流感病毒实验室检测（精选10篇）
一、标本采集、转送和检测
（一）标本采集 为进行病例诊断，医疗机构应尽早采集病人的相关临床样本。采 集的临床标本包括病人的上呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽 取物、咽漱液和鼻洗液）、下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）和血清标本等。应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标 本（尤其是下呼吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的 恢复期血清。如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行 尸体，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本。医疗机 构采集的呼吸道标本每份不少于3ml。血清标本每份分为2管，每管不 少于0.5ml。对人感染H7N9禽流感 病例可能暴露的禽类饲养或交易等场 所，由疾控机构采集禽类粪便、笼具涂拭标本和环境污水等标本，技 术要求参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011年版）》。
（二）医疗机构标本检测和转送
1.病例的临床标本采集后，有条件开展核酸检测的医疗机构要 对呼吸道标本开展H7N9禽病毒核酸检测，没有条件开展核酸检测的医 疗机构应立即利用快速抗原检测试剂进行甲型流感病毒抗原检测，H7N9禽流感病毒核酸检测阳性的临床标本按照B类感染性物质进行包 装运输，在低温条件下，48小时内送到当地流感监测网络实验室，由 当地流感监测网络实验室上送到省级疾控中心网络实验 室。甲型快速 抗原检测阳性的标本，按上述相同的包装要求24小时内送当地流感监 测网络实验室开展核酸检测。
2、没有条件开展上述检测工作的医疗卫生机构发现符合病例定 义的病例后，要立即采集相关标本，按照B类感染性物质进行包装运 输，在低温条件下，24小时内送到当地流感监测网络实验室。
3、流感网络实验室的检测策略（流程图见附件）流感网络实验室收检的呼吸道标本每份分为3管，每管应不少于 1ml。1 于检测，另外2 于复核和病毒分离。标本储存应在-70℃ 或以下温度，避免反复冻融。
（1）对于甲型流感病毒抗原阳性的疑似病例，在24小时内进行 H7、H5亚型的检测，如检测阴性，可继续进行甲型H1N1流感和季节性 H3N2流感病毒等检测。
（2）对于有流行病学接触史的疑似病例，在24小时内进行甲、乙型流感通用引物、H7和H5亚型的检测。如上述检测均阴性，不再进 行流感病毒核酸检测。若甲型流感病毒通用引物阳性，H7、H5亚型阴 性，可继续进行甲型H1N1流感和季节性H3N2流感病毒等检测。
（3）在发生病例的地区开展强化监测时，对采集的ILI和SARI 病例的呼吸道标本在48小时内进行甲、乙型流感病毒通用引物，以及 H5、H7亚型的检测。如上述检测均阴性，不再进行流感核酸检测。若 甲型通用引物阳性，H7、H5亚型阴性，按照2010年全国流感监测方案 的要求开展病毒分离。（4）若当地流感监测网络实验室检测结果为H7亚型禽流感病毒 核酸阳性时，应当于48小时内将其中2管呼吸道相关原始标本送省级 疾控中心网络实验室。
（5）省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验 室送检的H7和H5亚型阳性的呼吸道标本时，具备相应生物安全条件的 网络实验室在2周内完成病毒分离工作，并将分离的毒株按要求48小 时内送国家流感中心。未能开展病毒分离的省级疾控中心网络实验室 将阳性病例的原始标本48小时内送国家流感中心开展病毒分离。
（6）各医疗机构采集的双份血清标本48小时内送当地流感监测 网络实验室，由当地网络实验室48小时内将血清标本分别送省级疾控 中心和国家流感中心开展相关抗体检测，进行病例诊断。
（7）对人感染H7N9禽流感 病例可能暴露的禽类饲养或交易 等场所，采集禽类粪便、笼具涂拭标本和环境污水等标本2周内开展 甲型流感通用引物、H5、H7和H9亚型检测。有条件开展病毒分离的实 验室对阳性标本开展病毒分离工作，阳性分离株在2周内送国家流感 中心。没有条件开展病毒分离的实验室在2周内将阳性标本送国家流 感中心。具体技术要求可参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性 禽流感监测方案（2011年版）》。
（8）对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳 性标本要求在48小时内送至国家流感中心。
（9）国家流感中心在接到阳性标本后2周内完成病毒分离工作。
（三）实验室生物安全基本要求
1、H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病 原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行 和审批。并建立H7N9 禽流感病毒及样本保存 制度，并采取可靠的安保措施。
2、未经培养的临床样本的分装、灭活和核酸提取应当在生物安 全二级实验室生物安全柜内开展。工作人员应着防护服，佩戴眼罩、N95及以上水平的 等个人防护装备。
3、H7N9禽流感病毒的分离培养须在生物安全三级实验室进行。
4、样本采集及实验活动过程中产生的医疗废物要分类收集，经 压力蒸汽灭菌或其他可靠灭菌后，按医疗废物收集处置。
1 材料与方法
1.1 材料
禽流感病毒H5亚型血凝抑制HI抗原, 标准阳性血清;禽流感琼脂凝胶免疫扩散AGID抗原、琼扩阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产。禽流感病毒抗体检测ELISA试剂盒 (AI-Ab) , 禽流感病毒多动物抗体检测ELISA试剂盒 (AI Multis-Screen Ab) 由美国IDEXX生产。所有试剂均在有效期内使用。
1.2 方法
1.2.1 HI、AGID、ELISA三种检测方法敏感性比较
