微生物实验（精选8篇）
分别在茯茶“发花”不同阶段取样，采用稀释涂布平板法，对样品中的微生物进行分离、纯化和计数。
1.1 分离培养基
细菌分离：
采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水lO00mL。将上述成分溶解定容，调pH7.2～7.4，分装，12l℃灭菌20min。倒平板前按50μg/ml的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用）。酵母菌分离: 采用YPD培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH自然，113℃灭菌30min。霉菌分离：
采用PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，定容至1000mL，添加20g葡萄糖和17-20g琼脂并定容至1000mL，121℃灭菌20min。等降温至55℃左右时，加入氨苄青霉素（或链霉素）50μg/ml(真菌分离计数时用以抑制细菌的生长)。或者加入氯霉素或庆大霉素灭菌之前加入。放线菌分离：
采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、氯化钠0.5g、硝酸钾lg、磷酸氢二钾 0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂18～20g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.4，121℃灭菌20min。可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/l的石炭酸（苯酚）溶液和50μg/ml的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。
察氏培养基(1L)：葡萄糖30g；MgSO4·7H2O 0.5g；NaNO3 3.0g；KCl 0.5g；FeSO4·7H2O 0.01g；K2HPO4 1.0g；琼脂20g(观察霉菌形态用)，如要分离用需要灭菌后加30U/mL链霉素)。
其他鉴定用培养基成分及配方参照周德庆《微生物学实验手册》 1.2 计数方法
计数方法参照GB/T4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》的测定方法 1.3 取样：每隔2天取一次样，每个样至少做1次重复，总共取7次样，为了减少误差，尽量取同一批样。尽量保证茯砖茶中微生物种类和数量不发生较大变化，样品取回后立即进行微生物分离计数。在取样时要测定发花环境（烘房）里的温度、湿度，取回样品后，要测定茶样的含水量和pH值。其余不做微生物分析的茶样应立即放在-20℃的冰箱里低温保存。
pH值的测定：准确称取2.00g茶样，加50ml蒸馏水，置于150ml三角瓶中，在振荡器上振荡浸提20分钟，过滤，滤液置于100毫升烧杯中，然后用通过标准pH溶液校正后的Backman电子酸度计，测定浸提液的pH值，每个试样重复两次。
1.4 分离、纯化茯砖茶中的微生物
菌种分离：以无菌操作分别称取试样25克，投入盛有玻璃珠及225ml灭菌生理盐水的500ml三角瓶内，振荡20min，用无菌移液管吸取1ml菌悬液，加到9ml的无菌水中，然后依次制成10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8等7个浓度梯度的菌悬液，用无菌移液管吸取1ml缓缓注入平板培养基内, 稀释涂布平板培养微生物, 密封置于28 ℃条件下培养, 4～5 d 后菌落长满整个平板。
菌种纯化：根据初分菌落的形态特征, 用接种针挑取各菌落的少量菌丝体, 接种在事先准备好的PDA 琼脂培养基上(每平板内接种3个菌落),进行划线平板培养，菌丝体生长1周后, 根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化, 如此反复, 直至菌落的生长状态和形态特征均表现一致时视为单一菌种的菌落。
1.5 鉴定微生物的种类
借助菌落结构和显微镜观察初步判断微生物的种类，如要进一步鉴定，可通过微生物的生理生化反应和分子生物学深入鉴定。微生物的分类检索鉴定方法
2.1 细菌鉴定
细菌鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)、《一般细菌常用鉴定方法》、《常用细菌鉴定手册》作形态观察和相关的生理生化试验。(1)形态观察：
个体形态观察：在显微镜下观察细胞形态、大小；
菌落形态观察：观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。，(2)染色：革兰氏染色法、芽孢染色法等。(3)生理生化及生态特征鉴定；
过氧化氢酶的测定、氧化酶的测定、好氧性测定、糖或醇类发酵试验、葡萄糖酸盐的氧化试验、V.P试验(乙酰甲基甲醇试验)、淀粉水解试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、H2S产生试验、石蕊牛奶试验、酪氨酸水解试验、精氨酸利用实验、柠檬酸盐或丙酸盐的利用试验、pH生长试验、生长温度的测定以及耐盐性试验等。2.2 酵母菌鉴定
酵母菌鉴定参照《酵母菌的特征与鉴定手册》和《微生物学实验手册》对分离得到的酵母菌进行形态观察和相关的生理生化试验。(1)形态观察：
个体形态观察：无丝营养细胞的显微镜观察、掷孢子的形成和形态观察、子囊孢子的显微镜观察。菌落形态观察。
（2）染色：美兰染色法。
（3）生理生化及生态特征鉴定：碳源同化试验、氮源同化试验、糖类发酵试验、产生类淀粉化合物的测定、在60﹪(w/w)葡萄糖-酵母膏中生长测试、在37℃下做生长温度的测定、脲酶试验等。2.3 霉菌鉴定
参照《真菌的形态与分类》和《真菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。形态观察包括：
（1）菌落形态观察：颜色、大小、表明特征、质地等。（2）个体形态观察：菌丝、子实体、孢子的形态等。2.3 放线菌鉴定
参照《放线菌鉴定手册》等相关文献，做相关的生理生化试验和形态观察。参考文献
[1]（美）杰伊(James M．Jay)．现代食品微生物学(第五版)[M]．北京：中国轻工业出版社，2001：178-155 [2]
专业文献记载了很多关于细菌生物被膜的研究,但目前全国兽医本科高校中还少有报道开设细菌生物被膜的实验教学内容,缺乏对细菌生物被膜的直观认识,不利于学生对微生物课程相关内容的学习。为了拓展综合性设计内容,拓宽学生的微生物知识体系,笔者尝试在现有本科教学条件下,在经典实验教学内容的基础上进行升级改造,开设细菌生物被膜实验,达到充分发挥本科实验教学平台的作用。
