膀胱组织学分层（精选4篇）
膀胱替代的组织工程策略
曾晓勇杨为民
1[摘要]
组织工程学是应用细胞生物学和生物材料学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门新兴科学。近年来，组织工程学的蓬勃发展为膀胱替代提供了崭新的思路。尤其进入21世纪以来，随着干细胞研究的深入和新的生物材料不断出现，使应用组织工程技术再造的新膀胱从实验室走向临床成为可能。本文就组织工程膀胱替代的基础研究和临床应用的发展和现状进行了概述。[关键词]
膀胱替代 组织工程
Tissue engineering-approaches of bladder replacement
Zeng Xiaoyong, Yang Weimin（1Department of Urology, Tongji Hospital ,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,430030,China）
Abstract Tissue engineering(TE)is an emerging multidisciplinary field involving cell biology, medicine, biomaterials that is to restoring, maintaining, or enhancing tissue and organ function.The prosperous advancement of TE in recent decades provided a new approach to bladder replacement.In the 21st century, particularly, it will be a great possibility that regenerating 1 基金项目：国家自然科学基金（30700171）;华中科技大学医工、医理交叉基金（2006）[通讯作者] 杨为民（wmyang@tih.tjmu.edu.cn）a neo-bladder via TE-approach transforms from bench to clinic, with booming researches of stem cells and new biomaterials.The basic research and clinical development regarding bladder replacement via TE are summarized in this article.Keyword: bladder replacement;tissue engineering
临床上利用胃肠道行膀胱替代至今已有100多年的历史。除空肠外，从胃到直肠的消化道各段均被人们尝试用于新膀胱或尿流输出道的构建。然而由于胃肠粘膜分泌与吸收等难以克服的因素引起的并发症如肠粘液分泌、电解质紊乱、结石形成等等，始终困扰着这项古老的膀胱替代技术。近年来，组织工程学(Tissue Engineering)的兴起为膀胱替代提供了一种新的思路。
组织工程一词最早是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的。它是应用细胞生物学和工程材料学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学[1]。上个世纪后叶，组织工程学的诞生和迅速发展被誉为现代医学继细胞生物学和分子生物学之后的第三个具有里程碑意义的重大事件, 它是一门由生命科学、材料科学和工程技术学相结合交叉的边缘学科。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞—生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。它是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学领域又一新的发展里程碑，标志着传统医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代, 从而着眼从根本上解决组织和器官病损或缺损所致的功能障碍或因此引起的器官移植所具有的免疫排斥、供体器官缺乏等诸多问题。组织工程学技术方面的研究主要集中在以下三个方面: ①细胞生长调节因子：寻找并提取组织分泌产生的生化物质, 这些由组织分泌或产生的生化物质(如生长因子、细胞活素、抗体类物质)来源于有活性的细胞, 将提取的此类生化物质或某些功能蛋白质成份种植在适当的基质中, 使机体损失的某些组织及功能成功的得到修复或恢复；②种子细胞：分离功能细胞制成代用品, 机体内接种一群结构相似, 功能相关的细胞, 以代替缺失组织和器官的某些特定功能；③细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)及可降级的细胞支架材料的研究。
组织工程的研究几乎涵盖各个机体重要的组织器官，如骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、肌腱、心脏瓣膜、血管、角膜、皮肤等等[2-4]。泌尿道（尿道、膀胱、输尿管）的重建也是组织工程较多涉及的领域之一[3,5]。组织工程的膀胱替代的研究由来已久，早在1917年neuboff 就应用筋膜行狗的膀胱扩大术实验，而真正意义的膀胱的组织工程重建只是近10余年的事情。总结近年的研究成果，膀胱组织工程重建的基本策略主要有以下几个：