将禽流感病毒H5亚型阳性血清分别倍比稀释至1:2048, 分别用三种检测方法对每个稀释度进行检测, 测定血凝抑制效价, 比较三种检测方法的敏感性。
1.2.2鸡血清样品检测比较
采自散养户、家养户经AI H5亚型灭活苗免疫的鸡血清样品802份, 分别用HI、AGID、ELISA三种方法检测免疫抗体。
1.2.3 鸭血清样品检测比较
采自规模场、散养户、家养户经AI H5亚型灭活苗免疫的鸭血清样品1003份, 分别用HI、ELISA二种方法检测免疫抗体。
1.2.4 检测结果符合率比较
对不同检测方法检测鸡、鸭血清样品抗体结果分别进行比较, 计算符合率。
1.3检测方法及判断
血凝HA、血凝抑制HI试验:依据GB/T 18936操作, HI价大于或等于41og2判为阳性。琼脂凝胶免疫扩散AGID试验:依据GB/T 18936操作, 被检血清孔与标准抗原孔之间出现明显的沉淀线、且与相邻的标准沉淀线融合者判为阳性。AIV抗体ELISA试验:依据检测试剂盒生产厂家说明操作, 间接ELISA检测结果S/P值大于0.5判为阳性, 阻断ELISA检测结果S/N值小于0.5判为阳性。
2 结果
2.1 三种禽流感病毒抗体检测方法敏感性试验结果
将AIV H5亚型阳性血清分别倍比稀释至1:2048, 分别用HI、AGID、ELISA三种检测方法对每个稀释度进行检测, 测定阳性血清血凝抑制效价, 结果表明, ELISA方法灵敏度最高, 明显高于AGID方法, 略高于HI方法, HI方法灵敏度也明显高于AGID方法。 (见表1)
2.2 鸡血清样品检测结果
检测散养户、家养户鸡的802份血清样品, HI、AGID、ELISA三种方法检测AIV抗体阳性率分别为88.03%、63.84%、90.02% (见表2) 。ELISA方法检出阳性率最高, HI方法其次, AGID方法检出阳性率最低。HI与ELISA检出阳性率比较差异不显著 (P>0.05) , AGID与HI、ELISA检出阳性率比较均存在极显著差异 (P<0.01) 。
2.3 鸭血清样品检测结果
检测规模场、散养户、家养户鸭的1003份血清样品, HI、ELISA二种方法检测AIV抗体阳性率分别为90.03%、92.22% (见表3) 。HI、ELISA二种方法检出阳性率均在90%以上, 差异不显著 (P>0.05) 。
2.4 不同AIV抗体检测结果的符合程度比较
对鸡血清样品采用不同方法检测AIV抗体结果的符合率比较, HI与ELISA检测符合率最高, 为96.01%;其次为HI与AGID方法, 符合率为72.32%;ELISA与AGID检测符合率最低, 为70.32%。对鸭血清样品采用HI与ELISA方法检测AIV抗体结果的符合率为95.61%, 略低于检测鸡的96.01%符合率。 (见表4)
3 分析与讨论
3.1 目前我国对于高致病性禽流感的防控采取扑杀、强制性免疫和生物安全方法相结合为主的扑灭措施, 及时监测、准确诊断, 在禽流感防控上显得极为重要。当前禽流感诊断监测方法众多, 各种方法都有各自的应用范围, 有各自的优点和局限性。有的方法虽然检测敏感性、特异性强, 但对实验条件要求高、仪器设备昂贵、检测试剂贵等, 不适用于广大基层兽医实验室大量的监测与日常诊断。本项目探讨研究适合于动物疫病防控的基层兽医、易于普遍推广的检测技术。
3.2 从HI、AGID、ELISA三种禽流感病毒抗体检测方法对比来看, ELISA方法灵敏度最高, 也略高于HI方法, AGID方法灵敏度最低;检测鸡血清样品AIV抗体, ELISA、HI检出阳性率分别达到90.02%、88.03%, 而AGID检出阳性率只有63.84%;检测鸭血清样品AIV抗体, ELISA、HI检出阳性率均达到90%以上;不同检测方法的符合程度比较也显示, HI与ELISA检测方法无论是鸡还是鸭的检测符合率均很高, 能达到95%以上, 而HI与AGID、ELISA与AGID检测符合率分别为72.32%、70.32%, 远低于HI与ELISA的检测符合率。
HI是利用AIV血凝素蛋白凝集鸡红细胞的特性检测AI亚型特异性抗体, HI试验对试验要求较低, 检测所需2～3h, 既是WHO进行全球流感监测所采用的普及方法, 也是目前我国养禽生产对AI感染和免疫的主要检测手段。本研究也表明了该方法易于操作、敏感性较强、可定性、定量, 适用于大规模AI监测。但是在实际应用以及相关研究均表明, HI方法检测水禽时由于非特异性血凝抑制因子干扰会对检测结果判断产生一定影响, 需要排除非特异性因子。ELISA与AGID都是检测A型AIV的型特异性抗体。ELISA方法检测抗体具有较高的敏感性, 本研究运用间接ELISA检测鸡血清样品免疫抗体, 在三种方法中敏感性最高;运用阻断ELISA多动物检测方法, 检测鸭血清样品免疫抗体与HI方法比较, 虽然差异不显著, 但ELISA检出抗体阳性率92.22%, 高于HI检出的抗体阳性率2.19个百分点。这很可能是HI检测鸭时受非特异性血凝抑制因子影响, 而ELISA不受其干扰, 能有效检测出鸭的AIV抗体。ELISA检测抗体结果易于分析, 所需时间短2～4h, 检测适用于大批样品的检测, 特别是水禽的检测, 不易受干扰而提高了检测的准确性。AGID方法是较为传统的检测方法, 适用于鉴定所有A型流感病毒, 检测方法简单, 但所需时间24～48h, 本研究表明AGID敏感性低, 与其它检测方法相比符合率低, 检测结果不能确切反映禽群的抗体水平, 不适于当前AI防控监测及分析评估。
3.3 根据对不同AIV抗体检测方法的研究, 同时结合基层兽医实验室禽流感防控监测的实际需求, 推荐禽流感病毒抗体检测技术方案:采用以HI为主要检测方法, 结合采用ELISA技术, 特别是检测鸭血清样品时。
关键词：禽流感,血凝抑制试验 (HI) ,琼脂凝胶免疫扩散试验 (AGID) ,酶链免疫吸附试验 (ELISA) ,抗体
参考文献
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[2]韩庆功, 等.ELISA技术在禽流感诊断研究中的应用[J].生物技术通报, 2008 (6) :73-77.
关键词：禽流感病毒；荧光微球；检测
中图分类号：S852.64 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.
