊的遗传资源，先后培育出了对高纬度寒冷地区、冷季饲料不足地区具有良好适应性的阿勒泰肉用细毛羊；体格大，生长发育快，四季发情，繁殖率高，泌乳力好，抗病力强，耐粗放饲养，适应能力强，产肉力高和皮板品质好的南江黄羊；肉品质好，对酷热、严寒环境都有较好的适应性，在大群饲养、分散饲养和舍饲、放牧荒漠条件下，都能表现稳定生产性能的中国美利奴羊肉用品系；在荒漠、半荒漠自然条件下，无论炎夏还是-30℃的严冬，均表现出良好生产性能的中国美利奴羊肉用多胎品系；适合舍饲圈养、耐粗饲、抗逆性强、适应性好、羔羊育肥增重快、性成熟早等特点的巴美肉羊。集成我国优良地方绵羊品种小尾寒羊繁殖率高、蒙古羊耐粗饲及引进肉用绵羊品种无角陶赛特羊和波德代羊生长发育快等优良性状的甘肃肉用绵羊新品群。通过这些肉羊新品种（系）的培育，基本在局部生态区形成了肉羊繁育体系和产、加、销一体化的现代肉羊产业化发展雏型，并在一些高效育种关键技术方面有所突破。
二、中国绵、山羊育种存在的主要问题
尽管我国在引入国外优良品种、开展杂交改良、新品种培育以及在地方品种选育提高方面做了[5]
大量的工作，取得了显著成效。但时至今日，我国羊良种化程度依然不高，大大影响了我国养羊业的总体生产水平和产品质量，致使我国养羊业与发达国家相比仍有一定的差距，主要表现在以下几个方面：
2.1育种基础设施薄弱，资金投入严重不足我国肉羊主产区多处于牧区和农牧交错带，总的看来这些地方政府、企业和养羊户都缺乏经济实力，而国家在育种经费、人力等投入上又滞后于猪、禽，致使种羊场、繁育场、改良站等基础建设缺乏资金投入，种羊生产和利用的配套设施相对落后。特别是育种的长期性与市场短期行为的矛盾造成许多国有育种场和扩繁场或名不副实，或倒闭破产，或虽能维持，但处境艰难，而企业投资建设的种羊场多以炒种为主，市场行情好时抬高种羊价格，市场行情不好时转行，所发挥的作用有限。
2.2种质创新研究和肉羊育种水平与生产的实际需求差距巨大尽管我国拥有丰富的绵、山羊种质资源，但是资源的挖掘利用和创新能力不强，除对繁殖性状研究较为系统外，其它高产及优质、抗逆性状一直未得到系统的研究。尽管我国开展育种的科研、教学、国有事业单位多，但存在研究力量分散和经费无法保证的现象，而且我国没有全国性的羊育种协作组织，也没有全国的肉羊遗传改良规划，从事育种的单位基本上各自为阵，没有分工协作，更没有开展联合育种，出现有项目经费就育、项目结束就不育的现象，育种工作往往前功尽弃。
2.3地方资源选育利用不够我国绵、山羊品种资源丰富，地方品种的优良特性除繁殖力高外，还有品质优良、抗应激、适应性强等特性，但由于经费短缺或认识上的缺陷，对这些优良特性的开发还不够充分，加上国外引种热，造成地方品种“只繁不育”，逐步失去其竞争优势和推广利用。但是作为一个拥有13亿人口的大国，解决羊肉短缺的问题仅仅依靠国外品种来杂交改良地方品种提高羊肉产量的做法是不现实的，何况培育出适合我国具有自主知识产权的肉羊品种也不可能—蹴而就，因此地方品种遗传资源的开发利用亟待加强。
2.4肉用绵羊性能测定和品种登记尚未实施，种羊质量没有保证由于我国尚未实行肉用绵羊生产性能测定和品种登记制度，种羊从羊场直接流入市场，对种羊质量缺乏有效监督，以次充好、以假乱真现象常有发生，种羊场普遍存在“重引进，轻选育”的现象，肉羊育种和生产企业的规模化、产业化水平亟需进一步提高。