1.复合肠代膀胱术
复合肠代膀胱术（Composite enterocystoplasty）是对传统的肠代膀胱术的改良，其主要设计思路是在体外培养扩增正常的人尿路上皮细胞（normal human urothelial, HNU）,并种植在可降解的膜状细胞支架上，然后将HNU和膜的复合体移植于准备行膀胱替代的去粘膜肠管的内层，构建覆有尿路上皮的肠管以行膀胱替代术。作为种子细胞的HNU可来源于自体、同种异体或异种组织，以自体组织为首选[6]。传统上认为尿路上皮细胞普遍存在培养老化问题，因而难以在体内长久保持增殖活力和功能。Scriven 等研制的角化细胞无血清培养基初步解决了这个问题，采用他的方法可运用1 cm2 活检的尿路上皮标本，8周内获得可覆盖4202 m2 面积的细胞量[7]。Sugasi 等进一步发现体外培养的上皮细胞具有和天然上皮同样的尿液屏障作用，适合组织工程新膀胱的要求[8]。Scriven 等设计了薇荞网（Vicryl® mesh,Vicryl® 为临床常用的可吸收缝线的材料），用以作为承载、移植HNU的细胞支架[9]。Fraser 最近应用这种方法将体外扩增的HNU移植到去粘膜和去管化的的狗的子宫，以此行膀胱扩大术，结果显示，在术后3个月，与对照组相比，新膀胱具有较好的顺应性和较大的容量。组织学检查也显示新膀胱内面有光滑的尿路上皮生长。但也存在的较明显的问题：①有的区域未见尿路上皮生长；②由于不完全的去粘膜化，有的区域仍有子宫粘膜生长。这提示未来的研究仍是尿路上皮粘膜在异源器官的生存问题[10]。
2.无细胞的材料替代
用天然或人工合成的生物材料直接行膀胱替代是膀胱组织工程替代的一种较早期的探索，所用的生物材料一般分为两种：天然材料和人工合成材料。对这些材料理论上基本的要求是惰性材料、较好的生物相容性、无免疫源性和适当的柔韧性。
2.1 天然材料
各种自体的、同源的、同种异源的天然材料曾用于膀胱替代的实验研究，包括皮肤、残余膀胱、大网膜、腹膜、冻干脑脊膜、心包膜、戊二醛处理过的羊膜等等。大多的动物实验显示，这些材料普遍存在免疫排斥、结石形成、移植物皱缩、尿瘘等，此外，受体的残余的膀胱组织细胞也很难长入这些材料。胶原属于细胞外基质的固有充分，经预先脱细胞和交联反应处理的胶原组织显示较好的柔韧性和组织相容性，理论上较符合组织工程膀胱的要求，但经过实际应用发现交联的胶原不利于宿主细胞的长入和生长，也延缓了其在体内的生物降解，这大大增加了结石形成的可能[11,12]。
小肠粘膜下组织（small intestine submucosa，SIS）和膀胱无细胞基质（bladder acellular matrix，BAM）是两种新型的组织工程膀胱替代材料，最近的研究显示两者均具有较好的生物相容性，是较有前途的膀胱替代天然材料。SIS取自猪的小肠粘膜下基质组织，经脱细胞、去免疫处理制备而成，目前已经商品化（OaSIS™），SIS是一种取材于猪小肠的一种异体组织。其在制作时通过去除小肠的粘膜层、浆膜层以及肌层,从而形成一层厚0.1 cm 的膜状组织。其中含有胶原成分以及一些促进组织再生的生长因子,因其与细胞外基质十分接近,而有利于细胞的粘附和生长,其最大优点是没有免疫原性[13-15]。SIS 很早开始便应用于膀胱扩大的研究。Kropp等先后在鼠及狗的身上用SIS 补片进行了扩大膀胱术。术后在补片处的组织学上可见到正常膀胱的三层组织(上皮、肌层、浆膜层),且与正常的膀胱组织难以区分。这提示SIS 可以作为应用于扩大膀胱术的一种材料[15]。与此同时，Vaught等的研究结果也显示应用SIS重建的新膀胱有以下特点: ①有收缩能力;②在组织上可见胆碱能、嘌呤原、β-肾上腺素能受体;③再生组织受胆碱能、嘌呤原神经支配。这些特点与正常组织相似,从而进一步支持用SIS 作为扩大膀胱材料的理论。在初步实验获得成功后,Badylak 对SIS 促进组织重生的速率及其过程进行了实验,提示SIS 作为膀胱扩大的材料不仅促进组织快速重生,而且有非常快的降解速率,这样避免了在其降解之前发生严重的急、慢性炎症反应。此外,与传统肠段进行膀胱扩大的比较两者在短期内效果相近,但长期前者明显优于后者。
BAM来源于猪的膀胱组织，是经处理的脱细胞的膀胱粘膜下基质组织，与SIS相比，更适合作为膀胱替代的材料，经大量实验研究具有以下特点：①具有良好的细胞相容性，适合作为多种“种子细胞”的支架，支持细胞的粘附、生长与增殖；②BAM移植物组织反应较小，很少发生组织皱缩、变型，不会形成严重的结缔组织包裹；③BAM 移植物具有良好的柔韧性，能耐受一定的张力，适合膀胱作为储尿容器的特点；④BAM 来源较广泛，制备简单，适合临床的需求。动物来源的材料有潜在的传播病原体的危险。Klaus 等对最常用的猪源性BAM移植物进行了关于猪内生性逆转录病毒（PERV）是否可以跨物种传播的研究。他们将猪源性BAM移植到羊体内，采用PCR、RT-PCR、免疫组织化学、电镜以及DNA序列测定等方法，检测PERV在羊体内和BAM移植中基因和抗原蛋白的表达，结果未发现PERV。这说明经过化学脱细胞处理的猪BAM移植物可有效阻止异源病毒的跨物种传播，在人类使用是安全的[17]。
2.2 人工合成材料
