生物分离技术前沿（通用8篇）
吸附架桥效果好;②分子过小`絮凝剂在水中溶解度小.⑵絮凝剂用量:①浓度较低时增加用量有助于架桥充当,絮凝效果提高;②絮凝剂浓度过多时,引起吸附饱和,胶粒上形成覆盖层,失去与其他胶粒架桥作用.⑶pH值:影响离子型絮凝剂官能团电离度,提高电离度`使分子链上同电荷间斥力增大,链伸展,提高架桥能力.⑷搅拌速率和时间:剪切力会打散絮凝团,要注意搅拌.7.过滤设备及其结构:按推动力的不同可分为以下四类:⑴重力过滤:
应用较少.⑵加压过滤:操作繁杂,拆装不便.⑶真空过滤:可实现连续化生产.⑷离心过滤:略 8.重力沉降:当静置悬浮液时,密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐
下沉.离心沉降见10 9.重力沉降受重力:Fg=πd3
ρ
s 固体颗粒介质密度[kg/m3g/6 d—微粒半径[m].2
ρ].g—微粒加速度[m/s].s—
10.离心沉降:基于固体颗粒和周围液体密度存在差异,在离心场中使不
同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程.11.分离因数:Z=FC/g=4π2N2r/g.12.超离心技术分类:⑴制备型超离心.⑵分析型超离心.13.制备型离心:⑴离子差速离心法[分布离心法]:①逐渐增加离心速度.②高速与低速交替进行,使沉降粒子在不同离心速度及不同离心时间内分批分离出来.⑵一般密度梯度离心法[区带离心]:先将样品ag置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中,离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中,是粒子在完全沉降之前,液体梯度中形成不连续的分离区带,前提是要控制好粒子分离的时间.⑶等密度离心法:当不同离子存在密度差时,在离子力场作用下,粒子向上浮起,或向下沉降,一直移动到与它们密度正好相等的位置上,并形成区带.①预形成梯度等密度离心.②自形成梯度等密度离心.14.细胞破碎原理:动`植物及微生物长生的天然产物,有胞外型和胞内型两种.为回收胞内产物,需用利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内含物释放出来,然后再进行分离纯化.15.选择细胞破碎方法所考虑因素:⑴细胞壁的坚韧长度.⑵产物的性质[承受剪切力`耐酸`耐热].16.化学破碎法: 渗透冲击法`增溶法`碱溶法`酶溶法`脂溶法.17.[化学破碎]渗透冲击法:适用范围:⑴细胞破碎难易程度决定于其类型,红血球细胞非常适合采用渗透冲击法溶破,快速改变介质中盐浓度,将十分有效地破碎红血球细胞.⑵①动物细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破;②植物细胞很难溶破,因其细胞中含有大量木质成分,通过渗透流很难渗透.18.[化学破碎]增溶法:⑴方法:将2倍细胞体积的某浓度表面活性剂加入到细胞中,表面活性剂溶解细胞壁中的脂类成分,从而破碎细胞,胞内物释放.⑵表面活性剂通常是两性的,结构中含有亲水基团[离子及疏水基团[烃基],既能和水作用也能和脂作用.19.[化学破碎]碱溶法:⑴原理:细胞壁外层和浆膜上有Pro成分,利用Pro在碱性条件下溶解的特性,调节溶液pH值,实现Pro溶解,细胞壁破碎.⑵①优点:成本低廉,反应速度快;②缺点:反应剧烈,不具选择性,碱的加入,与细胞壁产生多种反应,包括磷脂皂化等.20.[化学破碎]酶溶法:⑴加酶法:将溶解细胞壁的酶加入体系中,细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞壁,进一步增大胞内产物通透性.⑵自溶法:通过调节温度`pH值或添加有机溶剂,诱使细胞产生溶解自身的酶的方法.⑶①优点:条件温和`具有选择性,可催化细胞壁反应,而不破坏细胞内的其他物质;②缺点:价格昂贵,限制大规模生产中的使用.21.[化学破碎]脂溶法:⑴原理:选择适当溶剂,加入细胞悬浮液中,细胞壁脂质吸收后导致细胞壁膨胀`裂开,细胞质释放.⑵选择理想的溶剂应选和细胞壁脂溶解度相配,而与细胞质相差较大的.22.物理破碎法:匀浆法`超声法`研磨法`珠磨法.23.[物理破碎]匀浆法:影响高压破碎的主要因素:操作压力`破碎次数`