三、关于绵、山羊育种工作的几点思考
目前，我国养羊业生产水平总体来说还很低，养羊业中的科学研究跟不上生产的发展，特别是“黑板上养羊，实验室搞育种”现象的出现造成科学研究中重实验室研究，轻与生产实践相结合，创新技术和成果少，应该引起广大养羊科技工作者的思考。
1、关于炒种、倒种误导生产的思考近年来，由于优秀种公羊的短缺，从而导致个别企业或个
人炒种、倒种现象时有发生，造成种羊价格过高，一般的农牧户买不起，严重地挫伤了养羊者的积极性。另外关于小尾寒羊或湖羊，我们应该利用用其所长，克服其短，在适宜饲养绵羊，并且生态经济条件较好的地区，如引入小尾寒羊或湖羊作为母系品种与专门化肉用品种公羊进行杂交育种，或为了加快羊的繁殖，缩短世代间隔，用其作为胚胎移植受体，应该是很好的选择，最近几年的生产实践证明，利用小尾寒羊或湖羊“炒种”的做法是欠妥的。
2、关于重引进、轻培育的思考各级政府部门和科研机构花巨资相继从国外引进大量优良绵、山羊品种，用于改良我国地方品种和作为培育新品种的素材，但对地方品种改良存在一定的盲目性，未进行专门的配合力测定，加之不重视选育，优良基因不断流失，群体遗传水平逐年下降，杂交后代生产性能呈现下降趋势。我国现有一些优秀的地方品种，由于对品种选育重视不够，逐步失去其竞争优势。
3、关于生物技术应用的思考生物技术的兴起促进的家畜育种的飞跃，但有两点，其一是由于生物技术是一个新兴的学科领域，许多理论、方法和技术仍处在研究发展阶段，对其在育种中的应用也将随之进一步延伸和扩展，因此，我们在绵、山羊育种工作中使用这些技术推广应该及时吸收这一领域的新成果、新认识，不断完善这些生物技术在绵山羊育种中的应用；其二，现代生物技术实际上是在传统常规技术基础上发展起来的，事实上单凭这些生物技术无法解决羊育种中的所有问题，常规育种技术必须与现代生物技术相结合，才能建立整体的现代绵、山羊育种体系。
4、关于育种合理规划的思考目前养羊生产格局基本形成，并进行了肉羊优势产区规划，分为中原、内蒙古中东部及河北北部、西北和西南4个肉羊优势产区，促进了养羊业的健康持续发展[10]。各地自然条件、饲草资源、品种资源各不相同，应根据本地自然条件，进行市场分析和产品定位，制定合理的产业发展规划，决不能搞“一刀切”。特别是生态经济薄弱地区，盲目引进，盲目发展，加上主管部门对羊产业发展和羊品种培育尚无统一的规划和指导，无序地发展造成了大量财力、人力的浪费，因此搞新品种一定要认真研究，科学规划，慎重行事。
5、关于加强对羊育种工作的统筹协调的思考在刚刚召开的全国畜禽遗传资源委员会会议上明确提出要建立适合不同主产区高产优质育种核心群和跨区域的联合育种体系，那么如何建立是摆在养羊科技工作者面前亟需解决的问题。虽然用引入优质肉羊品种进行杂交有相当规模和基础，但可开展新品种培育的群体分散于不同的单位，群体规模小、各单位技术水平参差不齐等是采集数据、建立遗传评估体系的拦路虎。结合我国肉羊、细毛羊和绒山羊育种情况建议尽快协调成立相应的全国羊育种协作组，制定并实施全国的羊种质资源利用方案和遗传改良计划，指导不同类型、不同地域的羊育种工作。通过农业部的良种建设工程、产业技术体系资金、行业科技专项等项目资助，给育种场和育种项目至少10年以上的长期稳定支持，使育种工作有连续性，切实解决羊育种长期性与
