PCR实验室工作制度（精选9篇）
1.实验室内必须保持安静、整洁，不得大声喧哗，不得在室内从事与实验无关的事宜。2.禁止与实验无关人员出入，实验室主要通道入口及功能区域应有特殊的标志。3.实验室各区域有各自专用的实验设备和器材，包括工作服、拖鞋、洁净鞋，一次性消耗品、办公用品等，各有明显的标志，绝对不能混用。4.严格遵守人员及物品按单向流动，不得交叉混流。
5.严格按照基因检测操作规程进行实验和使用仪器设备，定期检测、校准并做好记录工作。6.每次基因检测中应设立阴阳对照。
7.实验室工作人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，实验开始前必须做好室内及工作台的清洁消毒，离心管、吸头等一次性用品需高压灭菌处理。
8.工作结束后必须立即应用10％次氯酸钠溶液消毒实验室台面，并用紫外灯照射实验室。试验中使用过的吸头，离心管等应送到指定的地点进行处理。
9.每日工作开始前需开启风机及空调系统，在运行30分钟后，记录各压差表数，如压差低于设定值的20％需及时清洗过滤系统，并填写相关记录表。如风机系统出现故障时，该实验室应停止使用。
关键词：荧光定量PCR技术,原理,主要类型,定量方法,优化
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。
1 荧光定量PCR技术的原理
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。
2 荧光定量PCR技术的主要类型
荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括Taq Man、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。
2.1 SYBR GreenⅠ
SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。
2.2 Taq Man探针
Taq Man探针技术是有美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。Taq Man探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。
2.3 分子信标
分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。
3 荧光定量PCR技术的定量方法
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。
3.1 标准曲线法的绝对定量法
用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行PCR反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的Ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒ds DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ss DNA、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量转换成其拷贝数来确定。
3.2 双标准曲线法的相对定量法
在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得Ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和r RNA。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。
3.3 比较Ct法的相对定量法
如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因Ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较Ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:
目的基因的量=2-ΔΔCt
在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。因此,2-ΔΔC t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线[11]。
4 荧光定量PCR技术实验条件的优化
定量PCR技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制PCR反应体系。
4.1 引物及探针
一是设计要求。引物设计是实时定量PCR中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:SYBR green I技术要求扩增片段不大于500 bp,Taq Man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度Tm值在55~65℃,GC含量在40%~60%,上、下游引物之间的Tm值相差不要超过4℃。在Taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,Tm值在68~70℃,探针的5’端不能为G和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6μmo L/L,探针的浓度在0.05~0.30μmo L/L,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术公司定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用TE溶液溶解,使其最终浓度为100μmo L/L,-20℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2μmo L/L(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的Tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70℃。