禽流感（Avian influenza，AI）是由甲型流感病毒引起的一种人畜共患的传染性疾病综合征。根据致病性的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三级，是危害养殖业的最重要的疾病之一[1]。高致病性禽流感（High pathogenic avian influenza，HPAI）被世界动物卫生组织列为动物传染病中的A类疫病[2]，在世界范围内具有重要的防疫性和检疫性。禽流感病毒的实验室诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、血清学诊断技术[3-5]、分子生物学诊断技术[6-9]、电镜技术等。新近发展起来的荧光微球因其材料不同而种类很多，由早期的聚苯乙烯微球，到后来出现的多种材料的高分子微球，如聚丙烯酸脂、二氧化硅、聚多糖类、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡啶等类型，其中聚苯乙烯微球目前仍被广泛应用[10-11]。以微球为载体，建立了基于荧光微球的流式细胞术检测方法。荧光微球稳定性好、粒度均一、单分散性好，其球形表面的弧度使抗体结合位点的暴露面与抗原决定簇处于最佳的反应状态，既使发光效率稳定高效又提高了反应的灵敏度，因而在生物医学、食品安全、分析化学以及某些高新技术领域都有着很重要的应用[12-13]。本研究是在高分子荧光微球、免疫荧光技术与流式细胞术等试验原理基础上建立的一种新型免疫学试验方法。
1 材料和方法
1.1 试 剂
红色荧光微球：（Spherotech，Inc）直径为4.0 μm，108个·mL-1；EDC[1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）-碳二亚胺]：购自美国SIGMA公司；NHS（N-羟基琥珀酸亚胺）：购自美国SIGMA公司；禽流感H5亚型单克隆抗体购自扬州大学；禽流感H5亚型基因工程表达抗原购自扬州大学；禽流感病毒多克隆抗体由本研究组自行研制；FITC标记的羊抗小鼠荧光抗体：购自SIGMA公司；FITC标记的羊抗兔荧光抗体：购自SIGMA公司；0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液（PBS）：pH=7.4；家兔：购自白求恩医大试验动物中心。
1.2 试验方法
1.2.1 兔抗禽流感抗体的制备及纯化 多克隆抗体制备的免疫方法采用背部多点注射法。选取两只成年公兔，注射禽流感H5亚型灭活疫苗每只1 mL。免疫3次后，测定抗体的效价。当抗体效价达到210以上时，心脏采血分离血清。将血清纯化、浓缩后测定蛋白含量至1 mg·mL-1以上，分装后置于4 ℃冰箱保存。
1.2.2 ELISA法确定抗体与抗原的匹配性 应用PBS缓冲液将单克隆抗体稀释成10，5.0，2.5，1.0 μg·mL-1后，于96孔ELISA酶标板纵行包被，放置在4 ℃冰箱过夜，洗涤后加入1%的封闭液BSA，恒温37 ℃封闭1 h，洗涤3次后加入1∶10稀释的禽流感H5亚型表达抗原，放置37 ℃1 h，取出后洗涤。酶标板中加入5 μg·mL-1的兔抗禽流感抗体，放置37 ℃ 1 h，洗涤后加入稀释的酶标羊抗兔IgG二抗，放置37 ℃1 h，洗涤后加入临时配制的底物溶液，显色反应15 min，于反应孔中加入2 mol·L-1硫酸终止反应。450 nm波长下测定OD值。阴性对照同时进行。以此确定单克隆抗体和多克隆抗体与抗原是否匹配。
1.2.3 单克隆抗体的固定 取1 μL直径为4.0 μm羧基荧光微球原液，加入EDC和NHS溶液活化30 min，用pH值7.4的PBS缓冲溶液离心洗涤已活化的微球，加入100 μL禽流感H5亚型单克隆抗体与微球连接，放置摇床于室温振荡2 h。充分离心洗涤后加入含有1%BSA的100 μL PBS溶液，室温振荡2 h后放置在4 ℃冰箱过夜，以此阻断微球表面的未反应位点。
1.2.4 微球双夹心法的流式测定 将连接了单克隆抗体的微球离心洗涤后置于100 μL的PBS溶液中。将一定量的禽流感阳性抗原加入，放置于室温振荡2 h。离心洗涤微球以去除未反应的阳性抗原。再加入一定量的禽流感多克隆抗体，放置于室温振荡2 h。将微球充分离心洗涤使未反应的抗体去除。最后加入一定量的FITC标记的羊抗兔荧光抗体，置摇床室温振荡2 h。离心洗涤3次，去除未反应的羊抗兔荧光抗体。重新将微球放于100 μL的PBS溶液中，然后用流式细胞仪分析测定获得标准曲线。
2 结果与分析
2.1 双夹心ELISA筛选结果
应用双夹心ELISA试验来检测单克隆抗体和多克隆抗体是否匹配的结果见表1。重复3次，设阴性对照。不同浓度的单克隆抗体所测得的OD值在1.5左右，阴性抗原的OD值平均为0.15，以P/N=2.1为临界点，即0.16×2.1=0.315为临界点，测定的OD值大于0.315时即为阳性，如表1结果所示，测定的OD值均为阳性，说明单克隆抗体、抗原、多克隆抗体三者相匹配。
2.2 单克隆抗体连接量的确定
将禽流感单克隆抗体用PBS溶液稀释成不同的浓度后与活化微球连接，洗涤3次后加入FITC标记的羊抗小鼠荧光抗体与之反应，通过流式细胞仪检测的荧光信号强度确定单克隆抗体的最佳工作浓度。当FITC绿色荧光信号与微球的红色荧光信号被同时检测出，即达到了“双阳性”时，说明微球与抗体已连接。已连接抗体的微球与微球总数的比值用连接率表示。结果如表2所示，当单克隆抗体连接浓度为300 μg·mL-1时，平均连接率达到 87.6%，因此确定300 μg·mL-1为单克隆抗体的最佳反应浓度。
2.3 多克隆抗体最佳反应浓度的确定
将活化的荧光微球与最佳浓度单克隆抗体连接后加入1%的BSA进行封闭，然后加入过量的抗原与其连接，最后加入不同浓度的多克隆抗体及一定量的FITC标记的羊抗兔荧光抗体。应用流式细胞仪检测反应体系，当微球的红色荧光信号与荧光抗体的FITC绿色荧光信号被同时检测到，即达到了“双阳性”时就可确定多克隆抗体最佳浓度及与微球的连接率。试验结果表明，当多克隆抗体的浓度为150 μg·mL-1时，平均连接率达到 87.5%，如图1所示。
3 结论与讨论
3.1 单克隆抗体与荧光微球的连接
微球表面连接的单克隆抗体数量的多少与最终检测信号强度的高低有直接关系。但是当单克隆抗体在微球表面饱和时，连接率不会随着单克隆抗体浓度的增加而有所提高。同时应用未活化的微球与一定量的荧光抗体进行反应，检测荧光抗体与荧光微球的非特异性结合能力，试验结果表明未活化微球与荧光抗体之间无非特异性结合。由此看来，此方法可以避免非特异性反应，优于传统的ELISA 方法。
3.2 连接方式比ELISA方法更稳定
微球与单克隆抗体的连接不同于传统的ELISA方法，ELISA方法是通过单克隆抗体与聚苯乙烯本物理结合（非特异性吸附），疏水连接的。而基于微球的流式细胞检测方法是通过共价键与微球结合的，非常稳定。
3.3 数据的读取与重复性
在传统ELISA方法的重复过程中有很大的变化，并且不同孔之间也有很大的变化。它是一种间接和动态的方式，在酶的扩大效应下以颜色的变化量来读取数据，在扩大效应中容易出现错误。流式细胞术分析方法的特点是它与传统的ELISA方法相比更加准确和敏感。用流式细胞仪检测时，使单个微球逐个通过激光器，读取的是荧光数据，数据结果更加直接、敏感、稳定。
参考文献：
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我是一名h7n9禽流感病毒，今天我是作为一名使者，作为禽流感病毒王国的使者出访中国。作为禽流感病毒，我不曾考虑中国是否欢迎我们的到来，但是我们还是来了一大队人马。很庆幸，我一来，就有暂住地，就是安徽省了。
我们十分开心，继续走南闯北，业绩辉煌。
我们在中国引发了一场没有硝烟的战争，全国人民都投入到抗战中，天天用消毒水喷养鸡场、养鸭场，连运鸡、鸭的车上也喷了消毒水，使我们无从下手。可是我们仍不死心，以与中国交界的城市为大本营，还在北京、安徽、广州等地扎下根据地，搅得那里鸡犬不宁。但是，好景不长，科研所的叔叔阿姨们每天在加紧研制消灭我们的.药物及预防我们的疫苗。我们的军队在中国人民万众一心的抗击下已经溃不成军了，然而，我们绝不甘心就这样败退，我们还要卷土重来!