阀型设计`操作温度`细胞浓度.24.[物理破碎]超声:影响因素:⑴振幅:振幅直接声能有关,影响目标产
物的释放量.⑵细胞悬浮液的黏度:黏度过大会抑制空穴现象.⑶被处理悬浮液的体积:体积越大需要的能量也越大.⑷珠粒的体积和直径:添加细小的珠粒有助于形成空穴,同时可以辅助研磨效应.随着珠粒直径的变化,目标K有最大值出现.⑸超声条件:破碎时间`温度`细胞种类`pH值`料液比.25.[物理破碎]高速搅拌珠研磨法:过程:⑴研磨仓为一个密封系统,有
垂直和水平两种设计:①垂直仓的研磨介质载量为50-60%,可减少珠的磨损,但效率低.②水平仓的研磨介质装载量80-85%,研磨效率高,但磨损大.⑵搅拌设计:主要是给研磨珠的推动力,搅拌盘与驱动轴有同心的,也有偏心的,有垂直的,也有倾斜的.⑶研磨珠:有无铅玻璃`钢珠`陶瓷珠等,直径在0.1-1.5mm范围内.①使用研磨珠的大小主要由细胞的大小决定:细菌菌体--用小的研磨珠,直径0.1mm;;酵母菌菌体--用大的研磨珠,直径0.5mm.②另外目标产物在细胞内的位置也影响研磨珠的选择:用大直径可以有效释放游离在细胞之中的目标产物,在细胞质中的产物,不必把细胞完全破碎;;在细胞核中的目标产物须完全破碎,用小直径的珠.⑷研磨珠的装载量:一般在80-90%之间.①太低,提供的碰撞率和剪切力不够,增加装载量提高细胞破碎率.②过大,研磨珠之间产生相互干扰,研磨珠会过度磨损,同时产生的温度会很高,能量消耗大,对目标产物也有影响.细胞破碎率与流速成反比关系.26.吸附:利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力,使其富集在吸附剂表面的过程.27.吸附过程[四过程]:料液与吸附剂混合→吸附质被吸附→料液流出
→吸附质解吸附吸附剂再生.28.吸附剂种类:⑴活性炭:活性炭粉末[效力强`需带压];颗粒活性碳[效力中`效率高];棉纶活性炭[效力弱`易洗脱].⑵大孔网状吸附剂:①吸附机理:大孔树脂属属非离子型共聚物,借助范德华力从ag中吸附各种有机物,其吸附能力与树脂的化学结构`物理性能以及与溶质`ag性质有关.②遵循规律:非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质;;极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质;;中等极性吸附剂兼有以上两种能力.29.影响吸附的主要因素:⑴吸附剂的性质:①比表面积大,吸附容积大:因此,颗粒度越小,微孔越发达,吸附速率越快,吸附能力越强.②孔结构:孔径太大,比表面积小,吸附能力差;;孔径太小,不利于吸附质向空隙中扩散.⑵吸附质的性质:①表面张力越小,液体被固体吸附越多;②在ag中溶解度大时,吸附量少;③相似相吸;④相对分子量大易吸附.⑶操作条件:①温度:吸附是放热过程,还要兼顾吸附质的稳定性.②溶液pH值:影响吸附质的解离,进而影响吸附量.最佳pH值需通过实验来确定.③盐浓度:有影响,或阻止或促进吸附,依情而定.30.亲和吸附:利用溶质和吸附剂之间特殊的可你亲合作用[静电`氢键`疏水`金属配位],从而实现分离.31.离子交换:利用离子交换树脂树脂作为吸附剂,将ag中的待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离目的.32.主要的多糖基离子交换树脂:⑴离子交换纤维素:①树脂骨架为纤维素,根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类.②特点:骨架松散`亲水性强`表面积大`交换容量大`吸附力弱`交换和洗脱条件温和`分辨率高.③常用的:甲基磺酸纤维素`羧甲基纤维素`二甲基氨基乙基纤维素.⑵葡聚糖凝胶离子交换树脂:①骨架为葡聚糖凝胶,根据功能集团的不同,亦可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂.②命名方法:交换活性基团+骨架+(阳C/阴A)原骨架编号.③如:DEAE-sephadex A-25为二乙基氨基乙基葡聚糖阴离子树脂;CM-sephadex C-25为羧甲基葡聚糖阳离子树脂.33.离子交换树脂分类:⑴按活性基团性质:阳离子交换树脂[含酸性基
