浅析Ran基因功能及研究

浅析Ran基因功能及研究（共5篇）

浅析Ran基因功能及研究 篇1

结构基因组学阶段主要研究基因组遗传排列方式,将生物全部的遗传信息以遗传标记、DNA片段或核酸序列的形式展现出来。这些成果为科学家进一步了解基因的功能奠定了基础。

功能基因组学研究的基本策略是将基因和蛋白质的研究从单个的研究扩展到以系统的方式对生物体内所有基因和蛋白质进行研究,利用结构基因组学所积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述DNA序列的功能。所以本文主要从基因功能的基本知识,功能基因组学的研究方法及应用前景三个方面进行论述。

1 基因功能的基本知识

基因的功能主要包括:生物化学功能、细胞学功能、发育的功能。当然,对于一段DNA序列的功能分析我们可以简单地利用软件(如BLASTNn和BLASTx)与GenBank中公布的基因序列进行同源性比较。

2 功能基因组学的研究方法

基因的时空差异表达是有机体发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在不同组织、不同器官以及不同环境条件下的差异表达特征为基因的功能提供了重要的信息。所以基因差异表达的分析有着重要的意义,其研究方法也相当重要。下面就简单介绍几种功能基因组学的研究方法。

2.1 差异显示反转录PCR技术

差异显示反转录PCR (DDRT-PCR)技术是由Liang和Pardee发明的,它是以分子生物学上最广泛应用的两种技术PCR和聚丙烯酰胺凝胶泳为基础。其基本原理是:以一对细胞(或组织)的总RNA反转录而成的cDNA为模板,利用PCR的高效扩增,通过5'端与3'端引物的合理设计和组合,将细胞(或组织)中表达的约15000种基因片段直接显示在DNA测序胶上,从而找出一对细胞(或组织)中表达有差异的cDNA片段。

2.2 基因表达系列分析

基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)是由Velculescu及其同事于1995年建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。利用SAGE可以在短期内得到丰富的表达信息,与直接测定cDNA克隆序列方法相比,减少了大量的重复测序,从而大大节省了研究时间和费用。这种方法对正常、癌基因旁、癌组织中基因的差异表达研究方面还有独到的优点,有助于发现肿瘤特异基因。

2.3 微阵列分析

微阵列(Microarray)包括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片(DNA chips),该技术是近年来发展来的又一新的分子生物学研究工具。其基本原理是:将成千上万条DNA片段[1q'cDNA、表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)或特异性的寡核甘酸片段]按横行纵列有序地点样在固相支持物上,固相支持物为硝酸纤维膜或尼龙膜时,称为微阵列。

2.4反义RNA

反义RNA是能与靶RNA互补配对的小分子RNA,用来定点分析某一段DNA片断(基因)的功能。先分离该片断的mRNA,合成其mRNA的互补RNA即反RNA,再加上启动子等表达必需元件,插入T-DNA,转化到植株中,合成的“基因”就会在植株中表达,表现出“性状”。反义RNA通过与靶RNA碱基配对的结合方式可在DNA复制水平、转录水平和翻译水平上参与基因表达调控。

3 功能基因组学的发展前景

就目前功能基因组学的发展形势来看,无论是应用于大量基因功能信息的获得还是针对特定基因的研究方面综上所述的各项技术都取得了突破性的进展。但随着研究的深入,对其精确性和准确性的要求越来越高,各项技术也都存在一些尚待解决的问题。因而我们可将各种方法扬长避短,综合应用到功能基因组学的研究中来获取突破。与此同时,也必须不断完善现有技术以及探索发展新的技术使我们全面客观地了解基因功能,进而更好地改造生物性状服务于人类社会。

摘要：随着基因组学的发展,基因组学的研究已经由全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究,功能基因组学时代对于基于功能的研究也由单一基因转向大规模、批量分析。本文主要从基因功能的基本知识,功能基因组学研究方法及应用前景三个方面进行论述。

浅析Ran基因功能及研究 篇2

关键词：XET/XTH基因家族；功能；表达模式

中图分类号：S792.11 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-03-0065-3

木葡聚糖转葡糖苷酶XET，是糖苷水解酶GH16家族的亚族[1-3]。糖苷水解酶GH16家族具有未在高等植物中发现的硫酸角质素β-1,4糖苷键内切酶、葡聚糖1,3-β-d 糖苷键内切酶和琼胶酶等酶活性。XET/XTH中一系列内葡聚糖和吡喃半乳糖XET/XTH的酶活性具体表现为：①木葡聚糖转移酶的活性。②木葡聚糖β-1,4糖苷键内切酶活性[4]。XET/XTH家族在植物中进化，意味着XET/XTH基因家族在植物细胞壁形成以及植物生长、发育过程中具有特殊的意义[5]。

1 XET/XTH简介

1.1 XET/XTH结构简介

XET/XTH具有催化酶触反应的特征结构域DEIDFEFLG，并且在XET催化中心附近丝氨酸或苏氨酸具有典型的N糖基化修饰[6, 7]，将拟南芥AtXTH22的N糖基化修饰基团除去，酶活性降低98%，表明DEIDFEFLG中第一个谷氨酸残基在酶触反应中必不可少，同时证明DEIDFEFLG结构域是酶活性的关键[8]。此外，XET还具有分泌到质体外的信号肽。