Swine Flu in Humans
Can humans catch swine flu?
Swine flu viruses do not normally infect humans. However, sporadic human infections with swine flu have occurred. Most commonly, these cases occur in persons with direct exposure to pigs (e.g. children near pigs at a fair or workers in the swine industry). In addition, there have been documented cases of one person spreading swine flu to others. For example, an outbreak of apparent swine flu infection in pigs in Wisconsin in 1988 resulted in multiple human infections, and, although no community outbreak resulted, there was antibody evidence of virus transmission from the patient to health care workers who had close contact with the patient.
猪流感与人类
人类会感染猪流感吗?
一般来说猪流感并不会感染人类，但人们已经发现了少数人类感染猪流感的病例。这些病例大部分出现在与猪有直接接触的人群中(例如，市场上与猪接触的儿童，以及养猪业的工人)。另外也有一些病例是猪流感从一个人传染到另一个人的`情况，例如1988年在威斯康星爆发的猪流感造成了多人感染。尽管猪流感没有在社区中传播开来，但抗体实验证实病毒从病人传播到了与其有近距离接触的医护人员身上。
What are the symptoms of swine flu in humans?
The symptoms of swine flu in people are expected to be similar to the symptoms of regular human seasonal influenza and include fever, lethargy, lack of appetite and coughing. Some people with swine flu also have reported runny nose, sore throat, nausea, vomiting and diarrhea.
人类感染猪流感的症状是什么?
人类感染猪流感的症状预计会与人类感染季节性流感的症状类似，包括发烧，瞌睡，厌食以及咳嗽。一些感染猪流感的病人出现了流鼻涕，咽喉痛，恶心，呕吐以及腹泻的症状。
Can people catch swine flu from eating pork?
No. Swine influenza viruses are not transmitted by food. You can not get swine influenza from eating pork or pork products. Eating properly handled and cooked pork and pork products is safe. Cooking pork to an internal temperature of 160°F kills the swine flu virus as it does other bacteria and viruses.
吃猪肉会感染猪流感吗?
关键词：板蓝根不同提取物,甲型流感病毒,存活天数和死亡率
板蓝根别名靛青根、蓝靛根、靛根,是十字花科植物菘蓝(Isatisindigotica Fort)的根。具有清热解毒、凉血利咽之功效,广泛用于治疗多种疾病如流感、温病发热、风热感冒、咽喉肿烂、流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎等。为传统的抗病毒中药之一,随着现代医学理论及实验技术广泛应用于中医药的研究,对板蓝根的基础研究日趋深入,其临床应用范围也逐步拓宽。目前认为板蓝根中靛蓝、靛玉红等成分为其抗病毒的有效成分,但现有的研究表明靛蓝、靛玉红没有抗病毒活性[1,2]。为探讨板蓝根的抗病毒作用,我们进行了板蓝根不同提取物的抗病毒实验研究,现将结果报道如下。
1 实验材料
1.1 实验药物
板蓝根不同提取物(1～5)号:由南京中医药大学提供,板蓝根颗粒:由南京中医药大学提供利巴韦林颗粒中国药科大学制药有限公司;生产批号:080304;乙醚南京化学试剂有限公司;生产批号:0612281;鸡胚9日龄南京中牧药械股份公司提供。
1.2 实验用病毒
甲型流感病毒A/PR/8/34,中国预防医学科学院病毒所提供。
1.3 实验用仪器
FA1004电子分析天平;上海天平厂;净化工作台;苏州净化设备厂;孵箱;上海分析仪器厂;24孔微孔板;美国corning公司。
1.4 实验条件与统计方法
ICR级小鼠随机分组、分笼饲养,自由饮水,喂全价颗粒饲料,室温(22±2)℃,湿度(55～65)%,实验结果统计采用卡方检验和T检验。
(*P<0.05;**P<0.01与模型组比较)
1.5 实验动物
ICR小鼠:由扬州大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(苏)2007-0001。
1.6 实验分组
①病毒对照组:等量NS;②利巴韦林颗粒组:50mg/kg;③板蓝根颗粒组:5g/kg;④板蓝根提取物1号组:0.67g/kg;⑤板蓝根提取物2号组:1.0g/kg;⑥板蓝根提取物3号组:1.67g/kg;⑦板蓝根提取物4号组:1.12g/kg⑧板蓝根提取物5号组:1.71g/kg。
2 实验方法和结果[3,4,5]
2.1 甲型流感病毒鸡胚抗毒试验