4.2 模板质量与浓度
模板的质量会影响PCR扩增的效率。模板应在-20℃保存,避免反复冻融。用TE溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据Ct值选择,使Ct值位于15~30个循环比较合适,若Ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。
4.3 镁离子浓度
Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素。Mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;Mg2+的浓度过低影响Taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以DNA或c DNA为模板的PCR反应,应选择2~5 mmo L/L浓度的Mg2+。
4.4 循环数
一般的实时定量PCR反应只需25~30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。
4.5 重复实验和阴性、阳性对照
定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加PCR扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板DNA,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、PCR试剂、SYBR GreenⅠ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。
5 结语
通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量PCR检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量PCR技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。
参考文献
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临床基因扩增实验室近年来在我国发展很快，基因诊断技术在疾病的预防、诊断、治疗方面起到了积极的作用。由于、基因扩增检测技术的应用对、实验室的环境条件、仪器设备、试剂耗材、人员技术能力和质量控制等方面要求严格，而一些实验人员对此不甚了解，加之利益的驱使，曾经在20世纪80年代，某些沿海省份的实验室未按要求规范设置，出现气溶胶污染，导致大规模假阳性结果报出，为临床诊断造成了极大的困难。临床基因扩增实验室为了规范实验室，保证基因扩增技术有效应用，防止假阴性、假阳性结果的报出，为临床出具合格而可靠的报告，申请临床基因扩增实验室的验收是必然而且也是必要的。
二、开展临床基因扩增实验的必备条件
根据卫生部2002年1月14日发布了卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（以下简称《办法》）及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，及同年2月20日卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》，明确规定临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必需具备的条件：
（1）二级以上医院实验室，经卫生部临床检验中心验收合格；（2）从事基因扩增实验操作的人员必须经过培训并取得上岗证；
（3）使用经国家药品监督管理局批准的允许进入市场销售的商品试剂盒；
（4）开展卫生部允许开展的项目。具备了以上几条后，我们从事临床基因检测任务才是符合要求和规定并对临床出具的报告有保障的。
三、临床基因扩增实验室验收准备工作 1.硬件准备
（1）实验室整体布局：
根据《办法》要求，临床基因扩增检验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增产物分析区。由于我实验室使用的是罗氏公司的Lightcycler实时荧光定量扩增仪，扩赠后产物不需开盖处理直接检测，所以扩增区和扩增产物分析区合为一室，此区为负压。实验室设计时按照《办法》规定，三个区域相互独立，并有各自的缓冲区域（见图1）（2）各工作区域仪器设备
各工作区域的仪器设备及物品，包括椅子、办公用品、清洁用品等均不能拿出本区域，所有可移动物品均应有本区域的标示。
各区域应具备的设备配置为：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服、废液缸、扫帚、拖把、废纸褛篓、微量加样器（覆盖1-1000μl），经高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）、笔、纸等。各工作区域的特殊配置包括：
（1）试剂贮存和准备区：2～8oC冰箱、漩涡震荡器、超净工作台。
（2）标本制备：2～8oC冰箱、-20oC冰箱、高速台式冷冻离心机、漩涡震荡器、金属加热模块、超净工作台。