人工合成的高分子可降解的生物材料也可作为一种膀胱替代材料。常用于组织工程的聚合物材料有聚乳酸（poly-L-lactic acid, PLA）,聚羟基乙酸（poly-glycolic acid, PGA, 聚已内酯（poly(epsilon-caprolatone), PCL）以及它们之间的共聚物等。这些人工合成的高分子聚合物都是常用的组织工程材料，具有高度的生物相容性和生物降解能力，有的已通过美国食品与药物管理局认证，可用于医用生物材料入外科缝线等。单独应用这些材料进行膀胱替代的研究较少，它们一般和细胞结合，作为细胞的基质支架支持细胞的膀胱重建作用。与天然材料相比，其生物相容性较差，其相对优势在于可根据实际需要以较简单的方法改变或修饰材料的理化性能，调控其降解时间和机械性能。
3.结合细胞的“功能性”材料
人们曾期待无细胞的的材料能诱导移植受体的细胞长入材料，随着材料的逐步降解以形成以移植受体细胞为主的组织替代，而作为膀胱壁的主要成分——平滑肌细胞自然的生长极为缓慢，所以这种设计思路在膀胱替代是很难实现的。目前人们逐渐转向在另外一种“种子细胞”+“细胞支架（细胞外基质）”的组织工程策略，即在体外分离、扩增种子细胞（自体平滑肌细胞、干细胞、尿路上皮细胞等），并将其种植在天然的或人工合成的细胞支架之上小肠复合体，然后再将细胞-材料的复合体植入缺损处的组织和器官。人们把这种结合功能性细胞的材料形象地称为“活”的材料。
1995年Atala用PLA 作为动物体外膀胱移行上皮细胞的生长支架, 并将体外培养的细胞-PLA 活性复合物移植于异种动物的膀胱缺损区获得成功, 其用PLA 制成人工细胞支架, 从实验兔的膀胱中提取移行上皮细胞, 经过胶原酶及其它化学试剂处理后, 此细胞种植于人工细胞 支架上, 再将细胞-PLA 复合物置于生长液中培养4 天后, 移植于异种动物鼠的膀胱缺损区, 观察到60 天内兔的膀胱移行上皮仍然存活, 随时间延长, PLA 支架逐步降解吸收而为鼠自体膀胱的移行上皮及平滑肌细胞取代, 从而证明;PLA支架除起着支持兔的膀胱移行上皮生长外, 还能对鼠的自体膀胱细胞再生修复起着框架作用。1997 年, 美国波士顿儿童医院已用这一方法成功的为10 只羊羔植入了新膀胱, 并计划在不远的将来, 将一个从胎儿细胞中培养出来的膀胱植入人体[18]。
在应用天然材料作为细胞支架进行膀胱再生方面，目前也取得了一定的进展。Yoo 等曾应用取自狗膀胱的平滑肌细胞和尿路上皮细胞作为种子细胞，以异体狗的BAM作为细胞支架构建组织工程膀胱，结果显示术后12个月后，膀胱容量可恢复到术前的99%，以后在积累一定的实验基础之后，他们用这种方法进行了早期的临床实验。他们对7例患有脑脊膜膨出合并有低张、高压的神经源膀胱的患者取膀胱活检，或其平滑肌细胞和膀胱上皮细胞进行体外培养和扩增，然后将其种植于BAM，形成细胞BAM的复合体，体外培养3-4 d, 将其植入体内行膀胱扩大，术后平均随访近4年，膀胱功能较以前均有不同程度的改善，未发现有酸碱失衡、代谢紊乱、结石形成等并发症[20]。这一研究成果被著名的美国泌尿外科专家Chung 誉为具有里程碑意义的进展。以后Brown等也曾单独应用BAM 进行膀胱替代，膀胱在术后22周基本恢复正常容量。他们将自体的平滑肌细胞和尿路上皮细胞种植于BAM 进行膀胱替代，发现移植的细胞可向基质深层生长，并伴有明胶酶活性的增强，他们认为BAM 内可能含有重要的诱导因子刺激移植细胞的粘附和增殖，并能促进平滑肌细胞与尿路上皮细胞之间的信号传导和相互作用[21]。4.新的组织工程材料与种子细胞
近来，越来越多的研究已显示纳米级纤维在形态上更接近于细胞生理的纳米级微环境，功能上因其具有较大的比表面积和丰富的空隙，适合接种大量的组织工程用的细胞且有利于细胞间的营养与信号交换，此外还有细胞导向作用等优点。因而纳米纤维被认为与以往的多聚物海绵等微米级材料相比更适合组织工程的要求[22]。美国加州大学洛杉矶分校的Rodriguez 教授的小组应用静电纺丝技术制备纳米级的PLGA（PLA和PGA的共聚体）纤维膜，然后将脂肪源的干细胞在体外分化成功能性的平滑肌细胞后种植其上，修复兔模型的膀胱缺损，术后12周后，随者PLGA的降解，缺损处由移植的平滑肌细胞替代，并具有一定的方向性，膀胱的容量也恢复到术前的80%。结果提示纳米级的细胞支架能较好地支持干细胞的增殖和分化。
干细胞是机体内特殊的细胞群落，具有强大的自我更新和定向分化能力[5]，目前成为最有应用前途的组织工程“种子细胞”的来源。干细胞按其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞2种。与胚胎干细胞相比，成体干细胞更符合实际临床组织工程应用的要求。其主要特点有：可取材于自体组织，不存在免疫源性；较少的基因突变发生；取材相对方便；不存在伦理问题等等。目前各种成体干细胞已广泛应用于膀胱替代的组织工程，如骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSC）、脂肪源干细胞（adipose derived stem cells, ADSC）、神经鞘干细胞(neural crest stem cells,NCSC)等等。在以上这些研究中，不乏令人兴奋的进展。Chung近来将未分化的BMSC种植于SIS，然后将细胞-材料复合物用来修复大鼠的膀胱缺损模型，经过3个月的随访发现移植处形成3层的细胞混合体，其中包括膀胱上皮细胞和平滑肌细胞，免疫组化和RT-PCR显示这些细胞表达尿路上皮标记物骨架蛋白8和19，同时也表达平滑肌标记物肌球蛋白重链（MHC）。而作为对照组的单独SIS的移植则没有这些变化，进一步的细胞示踪显示这些细胞并非来源于干细胞的跨系分化，而来源于周围正常膀胱组织细胞的长入，这提示，未分化的干细胞的移植可能刺激宿主膀胱细胞的再生和增殖[23]。Rodriguez 等应用ADSC在体外预分化成平滑肌细胞后，在植入大鼠的膀胱缺损，经细胞示踪研究发现大约20%的细胞可在体内保持平滑肌的分化表型，参与膀胱的功能性修复[24]。目前普遍认为干细胞的稳定的、高比率的定向分化仍是亟待解决的问题，也是未来膀胱组织工程的研究重点之一。