1 细菌生物被膜简介
细菌生物被膜最初是美国学者J.W.Costerton[1]提出的专用名词,并得到了国际学术界的广泛认同。细菌生物被膜的基本概念是指由互相黏附的细菌、附着于生物或非生物表面的细菌和包裹细菌的基质共同组成的二元共聚物[1]。包裹细菌的基质由细菌自身在生长过程中不断产生的胞外聚合物(主要为胞外多糖、蛋白和胞外DNA)组成。生物被膜的形成是一个高度复杂的过程,涉及从单个浮游细菌模式和黏附群体模式之间的转换。细菌可在生物或非生物表面形成生物被膜,引起生物膜疾病或导致细菌的污染。生物被膜内的细菌与浮游细菌相比,具有更强的抵抗机体免疫系统的能力,具备更强的耐药性,因此也在兽医学科引起了相关学者越来越多的关注。
2 实验目的
因此,在现有实验室条件下,拟让学生采用肉汤培养和刚果红琼脂实验对实验菌株是否形成生物被膜进行初步鉴定,使学生对细菌生物被膜的生物特性进行了解;再应用阿利新蓝-刚果红联合染色法,对细菌生物被膜进行染色及显微观察,可以在巩固常规实验技能的同时,加强对细菌生物被膜的感性认识。该实验改革内容不仅有助于拓宽学生知识面,激发学习兴趣,而且细菌生物被膜实验技术可以作为综合设计性实验中病原菌生物学特性研究的延伸,有利于充分挖掘高校兽医微生物学本科实验教学平台的作用。
3 材料
3.1 仪器
显微镜(型号为Nikon YS100)、生化培养箱(型号为LRH-150)、电子天平[型号为JA5003(N)]、高压灭菌锅(型号为YXQ-LS-18SI)、电热干燥箱(型号为GZX-DH500-BS-Ⅱ)、冰箱(型号为DW-40L26),均由广西大学动物科技学院微生物与传染病实验室提供。
3.2 菌种
5株沙门氏菌(Salmonella),来源于广西大学动科院微生物与传染病实验室分离保存的菌种。
3.3 试剂
胰酶大豆肉汤培养基(TSB)、普通营养琼脂、营养肉汤、琼脂粉、麦康凯培养基,均购自杭州天和微生物试剂有限公司;冰醋酸,购自广东光华科技股份有限公司;刚果红、考马斯亮蓝、阿利新蓝染料,均购自合肥博美生物科技有限公司。
4 方法
4.1 肉汤的培养
取出-80℃冰冻保存的菌种,恢复至常温,无菌取一环菌液至新配制的TSB肉汤,37℃摇床培养24 h复苏,再取复苏好的菌液至新肉汤管,摇床培养24 h后观察结果。
4.2 刚果红琼脂实验
刚果红培养基的配制:刚果红(40μg/m L),考马斯亮蓝(20μg/m L),LB琼脂(47 g/L),加双蒸水100 m L,于121℃高压灭菌15 min,待温度缓慢降至55℃左右倒入培养皿中制成固体培养基[2]。
用接种环取复苏好的菌液一环接种于TSB肉汤中,培养24 h后,用微量移液器取2μL肉汤培养物,点种在刚果红培养基中,37℃条件下孵育反应24 h,然后置室温中1周观察颜色变化情况。
4.3 阿利新蓝-刚果红联合染色实验
染色液的配制:①阿利新蓝染液:阿利新蓝1 g,冰醋酸1.5 m L,纯化水48.5 m L,混匀,常温保存。②刚果红染液:刚果红1 g,纯化水50 m L混匀,常温保存。
染色步骤:滴纯化水1滴于洁净载玻片上,用接种针从分离的营养琼脂平板上的单个菌落挑取少量细菌与纯化水混匀;再滴加1滴阿利新蓝染液(与纯化水等量),用洗耳球混匀并静置3~5 min,酒精灯火焰加热固定,直到染液水分完全挥发;再滴加少许刚果红染液覆盖染色部分,染色30~60 s,纯化水冲洗至无染料流下,自然室温下干燥,最后用油镜观察(×1 000)[3]。
5 结果
肉汤培养实验结果表明:5株沙门氏菌经肉汤培养后,有3株(1,2,3号菌)使肉汤呈均匀浑浊;有2株(4,5号菌)使肉汤表面试管壁形成了明显的菌环,有一层菌膜沉淀在管底(见299页彩图1)。
刚果红琼脂实验结果表明,不同的菌株表现出不同形态特征的菌落(见299页彩图2)。与肉汤结果相对应,1,2,3号菌的菌落(见299页彩图2A)光滑、湿润;4号菌的菌落(见299页彩图2B)稍微干燥,边缘皱褶明显;5号菌的菌落(见299页彩图2C)干燥皱褶。结果说明4,5号沙门氏菌具备生物被膜形成能力。
进一步进行阿利新蓝刚果红联合染色,镜检结果表明:阳性菌株(4,5号菌)表现为蓝色背景下,细菌呈现红色,细菌多被红色的多糖黏附素包围(见299页彩图3A);而阴性菌株表现为细菌呈蓝色,无红色物质围绕(见299页彩图3B)
6 讨论
在以前的兽医微生物实验教学中,教学内容通常只涉及细菌的基本形态及构造观察,细菌在培养基中的生长表现,未涉及生物被膜实验相关技术,对细菌形成生物被膜的生物特性了解很少,不适应现代微生物的需求。生物被膜是细菌在自然环境中广泛的存在形式,与动物的健康与日常生活密切相关,也跟我们兽医学专业涉及的各种细菌性传染病戚戚相关,可见在兽医本科教学中,设立生物被膜实验课程的必要性。
本实验设计内容连贯,耗时少,耗材便宜,但涉及到的微生物实验技能有培养基的制备、细菌的移植无菌操作、显微镜油镜观察、染色等多项实验技能。本实验设计既可以作为“细菌在培养基中的生长表现及细菌运动力检查”这章内容的补充,亦可作为一个综合性设计实验,让学生自己去探索细菌生物膜的世界。学生不仅能通过本实验的学习,掌握微生物实验基本技能,而且能拓宽学生的视野,跳出经典细菌学只研究浮游生长细菌的局限,促进学生的思维创新和开展创新性研究。
摘要：通过应用肉汤培养和刚果红琼脂法对细菌进行生物被膜形成实验,进一步应用阿利新蓝-刚果红染色法对细菌生物被膜进行染色显微观察,让学生在现有微生物实验教学条件下认识和了解细菌生物被膜的生物特性。结果表明:通过刚果红琼脂培养可以观察到细菌形成了几种菌落;通过染色显微观察,在普通光学显微镜下可清晰观测到形成生物被膜的细菌特殊形态。说明开设细菌生物被膜综合实验可以拓展微生物实验教学内容,尤其是细菌培养性状的观察这一章的实验内容,充分发挥微生物实验教学的平台作用。
关键词：兽医微生物,实验课程,生物被膜,综合实验,创新实验
参考文献
[1]COSTERTON J W.Introduction to biofilm?[J].Int J Antimicrob Agents,1999,11(3/4):217–221.
[2]Van PARYS A,BOYEN F,VOLF J,et al.Salmonella typhimurium resides largely as an extracellular pathogen in porcine tonesils,independently of biofilm-associated genes csg A,csg D and adr A[J].Vet Microbiol,2010,144(1/2):93-99.