团]`阴离子交换树脂[含碱性基团].⑵具体分为:强阳`弱阳&强阴`弱阴.34.离子交换树脂的理化性能:⑴外观:球形浅色为宜,粒度大小16-60
目>90%.⑵机械强度:>90%.⑶含水量:0.3-0.7g/g树脂.⑷交换容量:重量交换容量`体积交换容量`工作交换容量`表观交换容量.⑸稳定性:化学稳定性`热稳定性.⑹膨胀度:交联度`活性基团的性质与数量`活性离子的性质`介质的性质和浓度`骨架结构.⑺湿真密度:单位体积湿树脂的重量.⑻吸附性能指标:孔度`孔径`比表面积.⑼滴定曲线:表征树脂官能团.35.离子交换机理:⑴A+自ag中扩散到树脂表面.⑵A+从树脂表面进入
树脂内部的活性中心.⑶A+与R-B在活性中心上发生复分解反应.⑷解吸附离子B+自树脂内部扩散至数值表面.⑸B+离子从树脂表面扩散到ag中.36.扩散控制步骤:⑴内部扩散:液相浓度越快,搅拌越激烈,浓度越浓,颗
粒越大,吸附越弱.⑵外部扩散:液体流动慢,浓度稀,颗粒细,吸附强.37.离子交换速度方程:⑴外部扩散控制:ln(1-F)=-K1t
K1--外扩散速
度常数;F—时间为t时,树脂的饱和度.⑵内部扩散控制:F=1-6/π2
*∑[1/n2×e(-Din2π2t/r02)].38.影响交换速度的因素:⑴颗粒大小:愈小愈快,无论对内`外扩散.⑵
交联度:交联度小,树脂易膨胀,交换速度快.⑶温度:越高越快.⑷离子化合价:化合价越高`越快.⑸离子大小:越小越快,大分子阻力大,与骨架碰撞.⑹搅拌速度:在一定程度上`越大越快.⑺ag浓度:当交换速度为外扩散控制时,浓度越大,交换速度越快.39.应用实例—硬水软化:如果水质要求高,不仅要去除阳离子,还要出去阴离子.一般采用阳离子树脂和阴离子树脂.利用氢离子交换阳离子,而以氢氧根离子交换阴离子;以包含磺酸根的苯乙烯和二乙烯苯制成的阳离子交换树脂会以氢离子交换碰到的各种阳离子[如Na+`Ca2+`Al3+].同样的,以包含季铵盐的苯乙烯制成的阴离子交换树脂会以氢氧根离子交换碰到各种阴离子[如Cl-].从阳离子交换树脂释出的氢氧根离子相结合后生成纯水.40.蛋白质离交分离的基本步骤:⑴平衡:以平衡缓冲液冲洗装填好的分离柱,目的是使离子交换树脂表面的碱性[或酸性]配基完全被平衡缓冲液中的反离子所饱和,确保分离柱处于稳定的状态.⑵吸附:样品ag进入分离柱,各组分依据离子交换亲和力大小与离子交换剂作用,目标物分子吸附于树脂上,并释放出反离子.⑶洗脱:媳妇完成后,以洗脱剂洗脱.洗脱剂含有高浓度反离子,通过竞争性吸附实现目标物洗脱.⑷再生:通过高浓度洗脱剂使离子交换树脂重新获得吸附能力.41.泡沫分离定义:以通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体,液相中的溶质或颗粒在表面活性的作用下吸附于气泡上进行的分离,人们通常把凡是利用气体在ag中鼓泡,以达到分离或浓缩目的的这类方法总称为泡沫吸附分离技术.42.泡沫分离技术须在低于CMC浓度下进行.见48的⑶
43.泡沫分离效率的衡量指标:富集比`回收率.富集比=消泡液中的表面活性物质浓度/液相中初始料液浓度.回收率=(初始液浓度*初始液体积--剩余液浓度*剩余液体积)/(初始液浓度*初始液体积).44.泡沫的形成:⑴当气体在含表面活性剂的水ag中发泡时,首先在液体内部形成被气裹的气泡,与此同时,ag表面活性剂分子立即在气泡表面排成单分子膜,亲油基指向气泡内部,亲水基指向ag.⑵气泡借助浮力上升,冲击ag表面的单分子膜.⑶某些情况下,气泡可以跳出液体表面,此时,该气泡表面的水膜外层上,形成与液体内部单分子膜的分子排列完全相反的单分子膜,从而构成了较为稳定的双分子层气泡体,形成接近于球体的单个气泡.45.泡沫分离法的分类:⑴泡沫分离:按分离对象是ag还是含有固体粒