Mel- 18属多梳基因家族(polycomb group genes, PcG)成员,很多研究表明其编码负性调控蛋白,抑制许多肿瘤的生长和其他生物学活性[3,4,5]。PcG首次被发现是在果蝇中作为转录抑制因子,负责调控Homeotic(在脊椎动物中称Hox基因)基因簇时间和空间上的表达[6],PcG家族结构高度保守,参与不同的信号通路,调控细胞增殖、分化、衰老,参与肿瘤细胞的形成[7],国内外有报道表明PcG家族中的很多成员在对包括膀胱尿路上皮癌在内的许多泌尿系肿瘤的生物学行为方面有着重要作用,本实验旨在探讨Mel- 18基因表达水平与人膀胱尿路上皮肿瘤临床病理相关性及其意义。
1 材料与方法
1.1 标本
选取南京市鼓楼医院病理科2008年8月至2009年8月间经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋的膀胱尿路上皮肿瘤标本共71例,这些标本事先均调取对应的切片经两位资深的病理科医生确诊为膀胱尿路上皮肿瘤,具有相对完整的病理资料,按照WHO 2004分级法分为PUNLMP 8例、低分级尿路上皮癌26例、高分级尿路上皮癌37例;UICC 2002第6版T分期法(不包括PUNLMP)分为Ta期20例、Tis期2例、T1期18例、T2期17例、T3期5例、T4期1例。这些患者中男51例,女20例;年龄范围36～84岁,中位年龄为60岁;通过查阅临床资料及回访证实术前均未接受放、化疗(包括膀胱灌注),肿瘤的直径大小、数目的资料通过临床及病理资料完整获得。
1.2 试剂与方法
Mel- 18抗体购于Santa Cruz公司,货号H- 1l5 SC- 10744。免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥公司,货号PV- 6001兔二步法。实验步骤:切片于二甲苯中脱蜡,乙醇梯度水化处理,高压加热抗原修复法充分暴露抗原位点。待其自然冷却后,PBS冲洗3 min×3次,滴加一抗兔抗人Mel- 18多克隆抗体(1∶400),4 ℃孵育过夜;PBS冲洗3 min×3次,滴加二抗工作液(PV- 6001兔二步法),37 ℃孵育30 min,PBS冲洗3 min×3次,镜下控制DAB显色5～10 min;终止显色,苏木精复染,盐酸乙醇固定,封片,观察。用PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判断
光学显微镜下观察组织标本的着色程度,Mel- 18蛋白阳性为细胞核染成棕黄色,高倍镜(×400)下随机取4个不同的视野,计数细胞总数及核阳性的细胞数,按阳性细胞所占的比例计数,阳性细胞率≤10%的计为1分,阳性细胞率>10%且≤50%的计为2分,阳性细胞率>50%且≤75%的计为3分,阳性细胞率>75%的计为4分;并且根据染色的强弱计分,阴性(无色)计为1分,弱阳性(浅黄色)计为2分,中等阳性(棕黄色)计为3分,强阳性(棕褐色)计为4分。根据二者乘积判断染色结果:≤4的(-),>4且≤8为(+),>8且≤12为(++ ),>12且≤16为(+++ ),进行统计分析时将(-)和(+)计为阴性,将(++ )和(+++ )计为阳性。以上结果均由至少两位病理科医生以盲法观察确定[8]。
1.4 统计学方法
用SPSS 13.0统计软件包进行分析。采用Pearson卡方检验及Fisher确切概率法进行率的比较分析,P<0.05认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 Mel- 18在膀胱尿路上皮肿瘤中的表达
显微镜下见Mel- 18蛋白主要表达在细胞核内,少部分同时表达于细胞浆,观察发现Mel- 18蛋白表达阳性的肿瘤组织主要集中在低度恶性倾向膀胱尿路上皮乳头状瘤组织、低分级尿路上皮癌组织和分期在Ta期的尿路上皮癌组织中,前者染色呈强阳性(图1a),后两者较前者显色稍弱,呈中等阳性(图1b)。而绝大数高级别及T1期以后的癌组织染色结果呈阴性(图1c)。
2.2 Mel- 18在膀胱尿路上皮肿瘤中的阳性表达率
71例标本中有24例的Mel- 18蛋白表达阳性(++～+++ ),总阳性表达率为33.8%,阳性率在男性中为31.4%,女性中为40.0%,差异无统计学意义(P=0.489);在年龄≤60岁的患者中为40.0%,>60岁的患者中为29.3%,差异无统计学意义(P=0.345);在肿瘤直径≤3 cm中为40.4%,肿瘤直径>3 cm中为7.1%,差异有显著统计学意义(P<0.05);在肿瘤数目≤2个中为30.2%,肿瘤数目>2个的患者中为44.4%,差异无统计学意义(P=0.269);在低度恶性倾向尿路上皮乳头状瘤、高分级尿路上皮癌、低分级尿路上皮癌中分别为75.0%、10.8%、53.8%,前两种之间差异有显著统计学意义(P<0.001),后两种之间差异有显著统计学意义(P<0.001);在Ta、T1期中的阳性率分别为80.0%、11.1%,差异有显著统计学意义(P<0.001)。膀胱尿路上皮肿瘤各组的阳性表达数目、统计学意义见表1。