摘 要:生物学是一门以实验为基础的科学,实验教学是生物教学中一个非常重要的组成部分。生物实验教学在巩固课堂知识的同时,可以培养学生实事求是、严肃认真的科学态度,提高学生分析问题、解决问题的能力。因此,在日常生物教学中,实验教学应当引起教师足够的重视。
关键词:生物实验 教学
生物学是一门以实验为基础的科学,实验教学是生物教学实施创新教育的重要基础和手段。生物实验教学在生物学科教学过程中有着不可替代的地位和作用,在学生的综合能力尤其是创新能力方面的培养,更是有着其他学科无法比拟的优势。生物实验教学可以帮助学生认知生物,提高环境保护意识,关注工农业生产,并在此基础上理解和巩固生物学知识。生物实验教学能够培养学生发现问题、分析问题、解决问题的能力,使学生初步掌握一些常用的生物实验技能,培养学生实事求是、严肃认真的科学态度和科学方法,并且对激发学生学习兴趣,提高实践能力具有不可替代的作用。所以在实际教学中,教师应该重视生物实验教学,以提高生物课堂教学质量。
在生物教学中生物实验可以为发现生命奥妙提供丰富的感性材料,在生物教学中更有其特有的作用:首先它可以使学生获得丰富的感性认识,加深学生对生物概念的理解,激发学生学习生物学的兴趣;其次可以培养学生的观察和实验能力,发展学生的智力;再者可以使学生初步了解生物学的研究方法,培养学生实事求是的科学态度和遵守纪律、爱护仪器的优良品质。生物实验不仅作为一种有效的教学手段和理论知识教学的辅助,而且是生物教学的重要内容,在教学目标和教学质量评估等方面都有所体现。中学生物实验主要有三种形式:演示实验、分组实验和课外实验。
演示实验可以为学生提供感性认识材料,并在此基础上引导学生探求新知,学生在观察的同时便会伴随积极的思考,它是训练学生创造思维的重要契机。教材中的演示实验从器材、方法到表格设计都是按照规定好的步骤和方法进行实验,教师很少去引导学生思考和探索,所以学生根本不能很好地领会实验的原理和思想,不利于学生创新思维的培养。因此需要教师应善于利用从演示实验的现象中所获得的感性材料,引导学生进行“去粗取精,去伪存真,由此及彼,由表及里”的思维加工,经过科学的抽象,形成概念,进一步做出判断,进行推理,从而实现由感性认识到理性认识的飞跃。同时,在演示实验中,教师应当不拘泥于教材或教参的安排,可以进行一些创新的设计,将一些演示实验改为学生探索性实验。学生根据实验题目设计出具体的实验方案,经过教师审查,然后让学生独立进行实验。同一实验习题可能会有不同的实验设计方案,都可以让学生去实践,并相互交流,比较各自方案的优缺点,以开阔学生的眼界。在实验教学中,教师不失时机地对学生中的标新立异的方法给予肯定、支持和帮助,鼓励学生大胆地猜想和独立地思考,并通过实验否定错误的假设或修正不完善的猜想,从而使学生解决问题的勇气、信心、毅力,科学的批判精神和创造力得到有效的培养。
演示实验和分组实验,教师一般做得都比较好,而对于课外实验则往往是不了了之或简单的布置一下,没有引起教师足够的重视。教师应当在提高课堂实验教学质量外,还要倡导学生配合课内学习,在课外日常生活中,联系实际开展力所能及的生物课外小实验以及解释社会生产、生活中的某些生物现象。课外实验是教师根据教学实际需求,学生按照教师布置的任务,在家里利用一些简单的仪器或器皿独立地进行操作和实验,是生物教学的一种很有效的补充形式。学生课外实验可以扩大知识领域,使理论联系实际,培养学生对生物学的学习兴趣和独立工作的能力。有些实验,如自酿米酒、制作酸奶等实验,需要持续较长的一段时间;还有一些实验,如馒头的发酵现象,只能在课余、家庭进行,这些都是课外实验很好的题材。在进行课外实验时,教师也应当要求学生写出实验目的、步骤以及实验的结果,以培养学生严谨的科学态度。但是,教师在布置学生进行生物课外实验时,应当注意一些事项:首先要考虑安全问题;其次实验内容要有意义,使学生通过实验可以观察到有关的生物现象或解决有关生物的生活问题;最后,实验方法比较简单,不需要特殊的仪器或者昂贵的材料。
总之,生物实验教学中,要尽量给学生动脑、动手的机会,培养他们独立思考的习惯,发展他们的创造能力,充分发挥生物实验的教育功能,是全面提高学生素质的重要途径。
一、实验目的
1．学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。2．学习掌握细菌简单染色和革兰氏染色方法。
二、显微镜的结构与功能 1．显微镜的结构
显微镜有机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置主要作用是使光学系统，紧固在一个光轴直线上，而且可精确地调节各光学系统部件之间的距离，使显微镜产
生清晰的物象。其组成包括：①镜座和镜臂；②镜筒；③物镜转换器；④载物台；⑤调焦装置（粗调节器和细调节器）。光学系统使显微镜最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。其组成包括：①目镜；②物镜；③集光器；④反光镜；⑤光源（自然光源和电光源）。
光学显微镜基本结构：
1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanical stage and specimenretainer)4.推进器(Mechanicalstage adjustment knob)5.物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Course andfine focus knob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connection to camera, etc.)2．显微镜的成像原理
标本得到足够的照明由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾 斜45 度的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像在经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的实虚像。3．分辨力与数值孔径
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆 盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1． 数值孔径
数值孔径（又称开口率numerical aperture 简写NA）是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2 成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n 值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n 值大于1，NA 值就能大于1。2． 分辨率
显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。其计算公式 是σ = λ/NA 式中σ 为最小分辨距离；λ 为光线的波长；NA 为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA 值与照明光源的波长两个因素决定。NA 值越大，照明光线波长越短，则σ 值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ 值，可采取以下措施
（1）降低波长λ 值，使用短波长光源。（2）增大介质n 值以提高NA 值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔径角u 值以提高NA 值。（4）增加明暗反差。3． 放大率和有效放大率
由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目 镜放大率的乘积。显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。4．镜头的识别
低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低 倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。
三、实验方法
1．用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作简单染色： 涂片→干燥→固定→染色→镜检
（1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸馏水，然后取菌少许，洗入蒸馏水滴中，做成薄薄一层。
（2）干燥：细菌涂片一般应让他自然风干。有时为使它干得快些，可以把涂片小心在酒精灯火焰上微微加热烘干。
（3）固定：细菌涂片常用火焰固定法。即将涂片不快不慢地在火焰上通过2-3 次，菌体受热固着于玻片上。
（4）染色：细菌简单染色常用石炭酸复红或草酸铵结晶紫为染色剂。在已固定的涂片上加一大滴石炭酸复红染色液，使盖住整个涂抹面，静置染色1 分钟。（5）水洗：染色完毕用自来水把玻片上的染色液冲洗干净。
（6）镜检：将染色片晾干，或用吸水纸把多余的水吸去晾干，再用显微镜观察。2．用大肠杆菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcua aureus)作革兰氏染色: 染色方法的要点及原理：先用结晶紫染色，再加碘液固定，酒精处理后用番红复 染。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
染色的具体步骤：涂片→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检（1）取菌按常法涂片、干燥、固定。（2）草酸铵结晶紫染色1 分钟。（3）充分水洗后加碘液处理1 分钟。
（4）水洗后酒精脱色15-20 秒。（用酒精连续滴洗，至不溶出颜色为止）。（5）水洗后加番红染色1 分钟。
（6）充分水洗，吸去余水后晾干，镜检。
四、作业
1．画出你在油镜下观察到的细菌形态并注明放大倍数？ 2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脱色一步为何是关键？ 3．用油镜观察应注意哪些问题？滴加香柏油起什么作用？ 4．油镜使用完后应如何处理？
实验二放线菌与霉菌形态观察
一、实验目的
1．学习掌握插片法和水浸片法观察放线菌和霉菌的方法。2．学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。
二、实验内容
1．用插片法观察绘图放线菌的形态并注意“三丝”分化。将灭菌的盖玻片斜插在涂布放线菌孢子的培养基的平板上，一半露在外面，恒温培养后在培养基表面和盖玻片上部都有放线菌生长，小心取出盖玻片，放在干净的载玻片上，在显微镜下直接观察。
2．用水浸片法观察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形态和分生孢子。根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。梨头霉（Absidia.sp）的接合孢子，木霉（Trichederma.sp）的形态，注意分枝形态。
霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。具体方法：在清洁载玻片中央，加蒸馏水一滴，用解针挑取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注意不要产生气泡，先用低倍镜后用高倍镜观察。
三、作业
1．绘图、记录南昌链霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形态。2．绘图、记录梨头霉的接合孢子形态。3．用水浸片法观察丝状真菌应注意哪些事项？
实验三污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察
一、实验目的
1．学习掌握用悬滴法观察细菌运动性的方法和技术。2．学习掌握用水浸片法观察原生动物和藻类的形态。