市场短期行为的矛盾性，防止前功尽弃。
6、关于建立育种核心群补贴制度的思考根据羊繁殖周期长、繁殖率低、冷冻精液受胎率低、育种和改良过程中需要的种羊数量多及世代间隔与育种周期长、育种场经济效益差等特点，建立育种核心群补贴制度，对核心群羊只特别是基础母羊给予补贴，确保育种核心群的稳定。
四、小结
近年来，我国羊遗传繁育研究从理论、方法、技术到育种实践各方面，均取得很大进展。可以预见，随着研究的不断深入和国家对绵、山羊育种工作的投入加大，一定会使选种的准确性逐渐提高，必将推动育种再上一个台阶，也会促进绵、山羊的经济用途更加宽广。
参考文献
1.国家畜禽遗传资源委员会组编.中国畜禽遗传资源志·羊志[M].北京：中国农业出版社，2011
2.联合国粮农组织[EB].http:///corp/statistics/en/
3.马友记，李发弟.中国养羊业现状与发展趋势分析[J].中国畜牧杂志，2011，47（14）：16-20
4.赵有璋主编.羊生产学[M].北京：中国农业出版社，2000
5.魏彩虹，杜立新.我国肉用绵羊育种现状与未来发展方向[J].中国草食动物科学，2012专辑：
454-457
6.陈建武，龙 华.现代育种理论和育种技术的新思路[J].现代农业科学，2008，3：3-5
7.乔海云，张应禄，赵倩君，等.绵、山羊生产科技支撑现状与未来需求技术研究分析[J].中国畜
1 试验材料
1.1 样品
酿酒酵母:实验室冷冻保藏菌株。
1.2 培养基
液体YPD培养基;固体YPD培养基;TTC上层培养基;TIC下层培养基;发酵培养基;高渗再生完全培养基;渗透压稳定剂;蜗牛酶酶液;脱壁预处理剂
2 方法
2.1 酵母菌原生质体形成与再生条件研究
2.1.1 酵母菌原生质体制备[1]
在YPD培养基斜面上将菌株活化并分别接种于三角瓶中, 30℃振荡培养至对数生长前期。将上述培养液3500r/min离心10min。为了尽可能的避免含有杂质, 将使用无菌水冲洗离心。将亲本细胞悬浮脱壁预处理溶液中, 振荡, 离心收集菌体。将菌体悬浮于3m L的蜗牛酶液中, 30℃振荡培养。对其原生质形态进行跟踪观察, 当形成率达90%以上时, 停止反应, 收集原生质体细胞, 对其进行离心和冲洗以后将细胞悬浮于渗透压稳定剂中。
2.1.2 酵母菌原生质体形成与再生条件正交试验
从表1可以知道酵母菌原生质体形成与再生的最佳条件是通过酶解时间, 蜗牛酶浓度, 选取脱壁预处理时间这三个因素的三水平正交试验得来的。
2.1.3 酵母菌原生质体形成率与再生率[2]的计算
1) 总菌落数;
2) 未形成原生质体的菌落数;
3) 酶处理后未形成原生质体的菌落数和原生质体再生的菌落数之和:
原生质体形成率 (%) = (A-B) /A×100%
原生质体再生率 (%) = (C-B) / (A-B) ×100%
2.2 原生质体紫外诱变育种
2.2.1 酵母菌原生质体紫外诱变株[3]的筛选
取原生质体菌悬液于无菌平皿中, 对原生质体细胞进行紫外诱变, 将照射后的菌液直接涂布于高渗再生平板和固体YPD平板, 置于30℃避光恢复培养。然后将菌落分别接种于斜面平板。