a 低度恶性倾向尿路上皮肿瘤与低分级尿路上皮癌的比较;b 低分级尿路上皮癌与高分级尿路上皮癌的比较;c 低度恶性倾向尿路上皮肿瘤与高分级尿路上皮癌的比较;d Ta期尿路上皮癌与T1期尿路上皮癌的比较;e Tis、T1、T2、T3、T4期尿路上皮癌之间的比较;*Fisher确切概率法
3 讨 论
Mel- 18基因属于PcG家族成员之一,PcG家族结构高度保守,参与不同的信号通路,调控细胞增殖、分化、衰老,参与肿瘤细胞的形成[7]。国内外文献均见报道PcG中的重要成员EZH2及Bmi- 1与膀胱肿瘤的关系[9,10,11],表明其癌基因的功能。Mel- 18和Bmi- 1基因结构高度同源,而且Mel- 18的氨基酸序列有65%与Bmi- 1蛋白相同,Bmi- 1基因直接参与细胞的生长、增殖的调节,并且为人体干细胞和造血系统细胞的自我更新所必需[12],自1991年被发现以来就成为研究的热点,它第一次作为一种癌基因被提出来是在转基因鼠的淋巴细胞瘤细胞的传代中,发现其可以与原癌基因c- myc基因协同起作用,而引起细胞的转化和肿瘤的生成[13,14]。众多的研究证实,Bmi- 1在多种人的肿瘤如淋巴瘤、白血病、骨髓异常增生综合征、肝癌、膀胱癌等中均有表达[15,16,17,18],基础研究发现Bmi- 1作用于染色体水平,抑制抑癌基因INK4a/ARF产物的表达[19]。Mel- 18基因表达产物可与bcl- 2、c- myc和Hox基因中的序列5′- GACTNGACT- 3′结合,能抑制c- myc引起的细胞增殖,抑制bcl- 2引起的凋亡抑制作用,抑制Hox基因的活性,从而抑制肿瘤的形成,Mel- 18也能直接抑制cyclin D2活性,阻滞细胞由G1向S期转化,导致DNA合成受阻,进而抑制肿瘤的发生[20,21,22,23]。从相关的基础研究可以发现,Mel- 18与Bmi- 1不仅仅只同属于PcG家族,更重要的在于它们之间功能的相关性。
统计学分析发现,高分级尿路上皮癌Mel- 18蛋白阳性率明显低于PUNLMP中,差异有显著统计学意义(P<0.001);也明显低于低分级尿路上皮癌,差异有显著的统计学意义(P<0.001)。研究结果显示,Mel- 18基因具备抑癌基因功能,其表达的产物是一种保护性蛋白,肿瘤分级越低,即分化越好,抑癌基因表达的蛋白量越多;相反,肿瘤分化越差,蛋白表达量越少。PUNLMP是膀胱少见肿瘤之一,WHO 2004膀胱肿瘤分级法列其为介于良性、恶性尿路上皮肿瘤的一种独立类型,其细胞形态正常,无恶性肿瘤的细胞学特征,虽然此种尿路上皮肿瘤进展的风险很小,但不完全属于良性病变,仍有复发可能[2]。本实验结果表明,PUNLMP和低分级尿路上皮癌间Mel- 18蛋白阳性率差异无统计学意义(P=0.422),也从一定层面说明PUNLMP和低分级尿路上皮癌之间界限的模糊性。
本研究结果显示,Ta、T1期Mel- 18蛋白阳性率明显低于Ta期(P<0.001),而T2、T3、T4期及原位癌Tis阳性率均为0,差别较T1期无统计学意义(P=0.661),从中可以看出Mel- 18基因在非浸润性膀胱尿路上皮癌中表达率明显高,而对于进入T1期的癌组织,此时癌组织虽只侵入上皮下结缔组织,尚未侵犯肌层,但在基因产物的表达水平上已经发生显著变化,进入T2期以后的癌组织,即属于肌层浸润性膀胱癌,恶性及凶险程度很高,并且未见Mel- 18蛋白阳性表达,说明Mel- 18的抑癌基因表达能力随着癌组织侵犯深度显著降低。这里需要提及的是Tis期癌,其属于原位癌,虽也属于非肌层浸润性膀胱癌,但一般分化差,属高度恶性肿瘤,向肌层浸润性进展的几率要高得多[24]。本实验中共有2例原位癌,观察发现属于高分级癌,分化较差,IHC结果也显示Mel- 18蛋白表达呈阴性。
综上所述,本研究表明Mel- 18的表达与膀胱尿路上皮肿瘤的病理分级、临床T分期关系密切,这两者是有关患者预后的重要因素,因此本实验表明Mel- 18蛋白可能是与膀胱尿路上皮肿瘤预后有关的分子标记物之一,若需进一步研究证实,还需扩大样本量,搜集包括淋巴结转移情况在内的更详细的临床及病理资料,增加对患者的长期随访工作,记录相关的资料,综合分析。本实验采用半定量方法观察Mel- 18蛋白的表达情况,为指导进一步利用定量的方法观察Mel- 18蛋白的表达提供参考。对于Mel- 18与Bmi- 1之间在乳腺癌中关联的已有报道[4,20],那么两者在膀胱尿路上皮肿瘤中的相互作用需进一步研究,并且对于Mel- 18传统的信号通路是否在膀胱尿路上皮肿瘤中发挥作用也需进一步深入研究。
摘要：目的:探讨Mel-18基因表达水平与人膀胱尿路上皮肿瘤临床病理的相关性及其意义。方法:回顾性分析南京鼓楼医院病理科2008年8月至2009年8月间膀胱尿路上皮肿瘤石蜡标本共71例,采用免疫组织化学二步法检测标本中Mel-18蛋白的表达情况,采用半定量的计分方法统计染色结果,结合临床资料进行统计学分析。结果:71例标本中有24例的Mel-18蛋白表达阳性(阳性率为33.8%,24/71),阳性信号主要表达在细胞核内,直径≤3cm的肿瘤Mel-18阳性表达率(40.4%,23/57)明显高于直径>3cm的肿瘤(7.1%,1/14),差异有统计学意义(P<0.05);高分级尿路上皮癌Mel-18阳性表达率(10.8%,4/37)明显低于低度恶性倾向尿路上皮乳头状瘤(75.0%,6/8)、低分级尿路上皮癌(53.8%,14/26),差异有统计学意义(10.8%vs75.0%,P<0.001;10.8%vs53.8%,P<0.001);T1期尿路上皮癌Mel-18阳性表达率(11.1%,2/18)明显低于Ta期(80.0%,16/20),差异有统计学意义(P<0.001)。Mel-18的表达与患者性别、年龄、肿瘤数目无相关性(P>0.05)。结论:Mel-18的表达与膀胱尿路上皮肿瘤的直径大小、病理分级、临床T分期有关,Mel-18作为一种抑癌基因,其表达产物的检测可能有助于人膀胱尿路上皮肿瘤的病理及临床诊断。