二、实验内容
1．用悬滴法观察污水中细菌的运动性，注意运动方向。2．用水浸片法观察原生动物的形态、运动性并注意分类。（1）鞭毛虫类（Flagellata）：绿眼虫、波豆虫（2）肉足虫类（Sarcoclina）：变形虫、太阳虫
（3）纤毛虫（Ciliata）：草虫、肾形虫、钟虫、豆形虫、漫游虫等 3．用水浸片法观察藻类的形态、种类并注意分类。（1）绿藻：空球藻属（Fudoria）珊藻属（Scendesmus）鼓藻属（Cosmarium）小球藻属（Chlorella）盘星藻属（Pediastrum）
（2）裸藻：眼虫藻属（Euglena）（3）硅藻：舟形藻属（Navicula）直链藻属（Melosira）平板藻属（Tabellaria）
三、作业
1．绘图记录细菌的运动方向，悬滴法观察应注意哪些事项？ 2．绘图记录原生动物、藻类的形态、种类和名称。
实验四 微生物的大小测定与数量的测定
一、实验目的
1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。
3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。
二、实验内容
1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。（1）目镜测微尺和镜台测微尺
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在5 毫米内作50 等分刻制的，每一等份为0.1 毫米。另一规格是5 毫米作100 等分，每等分为0.05 毫米。镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在1 毫米内作100 等分刻成的，每等分10 微米。
（2）目镜测微尺校正的方法
将镜台测微尺上面的透镜片取下，把目镜测微尺放在光阑上，刻度朝下。把镜台 测微尺置于载物台上，用低倍物镜检视，使测微尺位于视野中央。注意区分视野内两把尺哪个是目镜测微尺，哪个是镜台测微尺。利用推进器或转动目镜使两尺的第一条线（0 线）互相重合，然后找出另一条重合线。如重合线较多选取距0 线最远的重合线。记下两条重合线之间两尺的刻度，依公式算出目镜测微尺的校正值。目镜测微尺校正值（每刻度微米数）= 两重叠刻度间镜台测微尺格数×10 两重叠刻度间目镜测微尺格数
2．用美兰水浸片法观察酿酒酵母（saccharomyces cerevisiac）的形态，注意出芽繁殖
和死活酵母菌的染色形态，并测量大小。3．用血球板计算黑曲霉孢子的数量。（1）血球计数板
利用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计 数板载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。血球计数板是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方 格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16 个中方格，每中方格又分成25个小方格。另一种是一个大方格分25 个中方格，每个中方格又分成16 个小方格，不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16 或16×25）400 个小方格。因为每个大方格边长为1 毫米，载片与盖片间距离为0.1 毫米，所以每个计数室（1 个大方格）体积为0.1 立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1 毫升菌液内所含的菌数。一个大方格是16 个中方格时，应当数4 角4 个中方格（即100 个小方格）的菌数，一个大方格是25 个中方格时，除取4 角4 个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80 个小方格）的菌数。计算公式如下： 16×25 计数板：
总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数 25×16 计数板：
总菌数/ml= ×400×10000×稀释倍数=每小方格内菌数×4×106×稀释倍数（2）血球计数板计数方法
①视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，以每小格的菌数可数为度。②取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
③将黑曲霉孢子悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
④静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
⑤计数时若计数区是由16 个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4 个大方格（即100 小格）的菌数。如果是25 个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l 个大方格的菌数（即80 个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
⑥测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
三、作业
1．测量酵母菌的大小（高倍镜）： 菌名 宽（目镜格数）长（目镜格数）平均
2．在不改变目镜和目尺，而改变物镜来测定同一酵母菌时，其结果是否相同，为什么？
3．根据你的操作，用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？
实验五 培养基的制备与灭菌
一、实验目的
1．学习掌握培养基的制备原理与方法。2．学习掌握玻璃器皿的包扎与灭菌方法。
3．学习掌握高压蒸汽灭菌，干热灭菌的原理与方法。
二、实验内容 1．玻璃器皿的包扎
（1）每4-5 人为一组包扎：直径9 厘米培养皿3 包，每包6 皿，1ml 吸管2 支，5ml吸管2 支，玻璃刮铲3 支。
（2）每一小组制备18×180mm 试管无菌水5 支，每支4.5ml 自来水，250ml 三角瓶带玻璃珠无菌水1 瓶，装自来水45ml，以上塞好棉塞包扎后待灭菌。2．培养基制备
（1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。（2）制备流程：称量→溶解→蒸煮→调pH→分装→包扎→灭菌（3）高氏一号培养基配方
可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4（4）每小组制备高氏培养基250ml，分装15*150mm 试管8-10 支，余液分装250ml 三角瓶2 瓶，塞棉塞包扎待灭菌。（5）关键步骤及注意事项 ①要严格按配方配制。②调pH 不要过头。
③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC 以下放物、取物。
④高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。3．消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）消毒：用化学或物理的方法杀死微生物的营养体。灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。
（1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160ºC，恒温1 小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。
（2）高压蒸汽灭菌法（一般121ºC，30min，适用培养基）：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘米2 时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121ºC。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15-20 分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。
（3）间歇灭菌法：待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 次，每次煮沸1h，连续3d 重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37ºC 恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。
（4）巴氏灭菌法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62ºC，30 分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。4．棉塞的制作
三、作业
1．高氏一号培养基属于何种性质培养基？有沉淀吗？为什么？
2．高压蒸汽灭菌的过程中，应注意哪些事项，最关键的因素是什么？为什么？
实验六 环境微生物的分离与生理鉴定实验
一、实验目的
1．学习掌握平板稀释法分离环境微生物的技术。2．学习掌握微生物生理生化鉴别的基本方法。3．学习掌握无菌操作技术。
二、实验内容 1．土壤微生物的分离
分离微生物是，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给 它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌 种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离方法用稀释平板分离法，其最终目 的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，同时还可以测定分离的微生物 的数量。
（1）方法：将土样随机称取10g，加入至装有90 ml 无菌水带玻璃珠的三角 瓶中，旋转震荡30min，作逐级分离，逐级稀释见下图，用无菌吸管吸取不同稀 释度菌悬液0.1ml 涂布平板。（2）稀释度选择：
①牛肉膏培养基：10 皿(稀释度10﹣4,10﹣5,10﹣6,三个重复,一个备用)； ②高氏一号培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复，一个备用)； ③真菌培养基：10 皿(稀释度10﹣3,10﹣4,10﹣5,三个重复,一个备用)；
2．用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种糖发酵培养基、石蕊牛乳培养基、蛋白 胨培养基和淀粉培养基作生理鉴别实验。（1）糖发酵试验
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可 以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应 来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反应，存在于大多数细菌中。不同的细菌 在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质(如 乳酸、丙酸、醋酸等)和气体(如二氧化碳、氢、甲烷等)，而有些细菌只产生酸 不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，普通变形杆菌分解 葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基 中加入溴甲酚紫(pH5．2 为黄色，pH6．8 为紫色)，当发酵产酸时，使培养基由 紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出 现来验证。（2）石蕊牛乳试验