（3）扩增及产物分析区：罗氏Lightcycler荧光定量核酸扩增仪、电脑、打印机。
同时：进入各工作区域必须严格按照单一流向，并用明显的箭头表示，个区域用不同的颜色以示区别。即试剂贮存和设备区（蓝色）→标本制备区（白色）→扩增及产物分析区（粉色）。2.软件准备：
（1）临床基因扩增实验室文件编写： 本实验诊断中心正在进行ISO15189实验室的认可工作，故质量手册同中心统一，其它文件包括：程序文件、标准操作程序（SOP）、相关图表等由本实验自己制定。制定的原则根据卫生部下发的两个文件，并结合本实际情况编写适合本实验实际情况编写适合本实验室的切实可行的文件，做到“写你所做的，做你所写的，记录你已做的”。具体编写内容如下：
①程序性文件：PCR实验室管理制度，PCR实验室人员管理制度，仪器设备的管理程序，PCR实验室仪器设备操作程序，PCR实验室仪器设备校准程序，PCR检验实验操作程序，实验室消耗品购买、验收及储存程序，PCR试剂购买、验收及储存程序，PCR检测标本的管理程序，PCR实验室记录控制程序，PCR检验结果报告的控制程序，PCR实验室室内质量控制程序，抱怨处理程序，实验室生物防护错施，实验室的清洁程序，实验室废弃物处理程序等。
②标准操作程序（SOP）：试剂准备区工作制度，样本准备区工作制度，PCR扩增区工作制度，半自动型蒸汽压力灭菌器标准操作程序，高速离心机的标准操作程序，恒温金属浴使用规程，漩涡震荡器标准操作程序，洁净工作台的标准操作程序，可调式加样器标准操作程序，恒温金属浴的校准程序，标本采集、运送、接收、保存的标准操作程序试剂准备的标准操作程序，核酸提取的标准操作程序，Lightcycler使用的标准操作程序，统计学者质量控制的标准操作程序，消耗品验收质检的标准操作程序。试剂质检的标准操作程序等。
③相关图表：PCR实验室工作人员一览表，实验室主要负责人简历表，PCR实验室工作人员档案，PCR实验室人员培训计划，仪器设备一览表，仪器设备损坏、故障、修理记录，仪器设备的报表申请表，仪器维护保养记录，Lightcycler荧光定量扩增仪维护保养记录，恒温金属校准记录，采购申请单，试剂领取验收记录，试剂质检记录，消耗品质检记录，消耗性材料领取验收记录，标本接收等记表，不合格标本记录，报告单发放接收登记表，特殊报告要求登记表，抱怨情况登记表，抱怨处理登记表，PCR实验室日常工作核查表，Lightcycler仪器使用记录，试剂使用记录，PCR实验室室内质量控制失控原因及纠正错施记录，样本处理记录，冰箱温度记录-试剂准备区，冰箱温度记录-样本准备区，环境温度记录-试剂准备区，环境温湿度记录-样本准备区，环境温度记录-PCR扩增区，PCR实验室日常工作核查表，紫外灯使用登记表，温度计校准记录，PCR实验室平面图等。（2）人员管理：
文件要在临床基因扩增实验室工作的实验人员必须经过培训并取得上岗证，所以在申请实验室验收前，要至少一名人员参加卫生部检验中心举办的临床基因扩赠实验室上岗培训班并取得上岗证。同时实验室还应该制定自己的培训计划，保证实验室人员能不断得到培训。（3）实验方面：
使用经国家药品监督管理批准的允许开展的项目。
四、临床基因扩增实验室验收申请
如果以上方面准备就绪后，就可以进行临床基因扩增实验室验收申请了，但以本人的经验，建议在实验室设计好后，先请验收专家进入实地看一下，并提出他们的宝贵意见，以免在验收时因离要求有差距而成耽误了验收，同时编写好的程序性文件和SOP文件也应请才、专家过目，得到认可后再提交申请，内容包括： 1.基因扩增检验实验室基本情况：
（1）实验室所属法人单位名称、地址、电话、联系人等。（2）实验室人呀情况和职称比例。2.应提供的资料
（1）《医疗机构职业许可证》复印件；
（2）拟设置基因扩增检验实验室医院的医疗卫生资源状况，对临床基因扩增检验的需求情况以及实验室运行的预测分析；
（3）拟设基因扩增检验实验室的设置平面图；（4）实验室主要负责人简历表；（5）实验室工作人员一览表；（6）主要仪器设备表；
（7）拟开展的临床基因诊断项目；
（8）实验室相关程序文件和标准操作程序（SOP）；（9）检验报告样单； 3.希望验收时间 4.声明
本实验室自愿申请卫生部临床检验中心组织的技术验收，并愿意承担下列义务：遵守《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因诊断实验室工作规范》及与关规定；不论能否获得通过验收，预付验收阶段的全部费用。
五、现场技术验收
当提交临床基因扩增检验实验室技术验收申请表后，大约两周时间内（视具体情况而定）卫生部临床检验中心会将临床基因扩增检验实验室收通知传真或邮寄至你处，告知验收工作的具体时间、专家组成员、验收程序及验收费用等。
在验收当天，专家组成员将对实验室布局、实验室设置及仪器设备配备情况、实验室表示、程序文件标准操作文件的编写、试验记录等情况进行验收，同时还会现场让实验室技术人员进行临床标本的操作，实验结果的正确与否也是实验室验收合格的依据之一。现场提问时专家会对你所编写的文件进行提问，主要涉及实验室污染、是内质控、标本的收集及保存等。验收结束后，专家会填写临床基因扩增检验实验室技术验收报告，对验收结果进行总结，提出整改要求和意见。
六、临床基因扩增检验实验室收体会 1.认真学习和领会卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》，及卫生部临床检验中心发布《临床基因扩增实验室工作规范》的内容，并将以上两个文件的内容落室到自己所编写的程序文件和标准操作程序中。
2.实验室布局设计好后一定要请专家实地进行一下检查，如果条件不具备，也可以将实验室设计平面图寄给专家，因为每个实验室都有自己的具体情况，如果是新建的实验室可以按照卫生部临检中心提供的标准实验设计图来设计，如果是在老的实验室基础上改造，就应该多听一些专家的意见，以免在验收的时候因实验室设计不合理而耽误验收以至延误临床工作的开展。