取9龄鸡胚,于照蛋机上标记气室,放置无菌室内用25%乙醇和2%碘酊分别消毒2次后用砂轮轻轻磨一小口(为针尖大小),取甲型流感病毒毒株粉末加*0.5ml生理盐水混匀[分(2～3)次],吸出后用生理盐水稀释至2ml,吹打后每只鸡胚接种0.2ml甲型流感病毒毒液,用石蜡封口后,置(37±0.5)℃孵箱培养48h。取出鸡胚置4℃冰箱内过夜,次日取出,用75%乙醇和2%碘酊消毒后,除去石蜡封口处,打开气室,用无菌吸管吸取尿囊液,弃去混浊尿囊液,以上收集为抗毒一次,重复2次后用于实验,实验前作血凝试验。
2.2 血凝试验
取24孔微孔板,每孔加入生理盐水0.5ml,(第1管加NS0.9ml),将抗毒3次病毒尿囊液0.1ml加入第1孔混匀后加入第2孔0.5ml,依次稀释至第8孔,第9孔不加病毒,做空白对照,随后每孔加入0.05ml 0.5%鸡红细胞,轻轻混匀后置室温放置2h后观察记录。实验结果判断:血凝滴度在640以上有(2、4、5、6、8)号,可以用于体内感染实验。
2.3 甲型流感病毒感染小鼠致死量(LD50)测定
取ICR小鼠56只,体重(13～16)g,雌雄各半,随机分7组,每组8只,取血凝试验在640以上的尿囊液(不同编号)2支,吹打后,以10倍稀释,在乙醚浅麻醉下,每组滴1个病毒浓度,观察14d内死亡数,按Reed Muench法计算LD50。实验结果LD50=10-165即病毒浓度为10-1.65时,可使感染小鼠半数死亡。
2.4 板蓝根提取物对甲型流感病毒感染小鼠的死亡保护作用。
取ICR小鼠160只,体重(13～16)g,雌雄各半,随机分为8组,每组20只。各组动物均灌胃给药,给药量10ml/kg,每日一次,连续7天。于给药当日,各组小鼠在乙醚浅度麻醉下,以血凝滴度640以上的甲型流感病毒尿囊液给小鼠滴鼻感染,每只鼠50μI。观察动物感染甲型流感病毒后发病及死亡情况,记录14天内死亡数。实验结果见表1。
3 讨论
流感在中医学中称为“时行感冒”,属疫疠类(即传染病),认为感受风邪侵袭,而机体免疫力低不足抗阻而病,尤当气候突变、寒暖失常时更易发病。中药抗流感病毒的基本作用机理正是扶正祛邪或祛邪扶正。虽然每味中药组成成分比较复杂,中药方剂作用机理也更为复杂,但中草药抗流感病毒途径主要有两条:直接灭活或抑制病毒和通过诱生干扰素或调节人体免疫功能而间接抗病毒。[6,7]
板蓝根具有清热解毒,凉血之功效。临床上广泛用于治疗肝炎、腮腺炎、流感、丹毒、流脑和扁桃体炎等病毒、细菌性疾病。长期以来,人们一直认为板蓝根中靛蓝、靛玉红等成分是板蓝根抗病毒、抗菌的有效成分,并把它的含量作为控制板蓝根制剂质量的指标,但实验表明,靛苷在动物的胃、小肠和盲肠中均被分解破坏,而且自体内排出很快,体外也无明显的抗病毒活性。为了探讨板蓝根抗流感病毒的有效成分,我们分别观察了板蓝根不同的水提液和醇提取液对甲型流感病毒A/PR/8/34的作用,从实验结果可看出,板蓝根2号提取液组和板蓝根3号提取液组可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数和降低死亡率,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。板蓝根1号提取液组和板蓝根4号提取液组可明显延长甲型流感病毒感染小鼠存活天数,与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。板蓝根5号提取液组未显示抗甲型流感病毒的作用,提示:板蓝根2号提取液和板蓝根3号提取液具有较好的抗甲型流感病毒的作用。其抗流感病毒的活性成分有待进一步研究。
参考文献
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[6] 王满霞,孙刚,王笑红等阿普林津对小鼠流感病毒作用的实验研究[J].美中医学,2005;2(3) :54～57
流感病毒的结构
流感病毒多呈球形,直径在80～120纳米之间,约为万分之一毫米。流感病毒的外观和内部结构很像树上结的板栗果。板栗果表面有很多刺突,刺突连在一个软壳上,剥开软壳,能看到一个硬壳,打开硬壳,就是板栗仁——板栗树的种子。流感病毒的表面也布满刺突,刺突有数百个,分别呈柱型和蘑菇型,是两类糖蛋白,柱型刺突叫血凝素,英文缩写为H,蘑菇型刺突叫神经氨酸酶(也叫唾液酸苷酶),英文缩写为N。刺突都嵌在一层磷脂双分子膜上,膜上还嵌有膜蛋白,构成的整体叫病毒的包膜。在这层包膜之下,是病毒的衣壳,由基质蛋白构成,衣壳的作用是维系病毒的空间结构和保护病毒的核心。衣壳之内就是病毒的核心,含流感病毒的遗传物质单股负链RNA、核蛋白和负责RNA转录的RNA多聚酶——当这一核心部分进入了活细胞中,病毒的复制就会开始。被病毒侵入的细胞,叫宿主细胞,由细胞膜、细胞质(胞浆)和细胞核组成。
流感病毒的感染过程
普通动物细胞的直径约为10微米,因此,动物细胞约比流感病毒大100倍。在自然界中,流感病毒的宿主动物有鸟类和哺乳类。在人生活的环境中,流感病毒能让人、猪、马和禽类动物得病。致病原因是病毒进入了这些动物的细胞中,并开始自我复制,其过程主要分五步进行:第一步,流感病毒通过鼻或口进入动物体内,到达呼吸道(少数在肠道)。在那儿,病毒包膜上的血凝素刺突(H)与动物呼吸道粘膜上皮细胞表面的唾液酸受体相结合,引发细胞吞饮,病毒得以进入细胞;第二步,在胞浆中,病毒包膜与细胞膜发生膜融合,释放出病毒的核心部分——遗传物质与相关酶;第三步,宿主细胞开始按照病毒的遗传信息大量合成病毒蛋白(包膜上的糖蛋白、膜蛋白,衣壳基质蛋白,还有核蛋白和RNA多聚酶),同时在细胞核内,病毒的遗传物质得到不断复制;第四步,新合成的病毒蛋白、病毒遗传物质与宿主细胞膜共同组装新病毒颗粒, 以出芽方式释放到细胞外;第五步,新病毒颗粒表面的血凝素(H)会经唾液酸与宿主细胞膜相联,在神经氨酸酶(N)的剪切下,新病毒颗粒得以彻底脱离宿主细胞,去感染下一个目标。
流感病毒的致病症状与致死性