1.2 XET/XTH在细胞壁扩张过程中的作用

植物细胞的伸长和扩张是一个高度协调的复杂过程。在细胞伸长过程中，细胞形态受由纤维素结晶、半纤维素和纤维素微纤丝等多聚物组成的细胞壁控制。细胞壁生化特性改变使膨压驱动细胞扩张。XET/XTH活性需要以基本的葡聚糖结构为前提如β-1,4糖苷键。一般认为在细胞壁的扩张过程中木葡聚糖的断裂和再生发挥着重要作用，木葡聚糖是基本多聚物的重要组成部分[9]，如木葡聚糖与纤维素微纤丝表面结合，介导形成纤维素微纤丝-木葡聚糖交联网络系统。长久以来XET/XTH被认为是参与细胞壁松弛过程的一种重要的酶[10]。XET/XTH在细胞壁伸长和细胞体积膨大等过程中发挥的重要作用，体现在XET/XTH催化的两个过程：①内切木葡聚糖分子②将新产生的木葡聚糖分子交联到另一木葡聚糖分子的非还原端。有报道表明XET/XTH表达的空间分布与细胞伸长、非伸长区和细胞壁的二次生成有关，而且XET/XTH能调节插入细胞壁中的木葡聚糖长度，从而调节细胞的延展性[9]。

图1 细胞分化过程中细胞壁结构改变的四种方式，引自Kazuhiko Nishitani et.al.[11]

在细胞生长分化过程中，XET参与了细胞壁结构改变的四种方式[11]（图1）。XG 代表木葡聚糖分子，CM代表纤维素微纤丝分子。A和B过程显示细胞壁扩张：A过程单纯由水解酶水解承重木葡聚糖交联，B过程由转移酶介导细胞壁结构间交联。C和D过程显示细胞壁沉积：C过程由转移酶催化但未引起细胞壁扩张，木葡聚糖分子在已有的和新合成的细胞壁结构间交联导致细胞壁结构物质的增加，D过程由转移酶催化并引起细胞壁扩张，新合成细胞壁物质与原有胞壁成分交联导致细胞壁扩张。

2 拟南芥XET/XTH基因家族表达模式

XET/XTH由一个很大的基因家族编码。拟南芥XTH基因家族由33个成员组成[12]。编码序列分析和酶学分析表明不同的XTH成员结构相似但具不同属性[12-14]。不同成员组成的XTH基因家族，可能参与组织器官发育，具有器官、组织和细胞表达特异性或受环境等刺激的調控。故单一XTH基因家族成员或成员间的组合表达，具有时空特异性。有报道表明单一XTH成员突变能导致明显的发育改变[15]。在细胞壁构建过程中特定成员在特定部位发挥重要作用[16, 17]。利用RT-PCR和基因芯片数据库对XTH基因家族成员进行分析可以清晰得到XTH基因家族各成员在生长发育不同时期在不同的组织器官的表达情况[17-21]。

利用Genevestigator分析拟南芥XTH基因家族各成员在植株发育不同时期的表达情况[22]（图2）。整个生长发育过程中，在细胞分裂旺盛的阶段0、阶段1、阶段1b和阶段1c，XTH表达相应活跃，这与XTH功能相符。具体到各个成员，XTH4、XTH9、XTH22、XTH24和XTH27几乎在各个阶段都有较高的表达量，XTH2、XTH21在生长发育的各个阶段表达丰度均比较低。具体到各个阶段：在阶段0，XTH10表达丰度最低，XTH25表达丰度最高；阶段1，XTH2 表达丰度最低，XTH4表达丰度最高；阶段1b，XTH2表达丰度低，XTH24 表达丰度最高；阶段1c，XTH2表达丰度最低，XTH4 表达丰度最高；阶段1d，XTH21表达丰度最低，XTH9 表达丰度最高；阶段5，XTH21表达丰度最低，XTH24表达丰度最高；阶段6，XTH2表达丰度最低，XTH4表达丰度最高；阶段6b，XTH26表达丰度最低，XTH24表达丰度最高；阶段8，XTH21表达丰最度低，XTH25表达丰度最高。