关键词：技工院校；数学分层教学
一、分层教学基本概述
分层教学指以学生学习能力和认知水平为基础，采用层次划分的方式，为不同程度的学生提供不同的教学，达到因材施教的目的，同时注重不同层次学生的交流与沟通。分层教学并不是任凭心中所想，随意分层，而应坚持一定的原则，主要涉及分层原则、动态发展原则以及激励原则。首先，针对分层原则，是分层教学的关键原则，指以学生实际数学水平为依据，开展有必要的层次划分工作，促使学生结合自身情况选择合适的学习层次，以达到学习目标。在此基础上，老师以不同层次需求，开展有目的性、针对性的数学教学。其次，针对动态发展原则，即在分层教学基础上，以学生数学水平进步情况为参考，适当调整学习目标，更好地实施分层教学。最后，针对激励原则，分层教学并非对差层次学生置之不理，而是以学生不同学习进度为基础，采用层次划分，避免学生在数学学习过程中出现畏难情绪，影响学习效果。在此过程中，老师应适时采用激励手段，以达到辅助教学的目的。对于进步学生及时鼓励，对于退步学生及时找出原因并鼓励。
二、简述分层教学在技工院校数学教学中的必要性
在新课程改革实施的基础上，“应用”成为技工院校数学教学的主要目的，要求技工院校开展数学教学必须以“必需和够用”为标准。由于技工院校学生数学基础知识薄弱成为普遍现象，存在学生数学基础知识差异大的问题，导致数学教学开展教学活动存在较大困难。在此背景下，若仍沿用传统的教学模式，易导致学生存在意见。
三、探究技工院校数学分层教学的组织与实施
1、学生分层。学生分层应以学生自愿选择为前提，老师适当调整，调动学生数学积极性和主动性，促使学生充分发挥主观能动性，自觉参与课堂，从而提高数学学习效果。在实际数学分层教学过程中，以学生数学基础和学习能力为依据，按3：5：2的比例将学生分为A、B、C三个层次。A属于学习存在困难的学生层次，B属于成绩中等的学生层次，C属于成绩拔尖的学生层次。在一段时间学习的基础上，学生可根据自身学生情况，作出适当的层次调整，达到整体优化目的。
2、教学目标分层。为符合数学分层教学需求，老师在制定教学目标时，应以学生实际情况为基础，采取教学目标分层方式。以上述学生分层为基础，A表示学习困难层次，B表示成绩中等层次，C属于成绩拔尖层次。针对A层学生，应要求学生掌握最为基础的数学理论知识，能够模仿教材例题完成作业。针对B层学生，在掌握基本运算方式的基础上，能实现自我解决教材中的例题，并能完成加以适当变化的例题。在此过程中，重点培养B层学生的分析归纳能力，培养学生良好的学习习惯。针对C层学生，熟练掌握基本运算方式，且能达到灵活应用教材数学知识点的效果，培养学生的自主学习能力，鼓励学生创新，充分发挥学生的特长，促进学生全面发展。
3、课堂教学分层。在课堂教学过程中，针对不同学生的不同情况，确保所有学生有所收获，采用分层方式，保证A层听得懂的基础上，达到提升C层数学知识水平的目的。例如，讲解解方程过程，在复习已学知识的前提下，整理归纳出以下问题：①一元二次方程的定义是什么？元、次是什么？为何a≠0？②一元二次方程求根公式是什么？③一元二次方程根的判别式是什么？④存在几种一元二次方程解法？⑤系数与一元二次方程的根存在何种关系？
在解决以上五个问题的过程中，前两个问题可由A层学生回答，中间两个问题由B层学生回答，最后一个问题由C层学生回答，达到充分调动学生积极性的目的，迫使全体学生掌握一元二次方程概念，进而树立自信心。
在学习一元二次方程的基础上，引入二元二次方程，为理解新知识点，将设计以下几个问题：①：二元二次方程含义是什么？其与一元二次方程有何异同点？②：二元二次方程组是什么？③：二元二次方程组应如何解？
在回答以上三个问题时，应将第一个问题交由C层学生，B层学生回答第二个问题，第三个问题由A层学生解决。在此过程中，重点在于鼓励学生发表自己的看法，引导学生归纳、分析，指导学生交流合作，迫使学生掌握数学学习方法，进而增加自信心。
4、作业分层。作业是学习效果的展现，针对不同层次的学生应布置不同的作用。一方面可准确把握学生数学知识点掌握情况，另一方面可避免抄袭。例如，针对以上解方程问题，可布置三个层次的作业：
A层学生：解方程：
X2-3X-18=0
B层学生：解方程组：
C层学生：若方程6X2+2mX+18=0存在两个相等实数根，则m=？
四、结语
总而言之，技工院校数学教学在技工院校教学中占有重要位置，是其他课程学习的基础。为保证全面学生共同发展，在技工院校数学教学中，应积极采用分层教学方式，达到因材施教的目的，提高教学质量，达到教学效果，促进学生发展。
参考文献
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[3] 商鹏. 浅谈技工院校高等数学的分层教学[J]. 课程教育研究，2012，17：25.