流感病毒对宿主细胞的整个感染过程,会导致宿主细胞变性、坏死或脱落,表现为粘膜充血、水肿和分泌物增加。在人体,症状即是鼻塞、流涕、咽痛、干咳等上呼吸道感染症候。此外,宿主细胞坏死释放的产物、病毒的代谢过程都会激发体内产生免疫反应,引起一系列细胞因子的释放或浓度变化,导致发烧、头痛、全身肌肉疼痛等症状。如果病毒继续蔓延,进犯到下呼吸道,就可能导致肺部炎症。世界卫生组织指出:在2009甲型H1N1流感大流行中,病毒性肺炎是最常见的重症病例,经常导致死亡。重症病人一般在出现症状3～5天左右病情开始恶化,恶化速度很快,许多病人在24小时之内就可发展到呼吸衰竭程度。还有报道指出:流感病毒感染导致的“细胞因子风暴”会引起严重的组织损伤或死亡,这是由于过强的炎症反应所致。截至到2009年11月1日,世界卫生组织统计到的2009甲流H1N1致死病例为至少6071例,已超过2003年非典给全球造成的死亡人数(共919例)。
抗流感病毒的西药种类
临床应用的抗流感病毒的西药只有两类:一类可作用于流感病毒膜蛋白和血凝素,因而能阻止病毒进入宿主细胞。药物叫金刚胺类,包括金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)。但目前在世界上传播的40多种流感病毒中,超过90%已对此类药物产生了耐药性,故金刚胺类已不能作为防治流感的首选西药。另一类是神经氨酸酶抑制剂,能阻止新病毒颗粒离开宿主细胞,因而能阻止病毒的蔓延。有奥司他韦(oseltamivir,商品名:Tamiflu,译名:达菲)和扎那米韦(zanaminvir,商品名:Relenza,译名:乐感清)两种。达菲是片剂,乐感清是吸入剂。在世界卫生组织网站上,有一题为“用抗病毒药物治疗甲型H1N1流感”的条目指出:“只有在医务人员的建议下,才应服用奥司他韦和扎那米韦等抗病毒药物。个人不应在无医生处方的情况下自行购买药物以预防或对付这一新流感”。为避免病毒产生耐药性,世界卫生组织不主张健康者使用此类药物来预防甲型H1N1流感。
流感病毒的疫苗防控
人类流感病毒根据核蛋白的抗原性不同而分为甲、乙、丙三型。在甲型流感病毒中,根据血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的抗原性不同而分出了10多种亚型。抗原性不同是因为血凝素或神经氨酸酶的分子结构发生了变化,因此,病毒被分别命名为H1N1、H2N2、H3N2等。在甲、乙、丙三类流感病毒中,甲型极具变异性,乙型次之,丙型的抗原性则非常稳定,所以,采用注射疫苗的方式来预防流感最适合丙型。当前,甲型H1N1流感病毒的疫苗正在被广泛用于人群接种,但由于甲型流感病毒变异快,一旦变异,疫苗激发人体产生的抗体就可能失去作用。世界卫生组织预言:2009甲型H1N1流感大流行可能会持续1～2年。
中药对流感的治疗作用
在中医古籍出版社出版的《中医临床200解》书中,笔者查到对流感的主方:羌活、芥穗、防风、连翘、山豆根、蚤休、麦冬、元参。显然,与单一成分和单一作用位点的西药相比,中药具有多种成分的特点,这也许正是对付流感病毒的法宝——多位点同时作用,或直接或间接地清除病毒。尽管中药治流感的机理还不为现代科学所理解,但中国长期的实践证明:及时服用中草药,对流感的预防和治疗效果明显,并能大大降低死亡率。2008年5月《亚太传统医药》杂志发表一篇题为“流感病毒致病特点及抗流感病毒中药活性成分与部位研究进展”的文章,文中指出:抗流感的中药多为清热解毒类,所含成分主要有黄酮类、生物碱、多糖、氨基酸和挥发油等。依据国内外多个实验室的数据,文章对此五类中药成分的作用机理进行了如下归纳:1、挥发油类 能抑制流感病毒的增殖,减轻感染病毒动物肺部的感染体征;2、黄酮类 能抑制流感病毒生长,抑制唾液酸酶活性,抑制膜融合,刺激免疫细胞产生抗病毒感染的干扰素;3、生物碱类 能直接抑制病毒,可诱生干扰素;4、多糖类 有调节免疫细胞和细胞因子的功能,有膜稳定作用,通过诱导干扰素、NK细胞活性来杀灭部分病毒,减轻对心肌细胞的损害;5、氨基酸类 对流感病毒的增殖有抑制效应。从中可看到,中药对流感的医治,不仅能直接作用于病毒,还能通过刺激免疫细胞产生干扰素来增强机体抗病毒感染的能力。中药调节细胞因子的作用能减轻炎症反应。所有这些,都有利于降低流感的死亡率。
流感病毒的存活能力
在动物体外,哺乳动物的流感病毒暴露于干燥的热空气中极易失活,但却能在粘液中存活数小时。禽流感病毒能在笼舍粪便中存活两周,但可通过堆肥被迅速灭活。冰冻时,禽流感病毒能无限期存活。脂溶剂和去污剂能使流感病毒灭活,比如:漂白粉、酒精、醛类、氧化剂类和季铵化合物类。加热灭活流感病毒的方法是:在摄氏56度至少保持60分钟。PH<2时,流感病毒也能被灭活。
为提高甲型H1N1流感的防控和应对能力，做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗”，控制疫情在学校的传播、蔓延，保障师生的身体健康和生命安全，维护正常的教学秩序，特制定甲型H1N1流感疫情检测、报告及控制制度。
1、甲型H1N1流感疫情监测
1）、建立建立晨午检、消毒、隔离制度和学校因病缺课症状监测网络直报系统，对体温38℃、伴有咽痛或咳嗽之一症状的患者实施重点检测。发现可疑病人应及时隔离，并向校长汇报通知家长。
2）、重视信息的收集，掌握了解本地及周围地区甲型H1N1流感疫情的情况，密切关注其动态变化，以便做好预防工作。
2、甲型H1N1流感疫情报告 1）、疫情报告负责人：刘刚强
2）、学校实行24小时值班、带班制，开通疫情监控联系电话，确保信息畅通。
2）、严格执行学校甲型H1N1流感疫情报告程序，班级由班主任负责报告疫情报告负责人，疫情报告负责人向中心校实行“日报告”制度和“零报告”制度。
3）、如学校出现甲型H1N1流感疫情，应按照《传染病防治法》中规定的传染病报告时限及程序进行报告。各班主任获知疫情或疑似疫情后应立即报告政教处，政教处在报告学校防控领导小组后，学校指定疫情报告人立即以最快捷的通讯方式报告卫生院，同时向中心校报告。
3、甲型H1N1流感疫情发生后的控制措施
1）、学校防控应急领导小组负责领导、组织、协调开展防控工作，在上级教育行政主管部门指导下开展对突发甲型H1N1流感的监测，积极配合卫生部门做好控制工作。
2）、积极配合当地医疗机构组织对学校内出现的病人或疑似病人进行诊治。
3）、患病学生应立即隔离，并做好隔离学生的思想工作和补课等工作；对相关教室采取消毒措施。按照上级有关部门指示，对有疫情发生的班级要严格落实停班停课措施。患病学生的复课要严格按照上级有关部门的具体要求进行。
道高一尺，魔高一丈