3.程序性文件和标准操作程序编写时，最主要的是可操作性要强，尤其是SOP文件，使用频率很高，与实验室的日常工作密切相关，写的要具体一些，格式并不是很重要，主要是让第依次接触该SOP的人也能够按其完成相关操作。同时还要集注，该文件不是用来验收的。而是给自己实验室人员用的，要认识到文件对保证检验质量的重要性，这样在编写时就能更细化，更具体，更实用。文件的编写是整个实验室验收工作任务重要的一个环节，也是验收工作时检查的重点，所以在编写文件时要让每一个实验室的人员都参与进来，对所写的内容、程序和要求都要知道，并能遵守执行。在验收的时候，专家会对你所写的文件内容进行提问，如果一个实验室操作人员对其应该遵循的管理制度和SOP一无所知之甚少，这样对日常检验的质量控制也是没有好出的。文件编写好后，建议也请专家过目，得到首背后再提交认可申请。
4.文件编写好后，应该按其执行，做到“记录你所做的”简单的说就是将常规工作中所做的记录下来，一般说，需要记录的有临床标本接收中的饿患者个人资料、标本接收日期、标本状态、唯一编号等；检测前实验室的清洁；检测中实验记录，试剂厂家、批号、检测日期、检测结果、质控记录及分析、检测人（签字）、仪器运转情况等；检测后实验台面、仪器设备等的消毒和清洁、紫外线照射等。依次两次的记录并不难，难的是持之以恒。所以许多记录我们多记录我们可以把做到成表格的形式，记录时在相应的条款上打“√”就行了。
5.实验过程严把质量关。我们编写的质量手册的木的的是规格实验操作整个过程，做到实验过程有章可循，实验记录有据可查，保证实验结果的可靠性和准则性。由于基因扩增技术特殊性，即使严格按质量手册进行操作，也难免出现错误结果，因此包括试剂空白对照，阴性标本对照、临界值阳性标本对照等，分别监测试剂配制与加样过程中是否存在污染，标本核酸模板提取过程红是否存在污染，标本检测过程中是否在假阴性结果和结果是否准确等。
6.工作量少影响质量保证系实施。严格按临床基因扩增检验实验室技术要求通过验收的实验室，存在一定运行成本，需要有一定临床标本量的支持；如果某一医院医疗资源不足，标本来源不足以支持运行成本时，就会想方设法去减少运行成本（包括试剂成本和劳务成本），导致检验质量难以得到保证。因此建立了临床基因扩增检验实验室后，应根据本医院的情况，制定可行的试验方案（如实验周期、合理接受外来标本等），做到既保证临床标本结果的质量又不浪费成本。以上只是本人对临床基因扩增检验实验室技术验收及日常工作的一点体会，望和大家多多交流。参考文献
一、试剂污染：
1、排除方法
1）重新取用新的试剂盒进行检测，考虑当天用试剂盒污染。2）重新进新批次试剂盒进行检测，考虑本批次试剂污染。
3）换用其他医院用试剂盒进行检测，考虑本实验室试剂保存不当污染。
2、整改措施
1)若当天使用试剂污染，则查询污染原因，并采取相应措施消除污染影响，并重新取用新的试剂进行检测。
2）若本批次试剂污染，则除查找实验室试剂库房可能导致污染的原因，并与厂家联系，溯源污染原因并及时更换试剂，进行检测。
二、操作污染
1、排除方法
1）调换操作人员进行检测。2）评价操作人操作是否规范化。
3）使用耗材是否无菌，更换手套、枪头是否及时。微量管开盖、闭盖是否规范。4）加样枪操作是否规范到位。
2、整改措施
1）加强操作技能培训。
2）加强学习人员操作技能考核。
三、实验室及耗材污染
1、排除方法
1）更换实验室对同一批标本进行检测。
2）采用反应管，一支开盖放置30-60min，另一只闭盖，然后同时作为反应用管加入反应液进行扩增检测。
3）使用棉签蘸取生理盐水后，擦涂房间内把手、台面、设备表面、加样枪末端等处，作为样本进行检测。
4）检测消毒用酒精、巴士消毒液、次氯酸钠等有效性。5）检测室内或生物安全柜内紫外灯管效能。6）更换规范灭菌后耗材进行检测。
2、整改措施
1）各实验室分区日常清洁工作按照要求进行，各区用品清洁用抹布、拖把不可以混用。
2）及时更换紫外灯管。
3）定时对实验用金属浴或水浴箱进行消毒处理。4）定期浸泡实验用试管架及标本存放盘。5）按照规定进行实验室内消毒工作。
一、近年来，PCR技术在临床医学中得以快速应用，特别是在肝炎、结核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物诊断以及部分遗传性疾病诊断和癌症的辅助诊断等方面的应用。
二、临床定量PCR实验室管理
临床定量PCR实验室由卫生部管理，依据国家卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）《临床基因扩增检验实验室工作规范》、（卫检字[2002]8号）、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》（2002-1-14）、《临床基因扩增实验室申请表》及《临床基因扩增实验室验收表》执行。实验室申办程序包括：
（1）填写调查表，由省临检中心审核；
（2）正式填写申请表，上报卫生部临检中心；
（3）评审由卫生部、省专家参加，并报省卫生厅备案；（4）合格单位名单由卫生行政部门在媒体公示。临床定量PCR实验室应具备以下条件：标准的实验室设计设置、专业的技术人员、标准操作程序（SOP）和质量管理文件等。
1、实验室设置及人员管理在实验室设计上，建立单流向、一体化的临床定量PCR实验室是安全准确进行基因扩增检验和保障生物安全的重要措施。其具有理想的布局结构、标准的风向设置、严谨的防护措施、简明洁净的外观、合适的环境条件与参数等。它具体包括建设好“3个实验区”（试剂准备区、标本制备区和PCR扩增区及其各自缓冲区）和“3个系统”（单向气流控制系统、单向物品传送系统、生物安全控制系统）。对于人员管理，首先应制定一系列规章制度。检验人员要严格遵守操作规程，制定日常工作中的质量控制流程，严格执行查对制度和考核制度，具有实事求是的工作作风。检验人员必须满足以下条件：