利用Genevestigator分析拟南芥XTH基因家族各主要成员在植物各个组织器官中的分布情况[22]（图3）。XTH广泛分布在拟南芥各个组织器官中，大部分成员在根、侧根和根系伸长区均具有较高的表达量。具体到各个成员：XTH2仅在花粉中具有较高的表达丰度，在其他组织器官中表达丰度均低，推测XTH2可能具有花粉特性启动子。XTH29在雄蕊、花粉表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低，结合图2的结果推测XTH29可能具有花粉、雄蕊特性启动子，且在雄蕊、花粉形成过程中挥着重要的作用。XTH30在子房、茎尖表达丰度略低，在花粉、雄蕊花瓣中表达丰度高。XTH3在花序、花、雄蕊、茎表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低，结合图2结果推测XTH3可能具有花特异性启动子。XTH11在茎叶中表达丰度低，在种子、角果、花序等器官中表达丰度高，结合图2结果推测XTH11可能具有种子特异性启动子。XTH25在花柄中表达丰度低，在种子中表达丰度高，据图2结果推测XTH25可能具有种子特异性启动子。XTH5在种子、胚根、幼苗、根等部位表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH20在胚根、幼苗、根等部位表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低。XTH15在胚轴、胚根、幼苗、花序、花、心皮、种子、茎、茎节、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度相似。XTH14在根系、种子、幼苗、胚根中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低，结合图2推测XTH14可能在幼苗根系生长过程中具有重要作用。XTH26在根系、幼苗中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度低，XTH26与XTH14相似但表达高峰时间段更短。XTH17在幼苗、胚根、叶柄、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度低表达情况与XTH14相似。XTH21在胚根、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均低，结合图2结果推测XTH21具有根特异性启动子。XTH31胚轴、侧根、伸长区表达丰度较高，种子、莲座、幼叶、成叶、叶柄表达丰度较高，其他组织器官表达丰度相差不大。XTH33在柱头、侧根、伸长区表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH23在愈伤组织、悬浮细胞、幼苗、子叶、胚轴、胚根、莲座、幼叶、成叶、根系表达丰度较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH22 在子房、柱头、花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH1 在雄蕊、花粉、角果、侧根、伸长区表达丰度相对较高，其他组织器官表达丰度较低。XTH16在柱头、花粉、茎叶、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH9仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH28在花粉中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH32在愈伤组织、柱头、花瓣、萼片、雄蕊、花粉、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH4在柱头、老叶中表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH7在愈伤组织、柱头、花柄、老叶、伸长区表达丰度较低，其他组织器官表达丰度较高。XTH8在柱头、老叶表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH27 仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH24仅在花粉中表达丰度低，其他组织器官表达丰度均较高。XTH10 在萼片、老叶中表达丰度较高，其他组织器官表达丰度均较低。XTH6在愈伤组织、胚根、花粉、种子、老叶、侧根、伸长区表达丰度低，其他组织器官表达丰度较高。

自上世紀70年代以来，对XET/XTH基因家族的研究有了长足的发展，研究物种涵盖拟南芥、水稻、苹果、奇异果、杨树、苔藓等诸多物种，且从单个或几个基因的分析到整个基因家族、蛋白质家族的分析[23-26]。如火如荼的研究预示着XET/XTH具有广阔的研究前景和广泛的应用范围，如何利用XET调控细胞增值、分裂、体积扩张，基因家族间各个成员的互做，以及调控基因表达的激素信号、信号转导等，成为更具挑战性的研究课题。

参考文献

[1] Henrissat B,Bairoch A.New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities[J].Biochem J.1993,293 (Pt 3):781-788.

[2] Henrissat B.A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.[J].Biochemical Journal.1991,280(Pt 2):309.

[3] Henrissat B,Bairoch A.Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.[J].Biochemical Journal.1996,316(Pt 2):695.

[4] Rose J K C,Braam J,Fry S C,et al.The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis:current perspectives and a new unifying nomenclature[J].Plant and Cell Physiology.2002,43(12):1421.

[5] Yokoyama R,Nishitani K. Endoxyloglucan transferase is localized both in the cell plate and in the secretory pathway destined for the apoplast in tobacco cells[J].Plant and Cell Physiology.2001,42(3):292.

[6] Nishitani K.Endo-xyloglucan transferase,a new class of transferase involved in cell wall construction[J].Journal of Plant Research.1995,108(1):137-148.

[7] Nishitani K.The role of endoxyloglucan transferase in the organization of plant cell walls[J].International Review of Cytology.1997,173:157-206.

[8] Campbell P,Braam J.In vitro activities of four xyloglucan endotransglycosylases from Arabidopsis[J].The Plant Journal.1999,18(4):371-382.

[9] Nishitani K,Vissenberg K.Roles of the XTH protein family in the expanding cell[J].The Expanding Cell.2007:89-116.

[10] Miedes E,Zarra I,Hoson T,et al.Xyloglucan endotransglucosylase and cell wall extensibility[J].Journal of Plant Physiology.2010.

[11] Nishitani K,Tominaga R.Endo-xyloglucan transferase,a novel class of glycosyltransferase that catalyzes transfer of a segment of xyloglucan molecule to another xyloglucan molecule.[J]. Journal of Biological Chemistry.1992,267(29):21058.

[12] Yokoyama R,Nishitani K.A comprehensive expression analysis of all members of a gene family encoding cell-wall enzymes allowed us to predict cis-regulatory regions involved in cell-wall construction in specific organs of Arabidopsis[J].Plant and Cell Physiology.2001,42(10): 1025.

[13] Campbell P,Braam J.In vitro activities of four xyloglucan endotransglycosylases from Arabidopsis[J].The Plant Journal.1999,18(4):371-382.

[14] Yokoyama R,Rose J K C,Nishitani K.A surprising diversity and abundance of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases in rice.Classification and expression analysis[J].Plant Physiology.2004,134(3):1088.

[15] Matsui A,Yokoyama R,Seki M,et al.AtXTH27 plays an essential role in cell wall modification during the development of tracheary elements[J].The Plant Journal.2005,42(4):525-534.

[16] Vissenberg K, Oyama M,Osato Y,et al.Differential expression of AtXTH17,AtXTH18,AtXTH19 and AtXTH20 genes in Arabidopsis roots.Physiological roles in specification in cell wall construction[J].Plant and Cell Physiology.2005,46(1):192.