[4] 李波，崔群法. 新建本科院校高等数学课程中实施分层教学的探索——以安阳师范学院为例[J]. 教育理论与实践，2010，24：49-51.
1 材料与方法
1.1 标本制备
标本来源于7例膀胱癌患者全膀胱切除手术取下的非癌变正常膀胱全层组织(经病理活组织检查无膀胱病变),OCT包埋,恒冷切片机制作冰冻切片(厚度10μm),粘于多聚赖氨酸处理后的载玻片上,-80℃冰箱保存备用。
1.2 主要试剂与仪器
第一种I抗(兔抗人CD117多克隆抗体)购于Abcam公司,第一种Ⅱ抗(FITC异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔抗体)购于Santa cruz公司,第二种I抗(小鼠抗人NOS-1单克隆抗体)购于Santa cruz公司,第二种Ⅱ抗(TRITC四甲基异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠抗体)购于Santa cruz公司,磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清白蛋白(BSA)均购于上海生工公司,恒冷冰冻切片机(型号Leica cm3050s)及激光共聚焦显微镜(型号LSM 510 META,ZEISS)均由石河子大学医学院地方病与高发病实验室提供。
1.3 试验方法
冰冻切片取出后风干,100%冰丙酮液室温下(25℃)固定10 min,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min×3次,吸水纸拭去多余液体。免疫荧光染色:组织切片首先滴加1%胎牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭30 min,弃去BSA,滴加经0.01 mol/L的PBS液稀释的两种I抗的混合液(100μL,1∶50)置入湿盒内4℃冰箱孵育过夜。次日取出湿盒(此后各步操作均需避光),组织切片用0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次,滴加经0.01 mol/L的PBS稀释的两种Ⅱ抗的混合液(100μL,1∶100),室温下湿盒内避光孵育60 min,0.01 mol/LPBS液漂洗5 min×2次,双蒸水漂洗5 min×2次,吸水纸拭去多余液体,50%缓冲丙三醇封片剂封片,激光共聚焦显微镜下观察。
1.4 统计学分析
随机取3张冰冻切片,每张切片镜下随机取5个视野观察并计数CD117阳性细胞数及NOS-1阳性细胞数(由同一技术人员计数),所有数据录入SPSS 17.0统计软件分析,检验水准α=0.05,通过Kruskal-Willis H检验,得出CD117阳性细胞数在膀胱肌层的平均秩次为210.37,黏膜下层的平均秩次为171.19,黏膜层的平均秩次为92.44,并进行两两比较,发现膀胱肌层ICCs最多,黏膜下层次之,黏膜层罕见,P<0.05,差异有统计学意义;同样方法得出NOS-1阳性细胞数在肌层的平均秩次为231.45,黏膜下层的平均秩次为18 476,黏膜层的平均秩次为57.80,并进行两两比较,发现NOS-1阳性细胞数在膀胱肌层多于黏膜下层及黏膜层,膀胱黏膜层最少,P<0.05,差异有统计学意义。
2 试验结果
2.1 ICCs在膀胱组织内的分布
经FITC染色,激光共聚焦显微镜下可观察到膀胱ICCs为双极梭形细胞,胞体呈卵圆形,两级可见2个细突起,细胞膜及突起呈绿色荧光,其形态与豚鼠膀胱内ICCs类似,大多分布于肌层及黏膜下层,平滑肌肌束外围和肌内的组织间隙,膀胱顶多于其他部位,ICCs的突起连结交织形成网络。(见附图A)
2.2 NOS-1阳性细胞在膀胱组织内的分布
经TRITC染色,激光共聚焦显微镜下可见细胞浆呈红色荧光的NOS-1阳性神经元细胞成簇密集分布于膀胱肌间神经丛和肌内,并形成神经元细胞网络,轮廓较清晰,多数为DogielⅠ型神经元,胞体多为圆形和卵圆形,部分为三角形及不规则形。(见附图B)
2.3 ICCs和NOS-1细胞免疫荧光双标记染色显示
经双重染色显示细胞浆呈红色荧光的NOS-1神经元细胞(阳性),胞膜呈绿色的ICCs同时可表达NOS-1,故被染成棕黄色(阳性),CD117免疫荧光和NOS-1免疫荧光双重染色未见两种细胞有明显共表达,但发现NOS-1阳性神经元细胞多分布在ICC s及突起的周围。(见附图C)。