（1）经有资质的单位培训，考试合格取得上岗证后持证上岗。（2）专业主管为本科以上学历和中级以上职称3a以上工作经历。（3）工作人员须有专业技术职称。
（4）培训单位须由省卫生厅指定，经卫生部临检中心认可。
2、实验室操作规程的规范化建立符合当今实验室的管理模式，形成管理文件，包括质量手册、质量体系程序文件和标准操作程序（SOP）等。质量手册主要包括目录、批准页、前言、质量方针、组织结构、人员管理、实验室设施环境、仪器设备、生物防护措施、标准操作程序、标本管理、记录、报告、应急处理及实验室的工作制度等。SOP文件是最具体、最具可操作性，也是使用频率最高的文件，其精髓就是使所有与实验室检验质量有关的环节都有章可循，要让每一个操作人员都了解并严格遵照执行管理制度和标准操作程序。此外，所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号，质控血清的来源及测定值，并注明是否在控；检验者及审核者应签名。如果实验结果对临床诊断有决定意义，其样本应留存，至少要与病历的保存期一致。规范化的管理和操作保证了实验结果的准确性和可靠性，而且便于各项数据资料的核实。
三、临床定量PCR实验室的质量控制
PCR技术自Mullis创立以来广泛应用于多种疾病检测，但PCR测定不同于一般临床检测，由于其灵敏性很高，即使有极少量DNA污染也会造成假阳性，因此对实验条件要求非常严格。检验者在操作过程中必需牢固树立“无基因观念”，严格操作规程，防止一切可能的污染，包括以前的扩增产物、天然基因组DNA、试剂配置、气溶胶、实验所用的器具等。一旦发生污染，实验即不能进行，而且查找污染源非常困难，因此避免发生污染重在预防，并贯穿于PCR检测的全过程。因此质量控制在PCR检测过程中尤为重要。
室内质量控制室内质量控制是指一个实验室内（荩荩下转第87页荩荩）部对所有影响质量的各个环节进行系统控制。目的是控制本试验室常规工作的精密度，提高常规工作前后的一致性。临床PCR实验室应开展所有检验项目的室内质量控制，并做好记录和分析[5]。PCR检测包括标本采集、核酸提取、基因扩增、产物检测等步骤，每个步骤都应有相应的质控措施。其中最关键的是标本采集和核酸提取，按照卫生部临床检验中心《临床基因扩增实验室工作规范》严格执行。室内质控贵在坚持，重在不断总结提高。3.2室间质量评价室间质量评价是实验室质量控制体系中的重要部分，是保证患者检验结果及其报告的准确性和可靠性，以及各实验室间结果可比性的重要手段。卫生部临床检验中心组织的全国性室间质量评价活动现已扩展到细菌、免疫、血液、体液、治疗药物监测、分子诊断等领域。临床PCR实验室应积极参加省、市及卫生部临床检验中心组织的各项活动，如实验室室间质量评价、质量评价总结会议、研讨会和学习班，各医院间相互学习、沟通和交流，不断改进和完善本实验室的质量管理。实事求是地汇报室间质评结果，认真地研究反馈的评价信息。接受卫生部或省临检中心的现场调查，如果1个质评项目连续2次成绩不合格，整改并停止项目收费3个月。及时发现问题，做好失控分析和记录，找出问题所在，采取相应措施，力求实验室结果准确、可靠、及时、可比，更好地服务于临床。
实验注意事项：
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高温高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
（2）PCR操作应戴手套并勤于更换，必要时应戴好帽子和口罩，就像做手术一样，要有“无菌观念”。
（3）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（4）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（5）最后加模板DNA，马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（6）实验设阳性、阴性对照。
还有诸如：移液枪用完要放到最大计量位置，防止久了弹簧失灵；防止RNA酶污染标本；低温下操作，防降解；试剂有致癌致畸作用，做好个人防护；头脑中各操作步骤要清楚，不要加错试剂。
问题及解决方案汇总：
一、假阴性，扩增无条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR来减轻或消除。
三、出现非特异扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用两步法。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
五、出现大量引物二聚体
1.从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2.可能模板有问题；
3.模板浓度过小，适当加大模板量；
4.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出置于冰上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6.所配Mix中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
7.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加Taq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。
8.增加循环数；