牛乳中通常含有蔗糖、乳糖、蛋白质、酪素等成分。微生物对牛乳的利用主 要是指乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作酸碱指示剂和氧化还原指 示剂。微生物对牛乳的利用可分三种情况：①酸凝固作用：微生物发酵乳糖后产 生许多酸，使石蕊变红，同时酸度很高时，可使牛乳凝固。②凝乳酶凝固作用： 某些微生物能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固作用在中性环境中 发生，通常这类微生物还具有水解蛋白质的能力，从而会产生一些碱性物质，是 石蕊变蓝。③胨化作用：酪蛋白被水解变得清亮而透明，胨化作用可以在酸性或 碱性条件下进行，并且一般石蕊色素还原脱色。（3）产氨和产硫化氢试验
某些微生物具有脱氨酶，能使氨基酸在各种作用下脱去氨基而生成氨，氨的 产生可用红色石蕊试纸夹悬于培养试管的棉塞下检验，培养后试纸变蓝，即判为 产氨。
某些微生物能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢。可用醋酸铅试纸，接 种试验菌于培养液中，立即将试纸悬夹于棉塞下，纸条下端与液面接近，但不可 接触。如试纸变黑为正反应即产硫化氢。（4）淀粉水解试验
某些微生物具有淀粉酶，可以使淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖，而另一些微生 物则没有这种特性。将试验菌在淀粉水解培养基的平板上划“+”接种。培养后打开皿盖，滴加碘液于培养基，轻轻旋转培养皿，使碘液铺满整个平板。因培养基内含淀粉，遇碘立即变兰，但如果供试菌能分解淀粉，则菌落周围淀粉已被水解，此时遇碘不变色，因而菌落外围出现无色透明圈。
三、培养基的配制 1．牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g NaCl 0.5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 2．高氏一号培养基 可溶性淀粉 20g K2HPO4 0.5g KNO3 1g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 10mg 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 值 7.2—7.4 使用时加1%重铬酸钾溶液0.5ml/250ml 培养基。3．马丁培养基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH2PO4 1g 琼脂 20g MgSO4.7H2O 0.5g 自然PH 值
蒸馏水 1000ml 煮溶后加1%孟加拉红3.3ml,搅匀。（8 磅即112℃灭 菌30min）4．糖发酵培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 葡萄糖 5 g 水 1000 ml PH 值 7.2-7.4 加溴甲酚紫1.6%的酒精溶液1ml（8 磅即112℃灭菌30min）
溴甲酚紫1.6%酒精溶液的配制：称溴甲酚紫1.6g 溶于50ml 酒精（95%），再加 入蒸馏水50ml，用滤纸过滤后用三角瓶装，放冰箱备用。5．石蕊牛乳培养基
牛奶（1000g）→煮沸→离心（4500 转/分钟，5 分钟）→去脂→调PH 值 7.2→加入石蕊液使牛奶成兰色→分装15×150ml 试管→8 磅灭菌20 分钟。石蕊液配制：称2.5g 石蕊，加50ml 蒸馏水研磨，研磨石蕊时，先加少许蒸馏水 研磨，研磨过程中慢慢滴加蒸馏水，研磨到无颗粒为止，再进行抽滤。6.淀粉水解培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏 5 g 可溶性淀粉 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000 ml PH 值 7.2 7．产硫化氢培养基 蛋白胨 20g NaCl 5g 牛肉膏 2.5 g 柠檬酸铁铵 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g 蒸馏水 1000 ml
三、作业
1．平板稀释分离环境微生物应注意哪些事项？ 2．生理鉴别试验的原理与反应有哪些？
实验七 环境微生物分离与生理鉴定结果检查
一、实验目的
1．学习掌握四大类微生物菌落形态的识别。
2．学习掌握环境微生物生理鉴定结果分析的原理与方法。3．学习掌握微生物纯化培养接种的无菌操作技术。
二、实验内容
1．四大类微生物菌落形态识别
（1）细菌：菌落表面光滑或粗糙，边缘整齐或不规则，奶油状。
（2）放线菌：菌落表面呈绒状，粉状或绒毛状，有些产色素，有同心环，不易 调起。
（3）酵母菌：菌落大而厚，湿润粘稠，易调起，多数呈乳白色，少数红色。（4）霉菌：菌落大而疏松，呈绒毛状、絮状或蜘网状，有色素，比细菌大数倍 到几十倍。
2．土壤中细菌、放线菌、霉菌分离的结果统计 3．生理生化鉴定结果检查 项目 E.coli B.subtilis CK 备注 糖发酵 产酸 产气 产酸 产气 石蕊牛乳 凝固 液化 凝固 液化 蛋白胨 产NH3 产H2S 产NH3 产H2S 产淀粉酶
4．菌落纯培养斜面接种
将分离到的放线菌单菌落，通过无菌操作技术移接到斜面培养基，30℃培养5-7 天。
实验八 水中总大肠菌群的测定－多管发酵法
一、实验目的
结合水净化工程中的细菌检验，掌握水环境监测中和给水水质检验中大肠杆菌群 数的测定方法，同时通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性。
二、原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细 菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三、仪器
高压蒸气灭菌器；恒温培养箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接 种棒；培养皿（直径100mm）；试管（18×180mm）；吸管（1、5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。
四、培养基的制备：
1.乳糖蛋白胨培养液：将10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调节溶液pH 为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸 馏水外，各组分用量增加至三倍。3.品红亚硫酸钠培养基
（1）贮备培养基的制备：于2000mL 烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸 馏水中，加热溶解，然后加入3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH 至7.2—7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g 乳糖，混匀，定量分装于250 或500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培 养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液（1000mL 培养基约加20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比例称取无水亚硫酸钠（1000mL 培养基约加5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再退至淡红色为止（不宜加多）。将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。立即将此培养基适量（约15mL）倾入已灭菌的平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
五、测定水源水总大肠菌群实验步骤
1、初发酵试验
于各装有5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入 10mL 水样；于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL 水样；再于各装有10mL 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中（内有倒管），分别加入1mL1： 10 稀释的水样。共计15 管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。（2）平板分离：上述各发酵管经培养24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于品红亚硫酸钠培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落。
2、平板分离
品红亚硫酸钠培养基上：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金 属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。取有上述特征的群落进行革兰氏染色：
①用已培养18—24h 的培养物涂片，涂层要薄。②将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min 后用水洗去。③滴加助染剂，1min 后用水洗去。④滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20—30s），用水洗去。⑤滴加复染剂，1min 后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。
3、复发酵试验
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接 种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1—3 个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查后附表1“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL 水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L 为报告单位，故MPN 值再乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数。
例如，某水样接种10mL 的5 管均为阳性；接种1mL 的5 管中有2 管为阳性； 接种1：10 的水样1mL 的5 管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5-2-0，得知100mL 水样中的总大肠菌群数为49 个，故1L 水样中的总大肠菌群数为 49×10=490 个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1：
10、1：100、1：1000 或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种的水样量不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水 样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面公式换算成每100mL 的MPN 值。
六、思考题
1、你认为要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作?关键在哪一步?为什么?