子的悬浮液`胶体ag,泡沫分离可分成:①泡沫分离:用于分离溶解物质,他们可以是表面活性剂,或者可与表面活性剂结合的物质,当料液鼓泡时,能进入液层上方泡沫层,从而与液相主体分开.②泡沫浮选:用于分离不溶解物质,按被分离对象是分子/胶体,是大颗粒/小颗粒.又被称作分子浮选`粒子浮选`胶体浮选等.应用较多的是对于Pro`酶的分离,目前还处于实验室阶段,最初用于胆酸和胆酸钠混合物中分离胆酸,泡沫中胆酸浓度为料液的3-6倍,活性增加65%,还有大豆蛋白质的分离也在实验室阶段成功提取.⑵无泡沫分离:用鼓泡进行分离,但不一定形成泡沫层,按是否存在萃取层,可分为:①鼓泡分离:从设备底部通气鼓泡,表面活性物质被气泡富集并上升至塔顶,和液相主题分离,使溶质得到浓缩,液相主体被净化.②萃取浮选:在ag顶部设置有一种与其互不相容的溶剂,用它来萃取或富集有塔底鼓出的气泡所吸附的表面活性物质.应用与贵重金属的分离辅机,如采用乙基二甲二硫代氨基甲酸酯将尾矿中的黄金由每吨5g左右提高到每吨2250g以上.46.气泡间当膜间夹角为120°时,压力差最小,泡沫稳定.47.泡沫的稳定性影响因素:⑴泡径大小:泡径小,利于稳定,合成大气泡的历程长,且泡膜中含液量相对较大,较能经受液体流失造成的稳定性损失.另方面,泡径小,在液相中的上升速度慢,为表面活性剂的吸附提供充足的时间,增加了稳定性.⑵起泡液粘度:一定的黏度有利于泡沫稳定,某些ag,[如Pro溶液,虽然表面张力较高,但因粘度大,对于外力的冲击起到缓冲作用,所以产生的泡沫稳定].⑶温度:基本条件是应达到表面活性剂的气泡温度,但随温度升高,ag粘度降低,表面弹性降低,排液速度加快,泡沫稳定性下降.⑷离子强度:表面电荷离子型表面活性剂,水解后带电荷,泡沫的定向吸附层为双电层结构,由于离子间延缓泡沫变薄过程,使泡沫稳定.48.泡沫分离操作的影响因素:⑴待分离物质的种类:不同分离物质其理化性质不同,表面活性也不同,因此是对分离影响最大的因素.⑵pH值:不同的pH值对分离效果有影响,对于天然表面活性物质,[如:Pro的泡沫分离,在等电点时,Pro在泡沫表面的吸附量最大]这些条件下进行分离,分离效率最高.⑶表面活性剂浓度:一般要在CMC以下,过高引起排液阻力大;;太低,泡沫层不稳定,太高,分离效率下降.⑷温度:温度应达到表面活性剂的气泡温度,保持泡沫稳定性;还要根据吸附平衡类型来选择分度高低.⑸气流速度[气体流量]:上升,泡沫形成速度↑,单位时间的去除率也↑,泡沫停留时间短,影响分离选择性;;过低时,泡沫又停留时间过长,效率低,且物质易变性.⑹泡沫柱高度:足够高的柱体才能保证泡沫层高度,使泡沫在柱中有适当的停留时间,满足目标分离需求.49.萃取分类:⑴按萃取对象分:①液-液:用选定的溶剂分离液体混合物中的某种组分.溶剂与被萃取混合液体不相溶具有选择性的溶解能力,有好的热稳定性和化学稳定性,并有小的毒性和腐蚀性.②固-液:也叫浸取,用溶剂分离固液混合物中组分,如用水浸取甜菜中的糖类;用正乙烷浸取黄豆中的豆油;用水从药中浸取有效成分叫做”渗沥”或”浸沥”.⑵按萃取机理分:①物理萃取:利用溶剂对欲分离组分有较高溶解能力,分离过程为物理过程.②化学:溶剂首先在选择性与溶质化合或络合,从而在两相中重新分配而达到分离目的.50.有机溶剂萃取法:[溶剂萃取]利用样品中不同组分分配在两种互不相容的溶剂中的溶解度或分配比不同来达到分离`提纯或纯化的目的.51.萃取分离原理:分配定律:在一定T`P下,溶质在两个互不相溶的溶剂中分配,平衡时,如果在两相中的相对分子质量相等,溶质在两相中平衡浓度之比为成熟,成为分配系数K,表征平衡的两个共存相中溶质浓度的关系.k=y/x;;y—平衡时溶质在萃取相中的浓度.x—平衡时溶质在萃余相中的浓度.52.萃取步骤方法:⑴单机萃取.⑵多级萃取:①错流接触.②逆流接触[多用].53.多级萃取设备流程:待分离液经去杂后进入第一级萃取罐,在此与第二级沉降器来的萃取相[含目标物]混合接触,然后流入第一级沉降器分成上`下两液层,上层萃取相富含目的产物送去蒸馏回收溶剂及产物进一步精制;下层萃余相,含目的产物浓度较低,送第二级萃取.54.有机溶剂萃取的影响因素:⑴有机溶剂的选择.⑵乳化与去乳化.⑶