1) 初筛 (TTC法)
在一定培养基上培养的酵母菌落上与TTC显色剂会呈现不同的色差反应, 当颜色为白色时, 可能为野生菌落, 当颜色为深红时, 可能是产量高的菌落, 当为粉红时可能产量要弱些。在TTC下层培养基中接入诱变后的菌株, 培养24h, 长出菌落, 然后倒入TTC上层培养基, 30℃下保温 (阴暗处) 2h~3h。比较各菌株之间的产酒精能力。
2) 复筛
将含有发酵培养基的三角瓶中接入初筛时使用TTC法筛出的的优良菌株并按10%的比例接入酵母菌株, 于30℃下静止发酵。每隔12h测一次二氧化碳失重, 72h后可以认为发酵结束, 发酵结束后测定发酵醪液酒精浓度、残糖。
2.2.2 各参数的测定方法
1) 残还原糖量[4]:DNS法;2) 发酵醪液酒精浓度[5]:蒸馏法;3) 二氧化碳失重的测定:直接称重法。
3 结果与讨论
3.1 酵母菌原生质体形成与再生条件研究
酵母菌原生质体形成与再生正交试验结果:
由表2可知, 在脱壁预处理20min, 然后1%的蜗牛酶酶解0.5h的条件下, 得出原生质体形成率为和再生率分别为89.7%和19.3%。
3.2 诱变株的筛选
为保证得到性状优良的突变菌株, 本试验采用了紫外诱变方法对酵母菌株进行原生质体诱变。最终从再生平板中共得到20株诱变株。经过初筛 (TTC法) 得到5株呈现深红色的酵母菌落。再将这5株菌株经过复筛得到各个菌株的发酵特性。
由表3可知, 相对于出发菌株W酒精产量有所提高的诱变株有3株, 占所有突变株的比例为15%。其中突变株W9产酒精量最高, 为6.0%, 相对于出发菌株W产酒精量提高了22.95%。残还原糖含量为6.08mg/m L, 相对于出发菌株W的6.35mg/m L, 相差不大。负突变株W10产酒精量最低, 仅为4.12%。
4 结论
1) 通过对原生质体形成与再生正交试验而得到最佳条件如下:在先脱壁预处理20min, 然后1%的蜗牛酶酶解30min的条件下, 得出原生质体形成率为和再生率分别为89.7%和19.3%;
2) 通过初筛和复筛, 获得5株在发酵性能上优越的菌株, 初筛中的定性筛选是一个高通量的分析, 明确删除不符合要求的发酵能力弱的菌株。复筛是一个定量分析, 可以将高产酒精的菌株给筛出。本次试验在筛选的初筛中加入了TTC显色剂, 因此在初筛的时候删去发酵能力弱的菌株, 减少了复筛的使用率, 说明TTC对于筛选高产酒精酵母菌也很有用;
3) 采用原生质体紫外诱变方法, 选育得到一株遗传性状稳定的突变株W9, 发酵72h后, 其成熟醪酒精体积分数为6.0%, 残还原糖含量为6.08mg/m L, 对比出发菌株W, W9产酒精量提高22.95%。
参考文献
[1]詹萍, 苏龙, 周乃东.红酵母原生质体制备和再生条件研究[J].安徽农业科学, 2010 (3) .
[2]张华山, 等.酿酒酵母与糖化酵母原生质体的形成与再生[J].武汉理工大学学报, 2006 (7) .
[3]曹礼, 等.酿酒酵母菌的紫外诱变及其突变株的性能测[J].中国酿造, 2009 (10) .
[4]黄洁, 等.苹果发酵液中残余还原糖的测定方法比较[J].工业微生物, 2001 (3) .