流行感冒是由病毒引起的，而对付病毒，我们原先有一套百试不爽的办法，即接种疫苗，人类靠这种办法已经基本消灭了天花和麻疹。但对于流行感冒，麻烦的是流感病毒变化太快，科学家好不容易研制出一种疫苗，流感病毒就进化出新的类型，我们又奈何它不得了。
原来流感病毒身上有两类蛋白，一种是表面蛋白，一种是内部蛋白。表面蛋白容易被疫苗识别，所以过去人们研制的疫苗基本上都是针对病毒的表面蛋白的。但流感病毒很狡猾，它的表面蛋白进化很快，对它来说，就好像衣服一样，随时都可以换。衣服一换，疫苗就认不出它了。这也是迄今的流感疫苗失败的地方。
人体“特种部队”出击
但不管流感病毒怎么变化，它总还有不变的东西，那就是内部蛋白。如果针对流感病毒身上这万变不离其宗的东西研制疫苗，那就可以杀死一切流感病毒。这就是所谓的“万能疫苗”。
“万能疫苗”是如何杀死一切流感病毒的呢？除了抗体，其实我们的免疫系统里还有一支“特种部队”可以利用。这就是一种叫T细胞的白血细胞，因为它能识别病毒的内部蛋白，所以是比抗体更厉害的杀手。而“万能疫苗”只要能够激活T细胞，就可以杀死一切流感病毒。
对流感要斩尽杀绝
研制出万能疫苗来对付流感，正是许多科学家的梦想。2012年，英国牛津大学的一位科学家就研制出这样一种疫苗，它能激活我们免疫系统里的T细胞。这位科学家称，这种疫苗用在某些刚传染上流感病毒的人身上，阻止了他们的发病，用在另一些已经出现症状的人身上，症状也减轻了。在鸡身上测试这种疫苗，发现鸡群里传染的病毒也少了。
当然，目前最理想的是把这种疫苗跟传统的疫苗混合使用。让传统的疫苗激发免疫系统制造更多的抗体，去攻击病毒的表面蛋白；让这种新型疫苗激发免疫系统的T细胞，去攻击流感病毒的内部蛋白。这样就能达到事半功倍的效果。在小鸡身上做的实验表明，抗体能够击败大部分的流感病毒，而T细胞则做扫尾工作，不让那些劫后逃生的病毒潜伏下来，伺机卷土重来。
因为这种疫苗能对付所有类型的流感，所以我们就可以大规模生产并储备起来，以防流感流行。在抗击流感的斗争中，人类第一次争得了主动权，借用一位科学家的话说“现在我们迫使流感坐到了谈判桌子上”。摘自《大科技·科学之谜》
1 材料与方法
1. 1 病毒和 SPF 鸡胚
马EIV A/马/新疆/3 /2007 ( H3N8) 毒株和A/马/北京/1 /1974 ( H7N7) 毒株、马传染性贫血病毒( EIAV) 辽毒株、马动脉炎病毒( EAV) Bucyrus毒株、1型和4型马疱疹病毒( EHV1和EHV4) ,均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室马传染病和慢病毒研究团队保存。9日龄SPF鸡胚,购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1. 2 主要试剂
DL - 2 000 Marker、p MD19 - T Simple载体、Ex Taq DNA聚合酶、感受态细胞DH5α、M - MLV反转录酶,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 胶回收( 小量) 试剂盒、质粒 ( 小量) 提取试剂盒,均购自OMAGE公司; QIAamp Viral RNA提取试剂盒,购自QIAGEN公司; Sso FastTMEva Green supermix预混液,购自Bio - Rad公司。
1. 3 引物的设计与合成
分析Gen Bank上公布的H3N8亚型EIV HA基因序列,选择高度保守的HA基因编码区作为扩增片段。根据EIV A/马/新疆/3 /2007 ( H3N8) 毒株HA基因序列( EU794559. 1) 设计、筛选1对特异性引物[序列为: 上游引物 ( H1) 5' - GCATCTCCAACGACAAGCCATTC - 3',下游引物 ( H2 ) 5' - ACCACCCATCAACCATTCCTTCC - 3']和流感病毒的通用引物Uni - 12( 序列为5' - AGCAAAAGCAGG - 3') 。引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。
1. 4 病毒的培养
EIV用9日龄SPF鸡胚培养,培养条件为35 ℃ ,湿度为60% ~ 70% 。培养72 h后,置于 - 20 ℃ 预冷1 h,凝固血管。
1. 5 病毒 RNA 的提取及其反转录合成 c DNA
根据QIAamp Viral RNA提取试剂盒说明书进行操作,分别提取EIV、EIAV、EAV的RNA,由于EHV是RNA病毒,对EHV也做相同处理。在20 μL的反转录体系中加入病毒总RNA 8 μL,加入Unit - 12( 20 pmol/μL) ,反转录缓 冲液5 × Buffer 4 μL,2. 5 mmol / L d NTP 4 μL,70 ℃ 水浴5 min; 迅速冰浴5 min; 快速加入200 U / μL M - MLV 0. 5 μL,40 U / μL RNase Inhibitor 0. 5 μL,37 ℃ 水浴1 h; 再放于70 ℃水浴10 min; 立即置冰上冷却,保存,备用。
1. 6重组标准质粒 p MD19 - T Simple - HA 的构建及鉴定
常规PCR反应扩增EIV A/马/新疆/3 /2007( H3N8) 毒株c DNA片段,引物为H1和H2,在50 μL反应体系中加Ex Taq DNA聚合酶0. 5 μL,10 × Ex Taq Buffer( Mg2 +Plus) 5 μL,2. 5 mmol / L d NTP 4 μL,c DNA 5 μL,引物H1和H2各1 μL,用DEPC处理水补足50 μL。反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共30个循环; 72 ℃ 10 min后,4 ℃ 保存。扩增片段大小为192 bp,用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后进行胶回收,与p MD19 - T Simple载体连接,转化DH5α 感受态细胞,取菌液PCR初步鉴定正确的阳性质粒菌落送往哈尔滨博仕生物技术有限公司测序,测序结果与NCBI上的EIV A/马/新疆/3 /2007( H3N8) 毒株HA基因序列( EU794559. 1)进行比对。