萃取操作的因素.55.萃取操作的因素:⑴pH值:①对弱酸随pH值降低,分配系数增大.②
对弱碱随pH值降低,分配系数减少..pH值低有利于酸性物质分配在有机相;碱性物质分配在水相.⑵温度:①温度高,分子扩散速度快,萃取速度快.②温度低,使分配系数增加.⑶盐析:生化物质在水中溶解度低,有利于溶质向有机相中分配.56.常用表面活性剂及其相应的有机溶剂:⑴AOT—烃类`异辛烷`环己
烷`四氯化碳`苯.⑵CTAB—己醇/异辛烷`己醇/辛烷`三氯甲烷/辛烷.⑶TOMAC—环己烷.⑷TritonX—己醇/环己烷.⑸磷脂酰胆碱—苯`庚烷.⑹磷脂酰乙醇胺—苯`庚烷.57.水壳模型:大分子蛋白质被封闭在”水池”中,表面存在一层水化层与
胶束内表面分隔开,从而使蛋白质不与有机溶剂直接接触.依据:⑴从似弹性光散射的研究证实在Pro分子周围存在一个单分子水层.⑵反胶束中酶动力学特征与水中接近.⑶某蛋白酶在胶束中的荧光特性与主题水中相像.58.Pro溶入反胶束的推动力:⑴静电引力作用:Pro的表面电荷与表面
活性剂反胶束内表面电荷[离子型表面活性剂]之间的静电引力作用.对于阳离子表面活性剂形成的反胶束体系,萃取只发生在水溶液的pH>pI.⑵空间位阻作用:反胶束”水池”的物理性能[包括其大小`形状及其中水的活度]会影响Pro的增溶或排斥.59.反相微胶束分离过程分为3步:⑴选择有利于形成油包水和适当
W0值的表面活性剂[HLB为3-6].⑵含生物大分子的反相微胶团的形成.⑶反相微胶团的破乳及生物大分子的释放.60.反胶束萃取操作方法:⑴相转移法.⑵注入法.⑵溶解法.61.反萃取效果评估:一方面对Pro的回收率和分离度进行评估,还应对其分离过程中微观变化分子构象评估,即对其生物活性要有保证.62.双水相萃取:利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程.63.双水相体系的种类:⑴两种都是非离子型高聚物(PEG/DEX`聚丙二醇/DEX等).⑵其中一种是离子型高聚物(羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX).⑶两种都是离子型高聚物(羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠).⑷其中一种是无机盐(PEG/磷酸盐或硫酸盐).64.试差实验及放大:⑴双水相体系形成判定:将一定量的高聚物P浓溶液置于试管内,然后用已知浓度的高聚物Q溶液来滴定.随着高聚物Q的加入,试管内ag由均相突然变浑浊,记录Q加入量.然后在试管内加1ml水,ag又澄清,继续滴加高聚物Q,ag又变浑浊,此时系统形成.以高聚物P浓度对高聚物Q浓度作图,为一系列双节线上的系统组成点,即可得到双节线.⑵试差实验放大:采用10ml离心管进行试验,结果可直接放大生产.操作过程:①配置高浓度的聚合物和盐的备用液,配置一系列不同浓度`pH值的双水相,每个双水相只改变一个参数[pH的调节可采用磷酸盐缓冲液].②先加入料液,再加入配置好的备用高聚物及盐液,使整个系统质量达到5-10g,离心管封口后,充分混合.③在1800-2000g离心3-5min,使两相完全分离.④小心移取上下两相,分别测定目标物含量,并与加入总量作对比.65.膜分离技术的概念:利用天然的或人工合成的`具有选择透过性的薄膜,以外界能量差作为推动力,由于ag中各组分迁移率的不同而进行分离`分级`提纯`富集的一种技术.66.膜分离技术的优势&劣势:⑴优势:①能耗低,处理量大.