关键词：EMS；化学诱变；小麦育种；研究；应用
中图分类号： S512.103.52文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0080-03
收稿日期：2013-11-20
基金项目：江苏省连云港市科技计划农业攻关（编号：CN1202、CG1128）。
作者简介：任立凯（1981—），男，江苏徐州人，副研究员，主要从事小麦育种工作。E-mail：renlikai@163.com。小麦EMS（ethyl methane sulfonste，中文名：甲基磺酸乙酯）诱变育种技术就是用EMS作为化学诱变剂处理小麦，诱发其遗传基因突变，使在短期内获得有利用价值的突变体，从而为种质创新、新品种培育及基因功能的研究等创造条件。小麦EMS诱变育种与常规育种相比，具有种质创新频率高、遗传变异谱宽、育种周期短等特性，有效弥补了小麦常规育种方法短时间难以获得新性状和新基因的不足，为丰富遗传背景、完整构建小麦种子资源库提供支持。
1EMS诱变育种机理及诱变效应
EMS是一种改变 DNA 结构的烷化剂。自1953年Kolmark首次研究报道双环氧烷可以有效诱导物种突变[1]，烷化剂就广泛应用于作物的诱变育种，至今已走过60年的历程。烷化剂带有的活泼烷基能够转移到其他电子密度高的DNA分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，正是这种烷化作用改变了氢键的能力，导致DNA结构发生变化。烷化剂中的功能烷基并不是越多越好，烷基越多带来的毒性越大，可致供试材料死亡，因此，育种中常用含单功能基的EMS进行处理材料。EMS的烷化作用主要发生在 DNA鸟嘌呤（G）N-7位置上，烷基取代H离子后，使之成为1个带正电荷的季铵基团，并产生2种效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即G—C变为A—T，发生转换型的突变；二是鸟嘌呤的N7烷基活化为季铵基团，减弱了N9位上的N-糖苷键，致糖苷键断裂造成脱嘌呤。尽管大部分的无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统所修复，但是有时复制在修复之前进行，脱去鸟嘌呤的DNA分子会在进一步复制时，原来的鸟嘌呤位置成了1个空位，其互补位置上的碱基就不受严格的配对限制，4种碱基都有机会进入，原来的G—C对可以变为任何碱基对如G—C、C—G、A—T、T—A，既有转换又有颠换，这种单一碱基对改变而形成的点突变是品种改良和退化特性恢复的价值所在。此外，EMS还可与核苷结构的磷酸发生反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断，产生染色体的缺失，从而造成置换现象。EMS所诱发的DNA结构上的变化，都可能促使不表达的基因或区段被激活，并让被掩盖的性状表现出来[2-3]。
EMS诱变频率与其他诱变剂相比，其诱变后产生的显性突变体相对较多，易于进行突变体筛选。另外，EMS化学诱变产生高频率的点突变，致使染色体畸变相对较少，生理损伤轻，在用于对诱变对象的某一特殊性状进行改良时，容易得到高产、优质的突变体。EMS诱变范围广，产生的突变体类型也相对更丰富[4]。
2小麦EMS诱变育种的研究进展
研究人员用EMS处理大麦种子成功获得突变体[5]后，就开启了EMS在小麦育种上应用的大幕，并经多年不懈探索，EMS诱变育种技术在小麦突变体筛选鉴定、种质改良创新等方面取得了很大进展。在国外，Kuraparthy等从构建EMS突变体库中筛选到控制分蘖的tin3基因，提高了小麦的有效分蘖[6]。Yasui等利用0.5% EMS乙醇溶液（乙醇濃度7%）诱变处理面包小麦cv.Kanto种子，在M2种子中发现了糯质小麦突变体，经过多代选择鉴定，在世界上首次育成了糯质普通小麦新品系K107wx1和K107wx2[7]。Bernd等用EMS诱导出1个小麦Ge2突变体[8]。Colbert等通过EMS创建了2 500 株普通软质小麦突变体库，并推算发现，每12 kb就会有一突变体产生，其创制的突变体库是目前报道突变频率最高的[9]。Slade等创建了普通小麦和硬粒小麦的突变体库，同时以小麦颗粒淀粉合成酶Ⅰ（granule bound starch synthase Ⅰ，GBSSⅠ）基因片段为引物，筛选出1 920个糯性基因小麦突变体，在此基础上，进一步将EMS化学诱变技术与定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING）相结合，从中再筛选到了246个等位基因，获得了更加丰富的遗传信息和有价值的突变个体，并育成糯性较好的小麦新品种[10-11]。