1. 7 标准质粒的实时荧光定量 PCR 检测
模板为已 鉴定好的 标准质粒p MD19 - T Simple - HA,计算其拷贝数,用DEPC处理水将标准质粒稀释成1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103拷贝/μL。在20 μL反应体系中加Eva Green预混液10 μL,H1、H2引物各0. 2 μL,模板2 μL,用DEPC处理水补足20 μL。扩增条件: 95 ℃ 3 min; 95 ℃25 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共40个循环。熔解条件: 95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s。绘制标准质粒扩增曲线、标准曲线以及熔解曲线。
1. 8 实时荧光定量 PCR 方法的评价
1. 8. 1敏感性将稀释成1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101拷贝 /μL浓度梯度的标准质粒,按1. 6中的反应体系和反应条件进行扩增,检测该方法的敏感性。
1. 8. 2特异性以按1. 4方法制备H3N8亚型EIV、H7N7亚型EIV、EIAV、EAV、EHV的c DNA作为模板,按1. 6中的反应体系和反应条件进行扩增,检测该方法的特异性。
1. 8. 3重复性选择高、中、低不同浓度的H3N8亚型EIV的c DNA作为模板,连续3次进行反应,每次各浓度做3个平行管,计算试验内以及试验间Ct的变异系数( CV) ,检测该方法重复性。
2 结果
2. 1 标准质粒 p MD19 - T Simple - HA 鉴定结果
经1% 琼脂糖凝胶电泳分析,目的条带大小为192 bp,与预期结果相符 ( 见图1 ) 。测序结果与HA基因序列( EU794559. 1) 的同源性为100% 。
2. 2 标准曲线
以1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103拷贝/μL的标准质粒作为模板进行扩增,得到扩增曲线( 见图2) 和熔解曲线( 见图3) 。由图3可见,在Tm值为81 ℃出现特异性的熔解峰。然后根据标准质粒拷贝数浓度的对数与Ct值的关系得到标准曲线( 见图4) ,其相关系数为0. 994,扩增效率达到103. 7% ,表达式为Y = - 3. 237 lg X + 39. 54。
2. 3 敏感性
将1 × 108、1 × 107、1 × 106、1 × 105、1 × 104、1 ×103、1 × 102、1 × 101拷贝/μL的标准质粒p MD19 - TSimple - HA进行扩增,即得到灵敏度检测的扩增曲线,见图5。
M. DL - 2 000 Marker ; 1. 空白对照; 2. p MD19 - T Simple - HA ; 3. EIV c DNA。
结果表明,该方法最低检测限为10拷贝/μL。
2. 4 特异性
将H3N8亚型EIV、H7N7亚型EIV、EIAV、EAV、EHV的c DNA标准质粒分别作为模板进行扩增,即得到特异性扩增曲线,见图6。H3N8亚型EIV和标准质粒有扩增曲线,其他病毒无扩增曲线,该方法具有良好的特异性。
2. 5 重复性
选择高、中、低不同浓度的EIV c DNA分别进行3次重复试验,每次各浓度做3个平行管,得到组内以及组间试验的变异系数,见表1。
由表1可以看出,变异系数均小于10% ,表明该方法具有良好的重复性。
3 讨论
Q. Michelle等[9]采用SYBRGreen Ⅰ染料法建立了荧光定量RT - PCR检测EIV方法,根据EIV M基因设计了1对特异性引物对EIV的DNA进行扩增。SYBRGreen Ⅰ 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料,SYBRGreen Ⅰ只与双链DNA结合才能发出荧光,荧光信号与双链DNA分子数成正比,随着扩增产物增加而增加,荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量,但是其存在荧光背景高,特异性低。戴伶俐等[10]针对H3N8亚型EIV HA基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条Taq Man荧光探针,建立了Taq Man荧光定量PCR方法,但是这个方法操作繁琐,成本较高。Eva Green是最近新出现的绿色荧 光核酸染 料,它有很多 优点: 首先,Eva Green有良好的水解稳定性和热稳定性,大大降低了常规操作中存在的不便; 第二,Eva Green本身没有荧光, 但和ds DNA结合后能发出高亮度的荧光,这种特性使其特别适合于实时定量PCR的应用; 第三,和广泛使用的SYBRGreen Ⅰ 相比,Eva Green对PCR的抑制更小,更不容易产生非特异性扩增; 第四,成本较低。
笔者针对H3N8亚型EIV HA基因高度保守序列建立了Eva Green实时荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法具有特异性好、敏感性高、重复性强等优点; 因此,Eva Green实时荧光定量PCR方法有望成为新的马流感病原诊断方法。
摘要：为了特异性地检测H3N8亚型马流感病毒,试验根据H3N8亚型马流感病毒(EIV)HA基因特异保守序列设计1对引物,建立了检测H3N8亚型EIV的Eva Green实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行评价。结果表明:该方法能特异性地扩增H3N8亚型EIV,而对H7N7亚型EIV、马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、马疱疹病毒均无特异性反应;最低检测限度能达到10拷贝/μL;并且该方法具有良好的重复性。说明Eva Green这种新型荧光染料可以敏感有效地检测EIV,可用于马流感的诊断。