②分离条件温和,使用热敏物质的分离.③操作方便结构紧凑,工作方式灵活,自动化程度高.⑵劣势:①操作工程化中膜面容易发生污染,膜性能呈衰减趋势.②膜的耐药性`耐热性和耐溶剂能力有限.③多数膜组件价格昂贵,投资高.67.膜分离分类依据:⑴膜的平均孔径.⑵膜的推动力.⑶膜的状态.⑷膜的结构.⑸膜的形状.⑹膜的材质.68.膜分离技术按孔径分类:⑴微滤[MF]:以多孔细小薄膜为过滤介质,主要用于DNA`病毒截留与浓缩,也多于膜分离的前处理,孔径分布范围约在0.02-10μm之间.⑵超滤[UF]:分离介质同上,但孔径更小,约为0.001-0.1μm,适合与分离酶`Pro等生物大分子物质.⑶纳滤:从ag中截留平均分子量300-5000的物质,孔径分布在0.2-2nm.⑷反渗透[RO]:孔径范围0.0001-0.001μm之间,主要应用于汗水脱盐`超净水设备等.69.截留分子量[MWCO]:又称为切割分子量,指截留率为90%时所对
应的分子量,与膜孔径大小有关.由于直接测定超滤膜的孔径相当困难,所以使用一直分子量的球状物质进行测定.如膜对被截留物质的截留率达到90%时,就用被截留物质的分子量表示膜的截留性能,称为膜的截留分子量.实际上,所用的物质并非绝对球形,膜孔径也绝非绝对均一,所测定的截留率不能绝对表示膜的分离性能.70.膜分离过程模型:⑴浓差极化:①在操作过程中,由于膜的选择透过
性,被截留组分在膜料液侧表面积累形成浓度边界层,其浓度大大高于料液的主体浓度,在膜表面与主体料液之间浓度差的作用下,将导致溶质从膜表面向主体的反向扩散.②危害:膜面处浓度Ci增加,使得渗透压↑:在一定操作压力下,溶剂的透过速率↓,Ci增加,导致溶质的透过↑,截留率↓.③避免:可通过提高操作温度`对膜定期清洗等措施来避免浓差极化.⑵凝胶极化:膜表面的浓度超过溶质的溶解度时,溶质析出,形成凝胶层.当料液中含有菌体`细胞或其他固形物时,也会形成凝胶层.71.模装置的工作形式-超滤膜装置:一般用来完成目标物的浓缩和目标
物脱出小分子杂质,分别称为浓缩和洗滤.浓缩:①开路循环:循环液中溶质浓度不断上升,若流量和压差不变,透过通量将随操作时间不断降低.②闭路循环:循环液中溶质浓度增加更快,通过通量小于开路循环.优点是膜组件内流速可不单纯依靠料液泵供应.③连续浓缩:容易实现自动化.但透过通量很低,为改善通量,一般设计成多段串联组合.72.乳状液膜制作过程:⑴首先把两种互不相容的液体在高剪切下制成油包水小液滴;⑵其次在温和搅拌下将油包水乳液分散在第三相[料液相即外相]中;⑶乳状液滴内被包裹的相为内相,内相外相之间为液膜.73.载体促进传递机制有不同表现形式:同相迁移[促进并流]`逆向迁移[促进逆流].74.盐析:De:在高浓度的中性盐存在下,Pro[酶]等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低,产生沉淀的过程.虽然方法经典,但主要用于Pro分离与回收.75.盐析过程:是对[生物大分子在水ag中存在状态:⑴两性电解质,由于静电力的作用,分子间相互排斥,形成稳定的分散系.⑵Pro周围形成水合膜,保护了Pro粒子,避免了相互碰撞.]破坏的过程:原因:⑴盐离子与Pro表面具有相反电性的离子基团形成离子对,部分中和了Pro电性,稳定的双电层被破坏,Pro分子间斥力减弱而相互聚拢.⑵中性盐亲水性比Pro大,盐离子在水中发生水合使Pro脱去水合膜,暴露疏水区域,疏水相互作用产生沉淀.76.盐溶液对Pro溶解度影响:中性盐加入Pro溶液时可能出现:⑴”盐溶”现象:较低盐浓度(0.15-0.2mol/kg)下,Pro溶解度随盐浓度增大而增大.⑵”盐析”现象:高盐浓度下,Pro溶解度随盐浓度增大而下降.77.盐析方法分类:⑴β盐析法:在一定离子强度下,改变pH和温度进行盐析[逐步向Pro溶液中加入预先调好pH的饱和硫酸铵ag,调节温度,Pro便沉淀出来].由于溶解度随温度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,常用于纯化.⑵KS盐析法:在一定pH和温度下,改变体系离子强度进行盐析的方法[粗制品中逐步加入固体硫酸铵,加到一定饱和度时,Pro便沉淀出来].由于Pro对离子强度的变化非常敏感,易产生共沉淀现象,因此常用于提取液的前处理.78.影响盐析的因素:⑴Pro浓度:①高浓度Pro可节约用盐量,但过高