[17] Lee D, Polisensky D H,Braam J.Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes:a focus on calmodulin-like and XTH genes[J].New Phytologist.2005,165(2): 429-444.

[18] Ma L,Sun N,Liu X,et al.Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development[J].Plant physiology.2005,138(1):80.

[19] Fry S C.Primary cell wall metabolism:tracking the careers of wall polymers in living plant cells[J].New Phytologist.2004,161(3):641-675.

[20] Zimmermann P,Hirsch-Hoffmann M,Hennig L,et al.GENEVESTIGATOR.Arabidopsis microarray database and analysis toolbox[J].Plant physiology.2004,136(1):2621.

[21] Zimmermann P,Hennig L,Gruissem W.Gene-expression analysis and network discovery using Genevestigator[J].Trends in plant science.2005,10(9):407-409.

[22] Becnel J,Natarajan M,Kipp A,et al.Developmental expression patterns of Arabidopsis XTH genes reported by transgenes and Genevestigator[J].Plant molecular biology.2006,61(3): 451-467.

[23] Yokoyama R,Uwagaki Y,Sasaki H,et al.Biological implications of the occurrence of 32 members of XTH (xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase) family of proteins in the bryophyte Physcomitrella patens[J].The Plant Journal.

[24] Atkinson R G,Johnston S L,Yauk Y K,et al.Analysis of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) gene families in kiwifruit and apple[J].Postharvest Biology and Technology.2009,51(2):149-157.

[25] Yokoyama R,Nishitani K.Genomic basis for cell-wall diversity in plants.A comparative approach to gene families in rice and Arabidopsis[J].Plant and Cell Physiology.2004,45(9): 1111.

[26] Geisler-Lee J,Geisler M,Coutinho P M,et al.Poplar carbohydrate-active enzymes.Gene identification and expression analyses[J].Plant Physiology.2006,140(3):946.

猪脂肪性状相关功能基因的研究 篇3

1瘦素(Leptin)基因

Leptin由肥胖基因编码,是一种主要由白色脂肪细胞分泌的反馈性抑制脂肪的激素,由167个氨基酸组成,相对分子质量16 ku[6]。Leptin具有广泛的生物学效应,可调节摄食、能量利用、生长、繁殖和免疫等生物学过程[7],其中最突出的功能是作用于下丘脑的体重调节中枢,引起食欲降低、能量消耗增加,从而降低脂肪沉积、抑制体增重[8,9,10]。

Leptin作为一种脂肪细胞分泌的激素主要在调节机体能量平衡及脂肪沉积方面发挥重要作用[11]。 在人类和鼠上发现,血清Leptin水平及脂肪组织中Leptin的m RNA量与肥胖程度呈正相关,肥胖者表现出Leptin抵抗[12,13,14]。在猪的研究上得出相似结论,肥胖型猪的血清Leptin水平和脂肪组织中Leptin m RNA的表达量均高于瘦肉型猪或较瘦的杂交猪[15], 而且血清Leptin水平与胴体背膘厚度呈高度正相关,与胴体瘦肉率或眼肌面积呈强负相关,而与主观大理石评分相关性较弱[16,17]。脂肪组织中Leptin m RNA的表达量 与背膘厚 度呈正相 关[18]。 血清Leptin水平与脂肪组织Leptin m RNA的表达量也呈正相关[19]。另有研究结果发现,随着猪前体脂肪细胞的增殖和脂肪细胞的肥大,脂肪细胞中Leptin m RNA的表达量也随之升高,说明Leptin可能作为一种脂肪生成反馈剂去除多余脂肪[20,21]。猪的脂肪沉积能力愈强,脂肪组织分泌和表达的Leptin就愈多,而且Leptin的分泌量和表达量与猪胴体品质具有紧密相关关系[22]。

2解偶联蛋白3(Uncouplingprotein3,UCP3)基因

猪解偶联蛋白3基因属于UCP基因家族,位于9号染色体上,其开放阅读框长度为936 bp,编码331个氨基酸的蛋白质。猪UCP3具有6个跨膜功能域和一个嘌呤核苷酸结合区[23,24]。UCP3是分布于线粒体内膜的质子转运载体,介导内膜外侧的质子内流形成质子漏,降低内膜两侧H+电化学梯度,造成氧化过程与ADP磷酸化过程解偶联,质子所带有的能量以热的形式释放,是机体耗能产热的重要方式[25]。在骨骼肌和脂肪组织中表达的UCP3具有显著影响肌肉和脂肪能量转换的基因效应,可能是肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因。

对猪UCP3基因的部分编码区进行了测序,在395 bp处发现了1个c SNP位点[26],该c SNP位点发生G-A突变,并导致相应编码氨基酸由Gly-Arg的改变。该位点可以被限制性内切酶SmaⅠ识别。利用PCR-RFLP方法,发现AA、AB和BB 3种基因型,其中A等位基因频率0.56,B等位基因频率0.44。UCP3 SmaⅠ位点主要表现为加性效应,基因型AA降低膘厚,提高系水力和降低失水率,但同时也降低肌内脂肪含量。猪UCP3基因5'调控区序列的AvaⅠ酶切位点与肌肉和脂肪的能量转化显著相关[27]。在基因调控区序列发现一个AvaⅠ酶切位点,该酶切位点与猪的不同能量代谢类型极显著相关[28]。通过PCR-SSCP方法,证实基因与胸腰椎间膘厚、系水力和失水率呈显著相关[29]。因此,UCP3基因的遗传变异,有可能导致机体能量消耗程度的差异,从而可能导致个体间的体脂代谢、体脂含量乃至脂肪沉积性状的改变。寻找UCP3基因的多态性,研究其对脂肪沉积和肉质性状的遗传效应,有可能为今后猪的遗传品质改良提供一定的遗传学依据。