2、大肠菌群测定利用了它的哪些生化特性？
表1 最可能数(MPN)表
（接种5 份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，不同阳性及阴 性情况下100mL 水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）
实验九
空气微生物检测（平皿落菌法）
实验目的和原理：用营养琼脂培养基培养细菌；用查氏琼脂培养基培养霉菌；用高氏淀粉琼脂培养基培养放线菌。通过实验了解空气中微生物的分布，学习习近平皿落菌法检测空气微生物。
实验器材：高压蒸汽消毒锅，恒温培养箱，超净工作台，玻璃皿，营养琼脂培养基，查氏琼脂培养基，高氏淀粉琼脂培养基。方法与步骤： 一．培养基制备
1．营养琼脂培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，琼脂10g，加水至500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，调pH7.2~7.4，121℃蒸汽灭菌20分钟。
2．查氏琼脂培养基：NaNO3 1g，KCl 0.25g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂10g，蔗糖15g，加水500ml，加热、搅拌至琼脂溶解，115℃蒸汽灭菌20分钟。
3.高氏淀粉琼脂培养基：可溶性淀粉10g先用少量冷水调成糊状，在火上加热，然后加水及KNO30.5g，K2HPO4 0.25g NaCl 0.25g，MgSO4 0.25g，FeSO4 0.25g，琼脂10g，加热溶化，调pH7.0~ 7.2，补足水至500ml，121℃灭菌20分钟。二.每组15个平皿灭菌将营养琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏淀粉琼脂培养基，三种培养基各倒5个平板，冷凝。
2.在一定面积房间或室外，按4角和中央5点，每种培养基每点放一个平板，打开盖，室内放置10分钟，室外放置3分钟后盖盖，营养琼脂培养基在37℃培养24h，查氏和高氏培养基在28℃培养48h。
3.培养结束，观察各种微生物的菌落形态，将微生物种类、菌落数和计算结果记录于下表：
三．计算：空气微生物数(个/m3)=5个皿平均菌落数×50000÷平皿底面积（cm2）÷暴露时间（min）
四．卫生标准：我国还无统一的空气卫生标准，室内一般以500～1000/m3作为参考指标。
地点
采样时间
细菌菌落
霉菌菌落
放线菌菌落
计算结果（个/m3）
细菌数量
霉菌数量
放线菌数量
实验九 菌种保藏
一、实验目的
1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法
三、试剂与器材
1.材料大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2.试剂液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3.器材无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。
四、实验内容
1.斜面保藏法 2.液体石蜡法 3.穿刺保藏法 4.砂土管保藏法
5.冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。2.熔封安瓶时防止封闭不严。3.液氮冻存操作应防止冻伤。
六、思考题
要培养微生物，首先就需要接种，而接种必须在无菌条件下进行。这就需要建造无菌室或接种箱，为接种创造必要的条件。
无菌室可以建在实验室内，作为实验室的一个小套间。面积为4～5平方米，高2.5米左右。无菌室外应连接一个小缓冲间，面积为2平方米左右。缓冲间和无菌室的门不要建在同一条直线上，以减少空气中杂菌进入无菌室。
无菌室和缓冲间应作到清洁、密闭性好，室内最好有换气设备，以便在工作结束后更换室内空气。两个房间中应各安装l盏30瓦紫外线灯管和照明用的日光灯，无菌室的紫外线灯应悬吊在工作台的正上方，距台面1米，以发挥最大的消毒功能。无菌室内的工作台等用具用品，应经常保持清洁，避免杂菌污染。
如果没有条件建造无菌室，可以用木制的接种箱代替。接种箱结构简单，容易制作，其正面安装玻璃，便于观察。箱前方开两个圆洞各接连1只套袖，操作时将两臂从套袖伸入箱内进行操作。箱内也应悬吊一盏紫外线杀菌灯和一盏日光灯。接种箱的尺寸规格见图9-1。
恒温箱
用于恒温条件下培养微生物。恒温箱的调温范围一般为20～45℃之间。培养酵母菌和霉菌时，一般可调至28℃，培养细菌和放线菌时，可根据菌种的生长温度进行调温，一般为30～37℃。
电烘箱（干燥箱）
用于玻璃器皿等物的烤干和灭菌。电烘箱的调温的范围一般为40～180℃，对玻璃器皿等物进行灭菌时，可将温度调至160℃，灭菌4小时，即可将器皿上的微生物全部杀死。灭菌完毕后，在电烘箱温度还没有降到50～70℃以前，不要打开电烘箱，以免器皿破裂。
冰箱
用于保藏菌种和需要低温保存的药品。
高压蒸汽灭菌锅
是微生物学实验中最重要的灭菌工具，用于一般培养基和玻璃器皿等物的灭菌。在15磅/英寸2压力下（121.6℃），灭菌15～30分钟，可以杀死包括芽孢在内的全部微生物。
离心机
用它使菌体和液体培养基分开。一般多使用普通小型“蘑菇”式离心机，最高转数为4000转/分，用电力启动。如果没有条件置备电动离心机，可用手摇离心器代替。
接种针
用于接种和分离微生物。根据不同用途做成针状、环状、钩状、刀状和铲状等。接种针由针头和针柄两部分组成。针头由白金或铬镍合金（细电炉丝）制成，长约7厘米。针柄可用玻璃棒或铝管制成，长约20厘米。将针头烧结在针柄上即成。
天平
用于称量各种试剂。托盘天平或扭力天平均可，感量应为0.01克。
酒精灯
用于接种时对接种工具进行灭菌。酒精灯火焰上部热度最高，应利用这一最高温度区烧灼接种针或试管口。
显微镜
用于观察微生物的形态结构，显微镜应配备油镜头，以便能看清细菌的形态。
常用玻璃器皿
(1)培养皿（平皿）：用于盛放固体培养基，是培养微生物和观察微生物的主要器皿。一般直径为9厘米。可根据活动规模准备若干个。
(2)试管：用于盛放斜面培养基（固体），是接种微生物的主要器皿。常用的有两种。较大的长220毫米，直径20毫米；较小的长150毫米，直径15毫米。可根据需要选用其中一种，并准备若干个。
(3)锥形瓶：用于盛放液体培养基。是用液体培养基培养微生物的主要器皿。一般容量为50、100、250、300、500、1000毫升。可根据活动需要选择和准备。
(4)量筒、量杯：用于定量量取各种液体。
(5)移液管（吸管）：一般容量为0.5、1、5、10毫升等，可根据需要选择和准备。
病原微生物实验室的检测项目和检测方案根据临床需要综合设计，做到结果稳定可靠、效率高、检测周期短，从而为临床诊断和治疗提供及时和可靠的依据。
血液系统恶性疾病患者常伴免疫功能低下，尤其造血干细胞移植或长期的放化疗后，患者的免疫功能更低，易继发各种病原微生物感染，甚至机会性致病菌爆发感染，部分患者还可因感染继发恶性淋巴细胞增殖性疾病，常常危及生命危险。
目前常用的病原微生物检测方法有：病原微生物培养、免疫血清学检测、抗原检测和基因检测。由于血液系统恶性疾病患者多免疫功能低下，产生抗体困难;病原微生物培养检测周期长，而且受多种因素影响阳性率很低，不能满足临床需要。故检测病原基因或抗原更能反应感染的状态。
病原微生物实验室现已开展了多种血液病患者中常见的致病和机会性致病的病原微生物定量和定性检测项目。主要应用PCR基因扩增检测的方法对病原微生物进分型鉴定，具有检测灵敏度高、分型准确、窗口期短、报告速度快的优势。所配备的仪器主要有AB 3500实时荧光定量PCR仪、AB 9700和AB Verity型普通PCR仪。
本实验室的检测项目和检测方案根据临床需要综合设计，做到结果稳定可靠、效率高、检测周期短，从而为临床诊断和治疗提供及时和可靠的依据。
病原微生物实验室现有人员5人，其中特聘教授1人、硕士学历2人、本科1人，专科1人。
项目介绍：
1。病原微生物PCR定性检测项目：
1)人类疱疹病毒筛查(HHV1-HHV8)
同时筛查8种人类疱疹病毒
2)出血性膀胱炎病毒(BKV、JCV、SV40)
3)人类T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV1-RNA)
4)真菌PCR
2。病原微生物PCR定量检测项目：
人类疱疹病毒
1)单纯疱疹病毒(HSV-
1、HSV-2)
2)水痘-带状疱疹病毒(VZV)
3)EB病毒(EBV)
4)巨细胞病毒(CMV)
5)人类疱疹病毒6型(HHV-6)
6)人类疱疹病毒7型(HHV-7)
7)人类疱疹病毒8型(HHV-8)
呼吸道病毒：
1)呼吸道合胞病毒
2)腺病毒(ADV)
肠道病毒：
1)柯萨奇病毒
2)轮状病毒
其他特殊病原微生物：
1)微小病毒B19
2)结核杆菌 3)卡氏肺囊虫 4)支原体
3。其它病原微生物检测项目： 1)内毒素
1 质量管理与质量控制