9.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mM没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。11.以上次的PCR产物作模板二次PCR，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；
六、高GC与复杂结构的模板处理
将模板置于95℃水浴锅中处理10分钟以上，然后置于冰上瞬时冷却，可大大降低二级结构对PCR的影响。
七、长片段与短片段拼接失败（定点突变）
在做定点突变时，倘若突变位点距离基因的某一侧较近（短片段<200bp）时，通常拼接困难或者难以通过电泳结果直观判断是否拼接成功。此时，可在短片段的上方（突变近5’端）或下方（突变近3’端）选取一条载体通用引物与基因另一条引物PCR（控制产物大小>300bp），然后再做基因拼接。确认大小无误后，再以此产物为模板，用基因首尾引物PCR即可。
八、Long PCR无条带
对于>5Kb片段扩增，常规PCR很难得到较好的条带，建议①更换更适合于Long PCR的聚合酶；②添加PCR Enhancer调整体系；③设计多对引物分段扩增。
PCR增强剂（PCR Enhancer）：
常见的添加剂有：DMSO，甘油，甲酰胺，硫酸铵，甜菜碱，BSA等，它们对PCR反应的影响虽然有所不同，但都可提高PCR的扩增效率。
1.DMSO：解除模板DNA局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但是对酶活有抑制作用，且当其浓度大于10％时还会降低保真性。
Nucleotides（核苷酸）and polymerases（聚合酶）, too.Denaturing（变性）, annealing（退火）, and extending（延伸）.Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.PCR, when you need to detect mutations（基因突变）.PCR, when you need to recombine（基因重组）.PCR, when you need to find out who the daddy is.PCR, when you need to solve a crime.中文歌词：
从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。
这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。
加热~冷却~加热~太神奇了！当你想要检测突变，来啊做PCR吧！
当你想要基因重组，来啊做PCR吧！
甘蔗线虫病抗性基因的PCR检测研究
以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的.保守序列区域,分别设计了2条上游引物、2条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用PCR特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物.用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了PCR-Southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性.
作 者：吴杨 周会 潘大仁 WU Yang ZHOU Hui PAN Da-Ren 作者单位：福建农林大学作物学院,福建,福州,350002 刊 名：作物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRONOMICA SINICA 年，卷(期)： 32(6) 分类号：S4 关键词：甘蔗 抗线虫基因 基因检测 PCR-Southern杂交本文采用巢式PCR/RT-PCR方法,对我国10个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71个肛拭子和61个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁.对阳性PCR结果进行测序分析,并与GenBank上的序列进行比较.结果,在肛拭子样品中检测到3个CPV和6个CCV阳性结果,经测序后,与GenBank上序列的同源性分别达99%和100%.而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV的.检测结果均为阴性.从阳性CPV的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作.本文所采用的PCR方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断.
作 者：秦琴 张陕宁 李明 魏辅文 QIN Qin ZHANG Shanning LI Ming WEI Fuwen 作者单位：秦琴,QIN Qin(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080;中国科学院研究生院,北京,100049)
张陕宁,ZHANG Shanning(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080;中国野生动物保护协会,北京,100080)
李明,魏辅文,LI Ming,WEI Fuwen(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080)
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