3叉头转录因子O亚家族1(ForkheadtranscriptionfactorgroupO1,FoxO1)基因

叉头(forkhead box, Fox)转录因子是对异常头果蝇突变体的研究中发现的,在众多的家族成员中,研究最深入的是叉头转录因子O亚家族(forkhead transcription factor group O, Fox O)[30]。 Fox O在哺乳动 物中的成 员包括Fox Ol、 Fox O2、 Fox O3和Fox O4,主要参与细胞周期调控、DNA修复等。利用RT-PCR方法,以提取猪脂肪组织总RNA为模板,在成功扩增得到长度为414 bp的猪Fox Ol基因c DNA部分序列的基础上,运用RACE技术成功得到了猪Fox Ol基因c DNA全长[31]。

利用RT-PCR法检测6月龄八眉、长白和长×八杂交猪后腿部比目鱼肌、腓肠肌和趾长伸肌中Fox Ol基因的表达量[32],结果发现,Fox Ol基因在八眉猪和杂交组合猪骨骼肌中的表达量均显著高于长白猪, 表明Fox O1很可能对猪骨骼肌的含量进行负调控, 此基因很可能是导致不同经济类型猪肌肉发育过程产生差异的主要基因之一[33],同时还发现在以IIb型纤维为主的趾长伸肌中表达丰度远远高于以I型纤维为主的比目鱼肌,表明Fox Ol基因的表达与I型肌纤维的含量成反比,Fox Ol基因调控不同经济类型猪品种骨骼肌的发育。同年,又研究发现Fox Ol和成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen, Myo D)基因m RNA的表达在不同经济类型猪肌肉发育中存在负相关,相关系数为0.728[34]。利用RT-PCR、Western blotting等检测在猪成肌细胞分化过程中Fox O1早期和晚期Myo D及肌细胞生成素 (myogenin, Myo G)的表达变化,结果发现,尽管Fox O1 m RNA表达量显著增加,但总蛋白量变化不显著,显著上调了其磷酸化水平[35];同时,高表达Fox O1的猪成肌细胞中,Myo D蛋白变化不显著, Myo G水平却明显降低,表明猪成肌细胞的分化时间推迟及被抑制分化很可能是因为Fox O1作用的结果。Fox O1在180日龄大白猪比目鱼肌、趾长伸肌、 腓肠肌和背最长肌中的表达差异均不显著,其蛋白表达与My HC各亚型呈显著相关,用青霉素(wortmannin)处理原代培养的猪骨骼肌成肌细胞的第3和5天时,Fox O1蛋白与My HC I、My HC IIa和肌细胞增强因子2c(MEF2c)表达均呈显著负相关[36],表明Fox O1很可能是通过抑制My HC I的表达来调控肌纤维类型。Fox O1很可能是通过抑制神经钙蛋白(calicineurinm, Ca N)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NEAT)信号通路或Ca N/ MEF2信号通路对I型肌纤维的表达进行负调控[37]; 2、5月龄民猪和长白猪的肾周脂肪中Fox Ol基因表达量极显著高于1、6、8月龄,并发现Fox O1可能通过抑制PPARγ、 CCAAT区/增强子结 合蛋白 α (CCAAT/ enhancer binding protein α, C/EBPα) 基因的表达来减少脂肪沉积[38]。

4钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因

钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因是一种特定的、内源性的、需钙激活的蛋白酶抑制剂,被定位于猪的2号染色体上[39]。CAST基因与肌肉嫩度存在极其紧密的联系,其产物对于肌肉生长过程中蛋白质的更新具有重要作用。在细胞内普遍存在着需钙蛋白酶(calpain)的蛋白水解系统,大量参与到生长和代谢过程。钙蛋白酶系统主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白。钙蛋白酶根据其表现半最高活性所需的Ca2 +浓度分为2类,钙蛋白酶1 (u-calpain)和钙蛋白酶2(m-calpain)。活体屠宰后较低浓度的Ca2+就可以激活u-calpain,使其表现出蛋白水解酶活性。如果附近有CAST,就可迅速与u-calpain结合,抑制蛋白酶的活性,从而抑制肌肉内蛋白质的降解,促进蛋白质的合成,提高肌细胞生长速度[40]。猪肉的嫩度与CAST/u-calpain的活性比值有密切的联系,活性比值越大,CAST的量相对越大,钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶的抑制作用越强,肉的嫩度越好[41]。对125头杂交猪进行多态位点研究并分析其对猪的肉质和背膘的影响时发现, 其中A、B 2个位点均对肌内脂肪含量有显著影响, B、C、D 3个位点均对背膘厚有显著影响[42]。对3个猪品种钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性进行了研究,结果发现钙蛋白酶抑制蛋白基因的一定基因型与猪肉的嫩度存在相关性。由此看来,钙蛋白酶抑制蛋白主要通过影响猪肉的嫩度来改变猪肉的肉质性状[43]。