质量管理是运用计划、组织、控制、协调、教育以提高管理职能,对质量系统实施以达到预期质量目标的管理过程。质量控制是为达到质量要求所采取的技术和活动,即为提高工作质量,采取有效的措施和方法,控制影响工作质量的各种因素[1]。质量控制过程包括确立控制标准、评定活动成效、纠正错误3个步骤。实验室的质量控制就是对人员、检验方法、仪器设备、实验环境、试剂和标准物质、血清和培养基以及除此之外的其他的一些科学的工作程序等方面进行的有效控制[2]。
疾病预防控制系统实验室首先要按照实验室认可/资质认定之类的科学管理方法建立一个完善的质量管理体系。从组织机构、管理、职责、程序、资源、人员和检测能力等多方面具备相应的自身条件,才能确保质量控制工作有的放矢,落到实处。质量控制是保证质量管理的一系列措施、方法和手段,是实验室质量管理的重要部分,可操作性强,是一个信息反馈系统,通过反馈揭示质量管理活动中存在的问题,促使质量系统及时进行调节、完善,以达到最优状态。
质量控制包括室内质量控制和室间质量控制。室内质量控制旨在确保实验室在自身循环中呈良性上升趋势,避免错误的发生;室间质量控制是各实验室之间进行质量控制的一种手段,为了提高实验室检测能力,通过纵向比较,显现自身优缺点。室间质量控制是建立在室内质量控制基础上的,做好室内质控直接关系到日常工作的质量。实验室质量控制是为了检测和评价整个检测过程的工作质量,随着对质量认识的深入,实验室质量控制已不仅仅限于对实验过程的监测,还包括人员培训、正确地采集和运送样本、正确选择质控物和确定质量控制标准,以及实验质量控制的综合评价和管理等,是考察一个实验室、一名检测者或是一台仪器设备工作质量的主要指标。
2 室内质量控制
2.1 技术人员
从事疾病预防控制系统微生物检验的技术人员须经广泛的基础训练,包括微生物学、基础医学等知识的学习以及专业化的实验技能培训,并经考核合格后持证上岗[3]。另外,还要注重学习新的理论、技术和方法,积极参加各种专业培训和技术交流,以弥补知识和技术的老化。此外,特别需要培养的是检验人员高度的责任心和严谨求实的工作态度。实验室还要对在培人员实施有效监督,对新员工进行检测技能的培训以及对他们的检测技能进行确认合格后上岗。检测人员均应经有关安全和防护、救护知识的培训。对于从事传染病病原检测的人员,基于生物安全考虑,应定期接受健康状况监测,并建立相关记录,包括定期体检记录、职业暴露记录、免疫接种情况等。
2.2 检验方法
实验室应采用国家、行业规定的检验方法,若某些检验项目缺如,应尽可能选择国际或国家标准中已经公布或由权威的技术组织或有关技术文献上公布的方法。新的复杂的检验方法正式使用之前,须核实其正确性和精确性。实验室必须对方法进行一定样本量的预实验,证明实验室能够重复试验中的指标[4]。
2.3 标准操作手册
微生物实验室必须根据本实验室条件编写标准操作手册并定期组织专业技术人员进行修改和补充,用以指导实验室日常工作,使实验室在实验操作中不因人员的变动受到影响。标准操作手册通常应包括以下内容:各级人员的职责和权限、实验室生物安全措施、实验室可开展的检验项目、培养基和试剂的配制方法、菌(毒)种的管理、环境设施监控要求、质量控制方案和废弃物处置等。
2.4 质控物
微生物实验室应建立有效的适合试验范围的培养基和试剂质控程序,对所有的培养基和试剂都需要评估,并采取技术性验收。验收所用标准菌(毒)株必须是认可的菌种或从标本收集途径获得,必须来自权威机构或认可部门[5],使用管理要严格按照认可准则在微生物实验室的应用说明的要求和全国生物安全实验室通用要求和检测技术规范执行。应根据每项试验的性质不同和对标准菌株的生物学性状的要求,选择作为质量控制的标准菌(毒)株,标准菌(毒)株应有专人管理,使非管理者无法随意获得。无论是定性试验还是定量试验,质量控制系统要有足够的灵敏度检测出试验中出现的误差,因此,质量的监测点必须设在一个敏感的位置。定性试验应在较弱阳性的范围内,定量试验则应位于解释试验结果的决定性水平附近。
2.5 质量控制标准
2.5.1 培养基的质量控制标准
微生物实验室目前所用的培养基多为市售合成培养基,在选购时一定要选购经试用性能好的培养基生产厂家的产品,同时索取其相关产品的质控报告。控制标准通常以细菌能否在培养基中生长或能否形成典型菌落来衡量。基础培养基要求细菌能够生长,发育良好并能使细菌充分表现出其典型的特征。选择培养基原则上使用预期最难生长的细菌菌种,并且应少量接种,要求被抑制的菌种不生长或生长较弱,被选择生长的菌种生长良好。生化培养基,用作质量控制的菌种应包括该生化反应为阳性反应和阴性反应的细菌。
2.5.2 试剂和染色液的质量控制标准
试剂和染色液必须注明配制或购入的日期,按试剂要求的贮存条件贮存并在有效期内使用;对稳定性较差的试剂,必须在试验的同时进行阳性和阴性对照试验。
2.5.3 抗血清的质量控制标准
抗血清的来源必须可靠,并按制造商的使用说明使用与保存。如为冻干制品,则应注明配成水溶液的日期。未使用过的抗血清应澄清,在每次使用前应观察是否澄清透明,任何混浊与颜色改变,应视为杂菌污染不应使用。
2.6 仪器设备
微生物实验室最常用的仪器设备是温箱、二氧化碳培养箱、冰箱、低温冰柜、压力蒸汽灭菌器和生物安全柜等。所有仪器性能均应达到检测标准的要求,均要建立仪器档案。仪器设备一定要按规定的检定周期进行检定。贵重的仪器、刚维修的仪器、移动位置的仪器、有数据导出的且对检测结果有重要影响的仪器,检定期间内还要进行期间核查[6]。
对于连续工作的仪器(冰箱、培养箱、水浴箱等),在每日工作开始和结束时记录温度,如不符合要求,应进行调整;隔水式培养箱、水浴箱需要定期加水,冰箱需定期除霜。二氧化碳培养箱须每天检查箱内的CO2含量及温度。高压灭菌器除对其压力表定期进行检定之外,其使用寿命要严格限制在说明书要求以内,操作人员须经专门培训后上岗。高压灭菌器和干热灭菌器必须每月进行一次灭菌性能检测,大容量灭菌器还应在不同部位放置灭菌指示物以全面评价灭菌性能。灭菌效果监控分别使用生物指示剂嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC 7953和枯草杆菌黑色变种芽孢菌片ATCC 9372[7]。生物安全柜若需更换滤网,须由专门技术人员进行,对紫外线必须每3个月检查1次消毒性能,紫外线强度应≥70 μW/cm2。
2.7 实验室检测环境
实验室的环境应满足检测要求,不能影响检测结果的可靠性、有效性和准确性,除此之外还应有利于工作人员的自身安全和仪器的维护。对检测结果产成重大影响的环境必须对其环境条件实施监控并记录加以控制[6]。
微生物实验室主要分为无菌实验室、净化实验室、生物安全实验室等。对有不同要求的区域加以明确的标识并能有效的控制,防止病原体的扩散,涉及生物安全的检测区域按照相关规范或要求配置相关的生物安全设施,如生物安全柜、室内用无排放高压灭菌器等,要有妥善处理废弃样品和有害废弃物的设施和制度。无菌实验室应配备紫外线消毒装置,定期进行紫外线消毒及空气质量监测;净化实验室在使用之前先送风再进行紫外线消毒,工作结束后再进行消毒。另外,工作人员在进入净化实验室之前要更换隔离服;生物安全实验室除按有关规范要求进行管理和使用之外,尤其要注重防止检测人员的职业暴露。
2.8 检测过程的质量控制
影响过程输出(检测报告)的因素很多,不但包括人员、设备和环境条件,检测方法(分析中质量控制)等,还包括样品的采集和管理(分析前质量控制)、原始记录以及报告的管理(分析后质量控制)等。
2.8.1 样品的采集和管理
高质量的样品是保证检验质量的重要前提,应选择最佳采样时间,根据检测实际情况采集有代表性的样品,要使用消毒设备以保证无菌取样,采样同时记录并监控采样地点的环境状况如空气污染度和温度等。实验室应对拟检验样品实行唯一标识,样品的储存及处置都要根据需要做出明确规定以满足复检需要及避免样品变质。
2.8.2 原始记录及报告的管理
原始的检验记录要包含充足的信息,以便再现整个检测过程,在更改原始记录时采用杠改法,由更改人在更改处签字并注明更改日期,同时注意不能隐去被更改的内容以保持记录的原始性。检验报告在发出前要经过复核,然后由技术负责人签发。报告存根与原始记录存档保管。
2.9 常用方法
室内质量控制是产生精确和可靠结果的基础和核心[8],是保证实验室检验工作质量的重要手段。可根据人员、仪器、试剂材料、方法、环境等关键控制点采用空白试验、平行双样、人员比对、样品复测、目击试验和盲样考核等多种方式,灵活多样、因地制宜的开展室内质量控制活动。考核范围要覆盖所有检验业务人员,针对发现问题提出纠正和预防措施。
3 室间质量控制
是由实验室以外的组织或机构对其已达到的质量水准进行的评价,旨在了解某地实验室的检验技术整体水平,使实验室从质控过程中发现问题,制定相应的措施,不断改进检验技术水平。如果只有室内质控,实验室可以了解试验的重复性好坏,但无法知道试验的准确性如何。室间质量控制评价是考察结果的准确性,是检查不同实验室操作的差异,可对实验室技术水平进行综合评价,可作为实验室质量保证的外部监督工具,有利于实验室技术水平的提高。
参考文献
[1]国家认证认可监督管理委员会.实验室资质认定评审准则宣贯教材[M].2版.北京:中国计量出版社,2007:1.