在国内，EMS诱变育种技术也取得显著进展。（1）在抗性诱变育种方面，张晓勤等利用EMS诱变获得了大麦抗叶锈病、早熟等突变体[12]；陈洋等用EMS处理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系YW642种子，从M2中筛选出32类不同性状的突变体73株[13]，为小麦抗黄矮病基因克隆和功能基因组学的进一步研究奠定了坚实的材料基础；姚秋燕等以EMS为诱变剂进行抗条锈Yr近等基因系筛选毒性变异，结果表明，弱毒性菌株CY17和强毒性菌株CY31为小种毒性突变的出发菌株，并证实毒性突变是小麦条锈病菌毒性变异的重要途径[14]，这为小麦条锈菌致病基因和无毒基因的克隆创建了材料；沈银柱等以盐迫为选择压力，利用EMS诱发小麦花药愈伤组织获得耐盐再生植株，获得的耐盐变异株离开盐胁迫3代后经盐池鉴定，后代中有52.9%的品系达到一级耐盐，表现了一定的遗传稳定性，耐盐品系的结实率也逐渐得到恢复，达到92.4%[15]；王瑾等用EMS对温麦6 号和周麦17的花药愈伤组织和幼胚愈伤组织进行处理，对EMS诱变处理后分化的224株再生植株，接种到PEG浓度为80 s/L的生根培养基中进行抗旱筛选，共得到13株抗旱植株，平均变异率为5.8%[16]。（2）在小麦EMS诱变材料的选择方面，其范围已从常用种子处理扩展到对花粉、分生组织、愈伤组织等的处理，这样使EMS诱变摆脱了植物生命周期的限制，提高了突变率。施巾帼等用0.3%～0.4%EMS处理冬小麦品种“农大139”授粉7～13 h的休眠合子，发现其M1损伤明显，M2代的有益突变频率达12.5%[17]；许耀奎等用化学诱变剂EMS处理春小麦合子，发现合子总突变率为7.91%，比种子处理高405%，合子期处理的突变率是种子期处理的2倍多[18]；周祉祯等用浸泡法处理春小麦合子，发现处理受精卵的突变率是处理种子的2.25倍[19]；崔秋华等采用注射法以不同浓度EMS处理春小麦活体植株的幼穗，染色体畸变率和微核率明显提高，并发现EMS 在0.1%～0.2%浓度下，染色体畸变率高、出愈率低，高浓度EMS处理降低了出愈率[20]；朴连恩等利用EMS处理小麦合子，进行小麦高蛋白突变体的诱发、筛选和鉴定研究，获得了比原品种蛋白质含量高3%～4%的突变体[21]。（3）在小麦种质改良创新、品种选育方面，赵天祥等利用EMS突变技术创建了小麦品种偃展4110的突变体库，并进行形态学分析和鉴定，获得了幼苗、叶、茎、穗及成熟期等生物学特性与主要农艺性状的变异体和突变体，特别是发现了自然突变中少见的变异类型，如株高在10～15 cm左右的特矮变异类型[22]；蒋方山等以EMS处理获取小麦基部小穗不孕突变体材料，观察农艺性状与基部不孕小穗的关系，构建了饱和突变体基因库[23]；薛芳等在高抗性淀粉诱变育种中以春小麦新春11为材料，筛选出7个抗性淀粉含量高且综合性状优良的M2突变家系[24]；中国科学院石家庄农业现代化研究所利用EMS处理冬小麦品种，M1代变异率达到15.7%以上，获得9个早熟、矮秆突变系，比原品种增产2.8%～205%；徐艳花等通过EMS 诱变获得722份叶、茎、穗和其他性状发生变异的突变体，利用SDSPAGE 对突变体的高分子量麦谷蛋白亚基进行分析筛选，共发现有21个缺失不同类型亚基的突变体[25]；施巾帼等利用0.3% EMS与200 Gy γ射线复合处理原东3号小麦品种，选育出了抗逆性和适应性强、落黄性好、对条锈与白粉病具有持久抗性、株高85 cm的矮原东3号；李劲松等利用EMS诱变育成了抗条锈、根腐病能力较强的面包型春小麦新品种甘春20号[26]。