会发生严重沉淀.②低浓度Pro用盐量较多,共沉作用少.⑵盐种类的影响:阳离子:NH4+>K+>Na+>Mg2+.阴离子:SO42+>CHCOO->Cl->NO2->ClO3-.⑶温度:①低离子强度/纯水中:蛋白质溶解度随温度↑而↑.②高浓度:随温度↑而↓.⑷pH的影响:等电点附近Pro溶解度小,是盐析沉淀适合的pH.79.盐析沉淀操作:lg:硫酸铵步骤:
⑴取一部分料液,将其分成等体积的数份,冷却至0℃.⑵用W=[505(S2-S1)]/(1-0.285S2)式计算饱和度达到20%-100%时所需加入的硫酸铵量,并在搅拌条件下分别加到料液中,继续搅拌1h以上,使沉淀达到平衡.⑶3000g下离心40min后,将沉淀溶于2倍体积的缓冲ag中,测定其中Pro总浓度和目标Pro浓度[如有不溶物,可离心去除].⑷分别测定上清液中Pro的总浓度和目标Pro的浓度,比较沉淀前后Pro是否保持物料守恒,检验分析结果的可靠性.⑸以饱和度为横坐标,上清液中Pro总浓度和目标Pro浓度为纵坐标作图,图中纵坐标为上清液中Pro的相对浓度[与原料液浓度之比].80.@@沉淀生成过程:Pro分子通过接触而聚集,形成微细颗粒,微细颗
粒继续生长成为大颗粒沉淀.⑴扩散控制过程:生长出去,布朗粒子的扩散,推动粒子的生长.这一过程称为[异向生长].⑵剪切作用生长过程:在搅拌作用下,粒径1μm以上的粒子生长主要起因在于剪切作用引起的颗粒间互相碰撞,发生凝聚.这一过程称为[同向凝聚]…同向凝聚速率很低,是沉淀过程的控制步骤.因此,搅拌混合非常重要,沉淀放大设计时,单位体积的搅拌功率是放大的基准,一般在放大后不变.81.色谱分离法概念:是一种物理的分离方法,利用不同物质在两相[固
定相和流动相]中具有不同的分配系数,并通过两相不断的相对运动而实现分离的方法.82.色谱过程:⑴物质分子在相对运动的两相间分配平衡的过程.在混合物中,若两个组分的分配系数不等,则被流动相携带移动的速率不等,即形成差速迁移而被分离.@⑵经色谱柱的分离,各组分将分别流过检测器,检测器将流动相中各组分浓度变化转变成电信号.随时间变化的曲线,称为色谱流出曲线,或称色谱图.83.[色谱术语]色谱图和色谱峰:⑴组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线为色谱图.⑵流出曲线上的突起部分为色谱峰.84.[色谱术语]⑴正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线[高斯曲线].⑵不对称色谱峰有两种:前沿峰[较少]`和拖尾峰.⑶不对称峰的原因复杂:进样体积`浓度`柱温`柱污染`样品溶液离子强度`柱极性等.85.[色谱术语]对称因子[判断是否对称]:fS=W0.55h/2A=(A+B)/2A 完全对称:fS=1.00;对称峰: fS =0.95-1.05;前沿峰: fS <0.95;拖尾峰fS >1.05.86.[色谱术语]色谱基线:色谱操作条件下,仅有流动相通过检测器时,反应检测器噪声随时间变化的曲线.稳定的基线是一条直线.87.[色谱术语]基线噪音:与被测样无关的检测器输出信号引起的基线波动,基线波动的大小就是噪声的大小.基线漂移:基线随时间的增加朝单一方向的偏离.88.[色谱术语]峰高h:从色谱峰顶点到基线的距离.峰高一般用mm或检测器输出信号单位表示.峰高可作为定量测定的依据之一.89.[色谱术语]峰底宽度W:在色谱峰两边的转折点[也叫拐点,即E和F]所画的切线与基线相交的截距IJ.两个拐点E和F之间的距离为EF=2σ,分别位于约0.607h处.峰宽直接体现出色谱条件的影响.90.[色谱术语]峰面积A:色谱峰与基线延长线所包围的面积.91.[色谱术语]保留指数:它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100.92.[色谱术语]分离度RS:相邻两个组分的色谱峰,其保留时间差与两