5促黑激素皮质素4受体(Melanocortin-4receptor,MC4R)基因

促黑激素皮质素4受体(melanocortin- 4 receptor, MC4R),由332个氨基酸残基组成,是跨膜G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCRs)超家族的成员之一[44]。MC4R能够通过中枢神经系统调节体重,主要表现为抑制摄食,导致血糖、胰岛素和瘦素水平降低,从而减少体脂、降低体重,在动物的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重 要作用[45]。 猪MC4R基因位于1号染色体q22-27处,与猪1号染色体上的数个标记明显连锁,用两点连锁分析得到的两个离MC4R基因最近的连锁标 记是SO3113(0, 17.76)和S0082(0.05, 14.74)[46]。

MC4R基因型与背膘厚和生长率以及采食量呈强相关,AA基因型背膘比BB基因型薄9%,BB基因型比AA基因型日增重高37 g/d,且差异显著[47]。不同的MC4R基因型间肉质指数、最后肋骨处背膘厚、腰部背膘厚、平均背膘厚、平均日增重、肌肉中乳酸的集中差异显著[48]。猪MC4R基因第7跨膜结构功能区域的一个高度保守区存在G-A错义突变,产生Taq I酶切位点的改变,这一突变使MC4R蛋白第298位氨基酸天冬氨酸被天冬酰胺代替[49]。对不同品系猪该位点的多态与生产性能关系的研究,证实了MC4R基因型与背膘厚、生长率和采食量呈强相关[50]。猪MC4R基因存在一个氨基酸编码的错义突变,可导致猪胴体重和采食量显著变化[51]。

综上所述,Leptin、UCP3、Fox O1、CAST、MC4R基因对猪的脂肪沉积与代谢均起重要作用。尽管对这些基因的结构和表达调控规律有了一些认识,但具体调控机理和分子机制还有待于从细胞水平和分子水平上作进一步研究[52]。另外,希望在不久的将来能利用这些猪肉质性状主要功能基因进行肉质改良等育种工作,为优质肉质性状的猪品种的育种实践提供依据,从而获得更高品质的猪肉来满足人们的需求[53]。

摘要：猪肉品质性状改良是当今遗传育种界的研究热点之一,脂肪性状是肉质的一项重要指标。本文综述了影响猪脂肪性状的几个功能基因,即瘦素(Leptin)基因、解偶联蛋白3(UCP3)基因、叉头转录因子O亚家族1(Fox O1)基因、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、促黑激素皮质素4受体(MC4R)基因的研究进展,以期为改善猪脂肪性状提供参考。

浅析Ran基因功能及研究 篇4

养猪业是我国畜牧业的支柱产业, 培育高产、优质、抗病的优良种猪是实现我国养猪业可持续发展的根本保障。近年来, 我国在猪生长、肉质和抗病性状的功能基因组研究领域取得了一批具有国际影响力的成果, 但在猪重要经济性状的功能基因分离与鉴定、基因网络调控、功能基因组学平台构建等方面还较欠缺, 不能满足我国猪品种改良及猪分子设计育种的需求。2013年, 863计划现代农业技术领域启动了“猪重要经济性状的功能基因组学研究”课题。2015年7月17日, 科技部组织有关专家对该课题进行了中期检查。

“猪重要经济性状的功能基因组学研究”课题启动以来, 课题组针对我国养猪业的可持续发展对功能基因组学新成果、新技术的战略性需求, 以生长、肉质、抗病等性状进行功能基因组学解析、猪大规模突变品系的创建等为重点研究内容, 完成了超过2000头猪不同性状测定数据的收集, 并完成了荣昌猪、藏猪等20多个中国地方猪种的基因组 (重) 测序工作。通过数据分析, 课题组鉴定出了在不同猪种中受选择的区域或基因, 基于藏猪的基因组测序分析揭示出藏猪特殊环境适应性进化的组学机制, 相关研究成果在国际知名期刊Nature Genetics的发表。同时, 课题组选用piggy Bac转座子载体p ZG, 将p ZG质粒和p CAG-4PB-ineo质粒共同电转并进行流式分选GFP阳性细胞作为供体, 获得了p ZG阳性猪和健康的p CAG-4PB-ineo转基因猪, 创建了piggy Bac转基因突变猪新材料。该方法被证明是实现高效、简便、低成本的猪规模化基因突变的有效途径, 将极大的促进家畜育种及医学新药的发展。

中期检查专家组认为, 经过两年多的研究, “猪重要经济性状的功能基因组学研究”课题组在猪功能基因组学研究工具与平台完善、猪基因组结构解析及生长、肉质等经济性状组学解析方面取得了较大进展, 对实现我国动物育种重大理论和关键技术突破, 提高我国猪功能基因组研究水平和自主创新能力具有重要的现实意义。

浅析Ran基因功能及研究 篇5

1 材料与方法

1.1 菌种、质粒和试验动物

马链球菌兽疫亚种C55138株,购自中国兽医药品监察所;大肠杆菌基因工程菌株DH5α、基因缺失突变菌株Δhas B构建用载体p G+host5,由广东省高校重点实验室保存;小鼠,购自广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂

细菌RNA抽提用TRIzol试剂,购自Invitrogen公司;DNAseⅠ,购自Promega公司;Taq酶、限制性内切酶Bam HⅠ和SalⅠ、T4连接酶、DNA Marker、反转录试剂盒及荧光定量PCR相关试剂,购自宝生物工程(大连)有限公司;UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 SYBR GreenⅠ实时定量PCR

使用TRIzol试剂提取接种小鼠12,24,36 h的细菌和体外培养细菌的RNA,以DNAseⅠ去除DNA,反转录试剂盒进行反转录。以回收的has B和16S rRNA扩增产物作为标准品,测定其浓度,换算浓度(ng/μL)为拷贝数/μL。对标准品做10倍梯度稀释,稀释的浓度分别为1×107,1×106,1×105,1×104,1×103,1×102,1×101拷贝数/μL,以其作为模板绘制标准曲线。PCR反应体系(总体积为25μL):上、下游引物各0.5μL,10×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5μL,双蒸水11μL,c DNA样品0.5μL。每个样品做3个重复。PCR扩增条件:95℃30 s;95℃5 s,55℃30 s,共40个循环。整个反应过程中荧光信号的变化由Light Cycler 480(Roche)实时荧光定量PCR仪检测[5,6]。

1.4 基因缺失突变菌株Δhas B的构建

以CTAB法提取的SEZ基因组作为PCR模板,引物has BL1 5'-ATTTCTGTCGACGGCTCAGGATA-3'和has BL2 5'-AATGGATCCTGACGCATTTAGGT-3'扩增has B基因上游400 bp序列,引物has BR1 5'-AACCATTACAATAACGGATCCTTTG-3'和has BR25'-ACAACCCTGTAGCGAATTCCCTC-3'扩增has B基因下游400 bp序列,作为同源重组双交换的同源臂。将PCR扩增的has B上游序列、has B下游序列通过合适的酶切位点依次构建入温敏型载体p G+host5,从而获得同源重组质粒p GΔhas B。以质粒电转化SEZ,通过同源重组双交换使SEZ基因组中的has B基因缺失,构建has B基因缺失突变菌株Δhas B。

1.5 SEZ基因缺失菌株的筛选

将单个菌落接种于TSB培养基中,于37℃摇床培养8 h;稀释菌液,均匀涂布于含红霉素的TSA平板上,于37℃培养,只有发生单交换的菌株才能在含红霉素的TSA平板上生长。将单个菌落接种于TSB培养基中,连续传代,挑取单个菌落同时画线接种于含红霉素的TSA平板及不含红霉素的TSA平板上。发生双交换的基因缺失菌株及再次在上游或下游发生单交换而恢复为野生型的菌株均只能在不含红霉素的TSA平板上生长。筛选不能在含红霉素的TSA平板上生长,只能在不含红霉素的TSA平板上生长的菌株。

1.6 小鼠致病力试验

对SEZ亲本株WT、has B基因缺失突变菌株Δhas B计数后,用PBS清洗1遍,并调整浓度到4×105cfu/m L,将20只小鼠随机分成2组,分别腹腔接种WT和Δhas B菌株100μL,观察临床表现,比较WT和Δhas B菌株对小鼠致病力的差异。

1.7 调理吞噬试验

按照参考文献[7,8]中描述的方法进行调理吞噬试验。对6周龄健康Balb/c小鼠采血,分离血清作为调理吞噬试验的补体。用HBSS缓冲液重悬对数生长期的SEZ,与20%正常小鼠血清(NMS)或20%灭活小鼠血清(HIMS)在室温条件下孵育30 min。加入小鼠巨噬细胞(ATCC TIB-71),控制感染复数(MOI)为1∶100,37℃孵育45 min后进行细菌计数。

2 结果与分析

2.1 Has B基因的体内表达

为了探讨has B基因在宿主体内的表达特性,对体内感染细菌的RNA和体外培养细菌的RNA进行抽提,比较感染动物后has B的RNA含量是否发生显著变化,本试验应用Real-time PCR技术研究了其体内表达的特性。荧光定量PCR分析结果见图1,相对于体外培养的细菌,SEZ感染小鼠脾脏分离细菌的mRNA表达水平均显著下调。has B基因是SEZ透明质酸荚膜合成过程中所必需的酶,下调表达可能与宿主抵御SEZ的机制相关。

2.2 突变菌株的构建与鉴定

以SEZ基因作为模板,用引物has BL1和has BL2扩增has B基因上游400 bp序列,用引物has BR1和has BR2扩增has B基因下游400 bp序列,作为同源重组双交换的同源臂。将PCR扩增的has B上游序列、has B下游序列通过合适的酶切位点依次构建入温敏型载体p G+host5,从而获得同源重组质粒p GΔhas B。为了证实外源基因被成功插入到载体,进行了双酶切鉴定,结果重组质粒酶切产物电泳后均得到2条条带,包括载体带和1 000 bp左右条带,说明载体构建正确,载体p GΔhas B的双酶切鉴定结果见图2。