nlc202309041358
3小麦EMS诱变育种技术在连云港的应用
连云港市为黄淮海中强筋专用小麦生产优势区。近几年，通过与南京农业大学较深入的科研合作，开展了小麦EMS诱变育种技术应用研究，重点在3个方面取得了一些进展。
3.1利用EMS创建了连麦2号突变体库
用0.7%EMS磷酸缓冲液对自育主栽品种连麦2号种子进行诱变处理，对获得的 M2 代植株进行农艺性状表型筛选，获得802份叶、茎、穗和其他性状如育性、生育期、早衰等发生变异的突变体，其中，叶片性状突变151份、茎性状突变174份、穗部和籽粒性状突变197份、育性突变64份、生育期突变102份、早衰突变32份、落黄性突变28份、不抽穗突变47份、死亡突变7份，突变频率分别为1.83%、2.11%、2.39%、078%、1.24%、0.39%、0.34%、0.57%、0.08%。 为黄淮麦区初步构建了适合当地种植、突变基因丰富的连麦2号 EMS突变体库，为本地区小麦功能基因组研究和新品种选育提供了基础材料。
3.2EMS对小麦耐盐性诱发突变效果较好
从2007年至今，利用EMS诱变技术进行小麦抗盐突变体研究，并结合盐浓度梯度对M1、M2进行胁迫方法筛选，这种定向筛选方法对抗逆品种的筛选特别有效。目前，筛选出耐盐种质中间材料12份，这些材料均在不同程度上表现出优良的耐盐特性和较好的遗传配合力。其中，一些已直接纳入系圃进行系统选育，并已选到2个特异性突出的穗行，分别为耐盐早熟的M582-16和耐盐抗倒的M26-7-2；还有一些作为耐盐亲本中间材料参与构成新的常规组合，如用耐盐性强的中间材料M62-503组配了3个组合0765×M62-503、（0709×济22）×M62-503、5152×M62-503，在含盐045%的鉴定圃上盐害指数分别仅为0.21、0.34、0.28，其产量分别比亲本对照高6.9%、8.1%和9.7%，表现出了较好的综合抗逆特性。
3.3EMS对小麦粒重诱发突变效果明显
在黄淮海麦区小麦产量构成中，粒重是影响产量构成要素的短板。随着施肥水平的提高，小麦育种应以增加穗粒重为主攻方向。选用当地表现适应性强、综合性状良好的主栽品种烟农19和淮麦20，用0.5% EMS进行诱变，并对诱变后代粒重突变进行选择，取得了明显的选择效果。共选中突变系86份，千粒质量变幅为32.7～58.1 g，48 g以上8份，比原亲平均千粒质量45.2 g高2.8 g；穗粒增重0.33～0.73 g的有13份，增加5 g以上的有2份，其中，突变系M20l -7千粒质量 54 g，增加6.8 g，且綜合性状较好；突变体M301-07-4千粒质量达58 g，较原亲本增加12.8 g，主穗粒重增加 0.64 g，株高在 105 cm 左右，落黄好，是珍贵的大粒资源。
4展望
小麦EMS诱变育种可以创造新的种质资源，在小麦育种实践中发挥不可替代的作用，但是，应清楚认识到化学突变很多都是不定向的，有些突变会对诱变育种不利。有效添加选择压来控制诱变方向，实现定向诱变，进一步提高化学诱变的效率，并对突变后代各变异类型的发生频率及遗传规律进行高效分析，对提高突变体的利用效率和选择的准确性进行深层次的研究，这是EMS诱变育种努力的目标。
参考文献：
[1] Kolmark G.Differential response to mutagens as studied by the neurospora reverse mutation test[J]. Hereditas，1953，39（1/2）：270-276.
[2]梁任繁，何龙飞. EMS在作物育种应用中的研究进展[J]. 种子，2008，27（2）：47-49.
[3]徐冠仁. 植物诱变育种学[M]. 北京：中国农业出版社，1996：63-74，436-448.
[4]Bird RM，Neuffer M G.Induced mutation in maize[M]//Janick J. Plant breeding review：volume 5. New York：Van Nostrand Reinhold，1987：139-180.