A:CD117免疫荧光染色观察到胞膜呈绿色的ICCs(箭头示)在膀胱组织内的分布(×200);B:NOS-1免疫荧光染色观察到的胞浆呈红色的NOS-1阳性细胞(箭头示)(×200);C:免疫荧光双重染色观察到红色的NOS-1阳性细胞(圯箭头示)和棕黄色的ICCs(→示),且NOS-1阳性神经元细胞多在ICCs附近(×200)
3 讨论
最近研究证明,ICCs是胃肠道周期性运动的基础,它具有起搏胃肠道慢波、控制电节律传导,并拥有综控胃肠道神经信息传递的功能[9,10],除此外在胃肠道中已发现含有一氧化氮合酶神经元[11],其可分泌抑制性神经递质,对胃肠运动和分泌起辅助调控作用。研究人员在前期动物实验中也发现在豚鼠膀胱中存在形态和免疫原性与胃肠道相似的ICCs,并证明其可能就是具有类似于心脏窦房结细胞功能的膀胱运动起搏细胞,而众所周知的一氧化氮(NO)作为一种独特的递质因子调节着机体多方面的功能,尤其是对于平滑肌活动的调节,例如在阴茎勃起过程中,NO信号在维持海绵体平滑肌的舒张就发挥了重要生理作用[12,13],那么在人膀胱中的ICCs及NOS-1神经元细胞在膀胱活动过程中扮演什么角色呢?故本实验使用CD117及NOS-1抗体运用免疫荧光双标记技术在激光共聚焦显微镜下观察ICCs与NOS-1阳性神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律。
CD117是干细胞生长因子受体,也是酪氨酸激酶受体,国际通用标记ICCs的特异性抗体,NOS-1是机体内催化NO生物合成的关键限速酶,可标记一氧化氮阳性细胞,特异性远远好于NADPH-d酶组织化学间接反映NOS的方法。实验结果发现在人膀胱组织中广泛分布着CD117阳性的ICCs,尤以平滑肌肌束外围和肌束间的组织间隙为多,肌内可见ICCs之间通过突起连结形成网络化,这种分布与其肌原性的兴奋起搏作用密切相关,这与国外学者DAVIDSON RA[14]等在豚鼠膀胱中报道的分布情形类似。同时可见NOS-1阳性神经元细胞在膀胱肌间神经丛成簇大量存在,并形成神经元细胞网络,双染发现NOS-1神经元细胞多分布在ICCs的邻近周围,两者大多伴行在一起,上述结果提示NOS阳性神经元与ICCs关系密切,推测可能NOS-1神经末梢分泌出NO,向ICCs(靶细胞)发出神经信号,其可通过控制对NO的产生,进一步整合神经信号对ICCs的调控,从而起到调节膀胱活动作用。虽然未见两者细胞明显共存,双染发现ICCs同时也可表达NOS-1,被染成棕黄色,提示ICCs可能具有自分泌产生NO的功能,NO作为信使将抑制信号通过弥散作用于周围的平滑肌细胞,产生舒张作用,意味着ICCs具有将抑制性信号加强、放大作用。
尽管近年的研究普遍认定维持胃肠道电机械运动正常的生理基础是胃肠神经系统-Cajal样间质细胞-平滑肌细胞组成的基本功能单元,且有文献报道称NO可激活ICCs内可溶性鸟苷酸环化酶,引起ICCs内c GMP浓度升高,于是激活c GMP依赖性蛋白激酶,进而使ICCs内钙离子增加,并释放某种因子(可能是NO),令周围平滑肌细胞内钙离子减少,最终作用使平滑肌细胞舒张[15]。那么在人膀胱中是否也耦合了膀胱神经系统-ICCs-逼尿肌细胞三者的功能,现在还不能完全得出结论,本研究的意义在于:(1)为一步论证ICCs作为人膀胱自律活动的起搏细胞提供了形态学分布基础。(2)人膀胱组织中,一氧化氮合酶阳性神经元多分布在ICCs周围,提示ICCs可能作为NO的目标细胞,即NO对膀胱运动功能的调节可能通过ICCs来发挥效应的,为生理学及病理生理学研究正常膀胱活动及各类膀胱功能障碍性疾病提供新思路。但研究人员已知膀胱周期性的储尿、排尿功能是非常复杂的,NO作为一种特殊的生物信息分子,在中枢和外周神经系统都可以作为神经信号发挥重要的生物学作用,而且除NOS-1神经元外,膀胱中还存在其他重要神经元,如胆碱能神经元、P物质神经元、嘌呤神经元等,这些神经元释放递质作为信使对膀胱的活动也发挥着不可替代的作用。ICCs以及膀胱中的这些神经元细胞它们具体扮演的角色及分工如何,互相之间如何协调配合,有待进一步深入地研究。
摘要：目的 探讨cajal样间质细胞(ICCs)及一氧化氮合酶-1(NOS-1)神经元细胞在人膀胱组织中的分布规律及意义。方法 人膀胱全层组织冰冻切片,CD117免疫荧光结合NOS-1免疫荧光双重标记染色。结果 激光共聚焦显微镜下观察CD117表达阳性的ICCs及NOS-1阳性神经元细胞广泛分布于人膀胱组织内,发现ICCs可表达NOS-1,总体上双重染色未发现两种细胞有明显的共表达,但可见NOS-1表达阳性神经元细胞的附近存在较多ICCs。结论 人膀胱中的ICCs可能是膀胱自主节律性运动的起搏细胞,NOS-1阳性神经元细胞可能以ICCs作为靶点共同参与对膀胱舒缩活动的综控。