通过同源重组构建has B基因缺失的突变菌株,探讨has B在SEZ致病过程中的作用。使用引物Δhas B1和Δhas B2进行RT-PCR扩增,以野生菌株作为模板时,可以扩增出has B基因的条带;而以Δhas B作为模板时,不能扩增出目的条带,见图3。

2.3 SEZ基因缺失菌株的筛选

将突变菌株置TSB培养基中连续传代,连续传代25代的突变菌株使用引物Δhas B1和Δhas B2进行RT-PCR均不能扩增出目的条带,说明突变菌株能稳定传代。比较突变菌株与亲本菌株的生长曲线,见图4。结果发现,两种菌株的生长状况基本一致,突变菌株仅在对数生长后期(7~10 h)生长速度略慢于亲本菌株,说明has B基因缺失不影响细菌的生长。

M.DL-2 000 Marker;1.重组质粒的双酶切结果。

M.DL-2 000 Marker;1.阴性对照;2.野生菌株;3.突变菌。

2.4 小鼠致病性试验

腹腔接种WT和Δhas B两种菌株,并比较两者对小鼠致病力的差异。小鼠感染WT后表现典型的临床症状,如被毛凌乱、精神萎靡等。感染后的死亡率达75%,见图5,且能在感染小鼠的血液中分离到SEZ。而Δhas B感染的小鼠不出现精神不振等临床表现,且仅在感染1 d内从小鼠血液中分离到细菌。

2.5 调理吞噬试验

为了探讨SEZ荚膜的致病机制,对WT和Δhas B两种菌株进行调理吞噬作用分析,结果见图6。

由图6可知,在HBSS缓冲液、灭活血清(HIMS)和正常血清(NMS)中,Δhas B均较容易被巨噬细胞杀死,且在正常血清处理时的差异最为显著,揭示血清中的补体成分可能在吞噬过程中产生重要作用。

3 讨论

病原菌感染宿主时,常常会上调或下调表达某些毒力基因[9]。为了初步探讨has B基因在体内环境的表达情况,试验采用Real-time PCR技术比较了has B感染动物后其RNA含量是否改变。以10倍稀释的标准品作为模板,绘制Ct-拷贝数的线性图(图1A),has B与16S rRNA的引物扩增效率一致,说明本试验的Real-time PCR技术能准确反应转录水平。脾脏富集细菌的相对表达量见图1B,SEZ感染小鼠脾脏分离细菌的mRNA表达水平均显著下调。has B基因是SEZ透明质酸荚膜合成过程中所必需的酶,下调表达可能与宿主抵御SEZ的机制相关。

C.Hyams等[10]研究表明,肺炎链球菌荚膜对细菌毒力具有重要影响。本研究构建了has B基因的缺失突变菌株,并对其致病性进行比较分析。通过比较WT与Δhas B感染后的临床症状、病理变化、发病率、致死率,结果发现,has B基因的缺失显著影响了细菌对小鼠的致病力,说明has B是SEZ重要的新毒力相关因子。

细菌基因缺失后致病力降低是由多种原因引起的,本研究发现has B基因缺失可导致SEZ致病力显著降低,进一步研究可知,has B基因缺失后容易被巨噬细胞杀死,且血清中的补体成分可能在吞噬过程中产生重要作用,说明SEZ荚膜影响补体和巨噬细胞介导的免疫反应,从而影响调理吞噬作用。基因缺失突变菌株抵抗宿主巨噬细胞的吞噬能力显著降低,导致不能有效抵抗宿主免疫系统,从而容易被免疫系统

参考文献

[1]GRUSZYNSKI K,YOUNG A,LEVINE S J,et al.Streptococcus equi subsp.zooepidemicus infections associated with guinea pigs[J].Emerg Infect Dis,2015,21(1):156-158.

[2]GAEDE W,RECKLING K F,SCHLIEPHAKE A,et al.Detection of Chlamydophila caviae and Streptococcus equi subsp.zooepidemicus in horses with signs of rhinitis and conjunctivitis[J].Vet Microbiol,2010,142(3/4):440-444.

[3]PRIESTNALL S,ERLES K.Streptococcus zooepidemicus:an emerging canine pathogen[J].Vet J,2011,188(2):142-148.

[4]WEI Z,FU Q,LIU X,et al.Identification of Streptococcus equi ssp.zooepidemicus surface associated proteins by enzymatic shaving[J].Vet Microbiol,2012,159(3/4):519-525.

[5]FU Q,WEI Z,CHEN Y,et al.Identification of a surface protective antigen,CSP of Streptococcus equi ssp.zooepidemicus[J].Vaccine,2013,31(10):1400-1405.

[6]LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[7]THURLOW L R,THOMAS V C,HANCOCK L E.Capsular polysaccharide production in Enterococcus faecalis and contribution of Cps F to capsule serospecificity[J].J Bacteriol,2009,191(20):6203-6210.

[8]THURLOW L R,THOMAS V C,FLEMING S D,et al.Enterococcus faecalis capsular polysaccharide serotypes C and D and their contributions to host innate immune evasion[J].Infect Immun,2009,77(12):5551-5557.

[9]OGUNNIYI A D,GIAMMARINARO P,PATON J C.The genes encoding virulence-associated proteins and the capsule of Streptococcus pneumoniae are upregulated and differentially expressed in vivo[J].Microbiology,2002,148(Pt7):2045-2053.