[5]许耀奎. 作物诱变育种[M]. 上海：上海科学技术出版社，1985：219-222.
[6]Kuraparthy V，Sood S，Dhaliwal H S，et al. Identification and mapping of a tiller inhibition gene （tin3） in wheat[J]. Theory Application Genetic，2007，114（2）：285-294.
[7]Yasui T，Sasaki T，Matsuki J，et al. Waxy endosperm mutants of bread wheat（Triticum aestivum L.） and their starch properties[J]. Breading Science，1997，47（2）：161-163.
[8]Bernd F，Zhang P，Nasuda S，et al. Characterization of a knock-out mutation at the Ge2 locus in wheat[J]. Chremosoma，2003，111：509-517.
[9]Colbert T，Till B J，Tompa R，et al.High-throughput screening for induced point mutations[J]. Plant Physiology，2001，126（2）：480-484.
nlc202309041358
[10] Slade A J，Knauf V C.TILLING moves beyond functional genomics into crop improvement [ J ]. Transgenic Research，2005，14：109-115.
[11]Slade A J，Fuerstenberg S I，Loeftler D，et al.A reverse genetic，nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING [J]. Nature Biotechnology，2005，23：75-81.
[12]張晓勤，薛大伟，周伟辉，等. 用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变的大麦浙农大3号突变体的筛选和鉴定[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2011，37（2）：169-174.
[13]陈洋，高兰英，邵艳军，等. EMS诱导小麦易位系YW642突变体的鉴定与分子标记分析[J]. 核农学报，2011，25（4）：617-621.
[14]姚秋燕，王国芬，徐智斌，等. EMS诱导小麦条锈菌毒性突变的研究[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2006，34（6）：120-123.
[15]沈银柱，刘植义，何聪芬，等. 诱发小麦花药愈伤组织及其再生植株抗盐性变异的研究[J]. 遗传，1997，19（6）：7-11.
[16]王瑾，刘桂茹，杨学举，等. EMS诱变小麦愈伤组织选择抗旱突变体的研究[J]. 中国农学通报，2005，21（12）：190-193.
[17]朱校奇. 农作物化学诱变育种的研究进展[J]. 核农学通报，1990，11（3）：101-103.
[18]许耀奎，邬信康，张富琴，等. 化学诱变剂EMS对春小麦诱变效应的研究[J].作物学报，1985，11（3）：215-216.
[19]周祉祯，谷爱秋，王钦南，等. 在处理春麦合子上化学诱变的效果[J].遗传学报，1980，7（4）：341-346.
[20]崔秋华，许耀奎. EMS处理小麦幼穗的细胞学效应及其对花药培养的影响[J]. 核农学报，1989，3（2）：104-111.
[21]朴连恩，于秀普，魏玉昌，等. EMS处理小麦合子诱变筛选高蛋白突变体[J]. 河北农业大学学报，1990，13（4）：94-96.
[22]赵天祥，孔秀英，周荣华，等. EMS诱变六倍体小麦偃展 4110的形态突变体鉴定与分析[J]. 中国农业科学， 2009，42（3）：755-764.
[23]蒋方山，郭营，许云峰，等. EMS诱变的小麦基部小穗不孕突变体的鉴定与小穗形态发育[J]. 麦类作物学报，2008，28（2）：249-253.
[24]薛芳，褚洪雷，胡志伟，等. EMS对新春11小麦抗性淀粉和农艺性状的诱变效果[J]. 麦类作物学报，2010，30（3）：431-434.
[25]徐艳花，陈锋，董中东，等. EMS诱变的普通小麦豫201突变体库的构建与初步分析[J]. 麦类作物学报，2010，30（4）：625-629.
[26]庄巧生，杜振华. 中国小麦育种研究进展[M]. 北京：中国农业出版社，1996：366-371，480-485.乔海龙，陈和，陈健，等. 盐胁迫对不同大麦品种产量及品质的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：83-86.