[2]胡伦智.浅谈质量控制在卫生防疫目标管理中的应用[J].中国公共卫生管理,2000,16(5):1921.
[3]卫生部办公厅.全国疾病预防控制机构工作规范[S].2001.
[4]Elder BL.Verification and validation of procedures in the Clinicalmi-cro-biology[J].Clinmicrobiol Newsl,1997,19:153-156.
[5]CNAL/AC05:2003.实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说明[S].
[6]CNAS-CLol:2006检测和校准实验室能力认可准则ISO/IEC 17025-2005[S].
[7]史玲.细菌学检验的室内质量控制[J].中国卫生检验杂志,2007,17(4):722.
近两年，笔者对河南省几所开设微生物课程的中职学校进行了调研，调研的内容主要是微生物实验课程的开设现状（授课时间、内容、学时、使用教材、授课形式）及教学效果（学生对实验课程认知程度）。根据调查情况，笔者对医药类中职学校微生物实验教学有了一些认识，现总结如下。
一、微生物实验课教学现状
1.开课率虽高，但与药学专业脱节，学生对课程的重要性认识不够
调查显示，对于微生物实验课程的开课时间，高职在第一学期，中职在第三学期，均以专业基础课形式出现，理论讲授与实验同时进行。实验内容大多集中在观察性实验，如对细菌、真菌、放线菌的观察，动手操作较少。一些能够动手操作的试验，也会因为各种客观原因，并不是每个学生都有机会动手操作。此外，该课程的授课内容很少与药学专业背景直接联系，学生对微生物学在药学领域的应用情况了解甚少，实验时很少去思考每个实验的目的，存在盲目性。
2.实验多以教师为主体，实验课学时差异大，学校重视程度参差不齐
调查结果显示，各学校的实验课多采用以教师讲授为主的教学方式。教师的讲解用去了实验课的大部分时间，留给学生动手的时间很少，更谈不上让学生自行设计实验了。此外，实验课学时差异较大。有的学校定为几个学时，有的则有几十个学时，缺乏统一标准。通过这些现象我们可以看出，各学校对微生物实验课程的重视程度参差不齐，对学时的安排和实验内容的选择随意性较大，没有从专业特色出发，在学生专业素养和技能培养方面下的功夫还不够。
3.教学体系陈旧，形式单一，忽视对学生创新能力的培养
调查显示，中职学校的微生物教学在内容的安排和教材的编写上更新速度缓慢，实验课程体系陈旧，满足不了当下经济社会发展对技术技能型人才的需求。大部分学校的实验课程还停留在教师演示、学生模仿的阶段，学生只是了解一下实验结果和教师讲的是否一致，很少去分析原因、解释现象。这种单一的教学模式，使得对学生创新能力的培养无从谈起。
二、微生物实验教学的改革方向
1.上好实验课，向课堂要效率
根据微生物实验课的特点，可将每一次实验分为以下三个过程：课前学生预习、课中教师指导和课后学生小结。每次上实验课之前，我们把学生分成小组，把相关知识点提前告知学生，要求学生认真查阅相关资料，并写出预习报告。教师需对预习报告逐个批阅，从而掌握学生的预习情况。在课堂上，教师可采用个别提问、分组讨论、让学生操作演示等方式检查学生的预习效果。在实验过程中，教师要注意观察学生的操作情况，随时解答学生提出的问题，及时纠正学生在实验过程中出现的错误。实验结束后，教师要先检查学生的实验操作记录、原始数据记录、仪器使用情况等，然后才能让学生离开实验室。课后，教师要求学生及时写出完整的实验报告，同时做好课后思考题。教师在批阅学生的实验报告时，应对照其原始数据，重新核算实验结果。在下次实验时，教师应对实验过程中和实验报告中存在的问题进行总结。这样不仅有利于培养学生严谨求实的科学态度，也会对学生的专业素质和思想品德教育起到良好作用。
2.采用项目教学，开展自主实验
在传统实验教学中，传授知识和技能是以教师为主体，学生只是被动地接受。实验的所有准备工作，如实验内容的选择、步骤的制订、试剂的配制和仪器设备的准备等都是由教师完成的。学生的任务只是按规定的步骤进行操作。这种教学模式严重束缚了学生的主动性和创造性。所以我们现在就采用项目教学法，充分发挥学生的主观能动性，让学生自己动手完成整个实验，通过实验理解掌握理论知识，还能得到一定实际应用能力的训练。
3.增加技能训练学时，加大技能考核力度
为了让学生掌握扎实的实验技能，我们根据学校的情况，适当增加了微生物实验的学时数，制订了操作技能考核办法，加大了考核力度。在实验考试前给学生布置考试内容，给学生一定的时间查阅相关资料、自己做好实验准备，要求其在规定的时间内完成实验内容。考核的实验内容包括两个部分：一是进行实验基本技术的专项考核，如显微镜使用技术，培养基配制技术，消毒灭菌技术等。二是利用设计性实验对学生进行考核，如水中大肠埃希菌检查，口服制剂中微生物总数检查等。实验考核内容由学生自己抽取，考核的成绩计入总评。操作考核评分细则要结合职业技能鉴定考核要求制订，对学生的实训能力进行综合考核。
4.加强校企合作，创新实践教学
传统的教学模式往往会导致学生与社会脱轨，很多学生直到毕业也没有到企业参观和实践过。这样学生就无法真正了解企业在用人方面有什么要求，其实际操作能力也比较弱。通过校企合作，学生可以在企业的实践中学到许多书本上、课堂上学不到的知识，完善知识结构，积累实践经验，有效提高学生的职业能力。同时，校企合作能够帮助学生及时掌握就业信息，实现学生就业和企业用工的顺利对接。
【微生物实验】推荐阅读：
食品微生物实验报告12-28
微生物实验室制度09-22
微生物实验复习资料09-30
微生物实验室设计规划06-18
微生物无菌实验室要求07-01
微生物实验室安全培训07-24
微生物实验室应急预案12-27
食品微生物实验室操作手册12-05
食品卫生微生物检验实验室操作要求06-22
微生物检验总结07-01