峰峰底宽平均值之商.93.[分配色谱]⑴正相色谱:极性固定相+非极性流动相
用于分离极
性化合物,极性小的组分先流出.⑵反相色谱:非极性固定相+极性流动相 用于分离非极性化合物,极性大的组分先流出.94.载体:载体是惰性的,无吸附能力,可吸留较大固定相液体.⑴硅胶:使
用前:酸洗—水洗—醇洗—干燥—水混—调浆[展开剂]—装柱.⑵硅藻土:是目前应用最多的载体.处理方法同上,浆态上柱,压平.⑶纤维素:也较为常用,酸洗+水洗.95.选择展开剂[流动相]时,首先应选择各组分溶解度相差较大的溶剂.展开剂必须先用固定相饱和,方法是过量固定相加展开剂中,分液漏
斗分层出展开剂.96.凝胶[排阻]色谱:原理:待分离物质分子量大小不同,在凝胶柱经过
时,停留时间的不同得以分离.97.三种凝胶:⑴葡聚糖凝胶:应用最广①国外商品名Sephadex,由葡聚
糖交联而成.葡聚糖是蔗糖发酵后,分级,选取分子质量在3×104-5
×104的部分,经交联后得到不溶于水的葡聚糖凝胶.②交联度:交联
剂占原料总质量的百分比称为交联度.③常用G类Sephadex商品，Sephadex G-250含义为每克干胶吸水体积可达到25ml.⑵聚苯烯酰胺凝胶:①一种全化学合成的人工凝胶,由苯烯酰胺[单体]以亚
甲基双苯烯酰胺[双体]为交联剂,经催化聚合而成再经干燥成型处
理得到颗粒状干粉商品.②商品名:Bio-Gel P, P后编号×1000大致
反应其排阻极限.③如: Bio-Gel P-100表示其分离相对分子质量大约为100000.⑶琼脂糖凝胶:①用氯化十六烷基吡啶/乙烯醇等将海藻多糖琼脂中带负电基团的琼脂胶沉淀除去,得到中性多糖成分即为琼脂糖.②商品名:Sepharose 2B`4B`6B.表示琼脂糖浓度
在我对当前几届学生的授课过程中发现现有的传统理论授课模式无法满足现在学生的学习现状, 也不能很好的调动学生的学习积极性, 课堂上无论教师如何强调课堂纪律, 仍有许多学生开小差, 或者讲话, 或者玩手机。学生自我强烈要求学习的意识淡薄, 自主学习能力差, 是改革须待解决的问题。
2 建构主义理论的内容及建构主义的教学理论和学习理论
建构主义理论的内容很丰富, 其核心是以学生为中心, 强调培养学习者的主动“建构”能力。理论认为, 存在人们对世界的理解和赋予意义却是由每个人自己决定的, 人的知识是由个体主动建构的, 而不是由他人传递的。每个人都是以自己的经验为基础来建构现实, 由于个体的经验以及对经验的信念不同, 因而对外部世界的理解也各不相同, 所以建构主义学习理论更关注如何以原有的经验、心理结构和信念来建构知识, 强调学习的主动性、社会性和情景性。可以说, 它较好地揭示了人类学习过程的认知规律, 阐明了学习如何发生、意义如何建构、概念如何形成以及理想的学习环境等内容。因此, 建构主义理论强调如下。
首先, 学生是学习的主体, 是认知和信息加工、处理的主体, 是知识意义的主动建构者, 且这种建构是发生在与他人交往的环境中, 是社会互动的结果。
其次, 它强调情景的重要性, 认为学生的学习是与真实的或类似于真实的情景联系起来的, 是对真实情景的体验。学生只有在真实的社会文化背景下, 才能真正有效的建构知识。
第三, 建构主义理论强调知识建构的特殊性, 认为学生的学习是在自己已有经验的基础上, 在特定的情景下, 以特定的方式建构。这种建构是学生之间、师生之间的协作交流, 是学生和教学内容与教学媒体之间相互作用的结果。
第四, 建构主义强调学生的学习目标应由学生自己来设定, 鼓励学生从自己的学习需要出发, 对初始目标进行分解、转化、整合、不断建构自己的学习目标, 并且, 通过学生的自我分析和元认知, 来实现自我测试和自我检查, 以诊断目标达成情况以及如何调整学习策略尽快实现目标。
建构主义教学理论强调以学生为中心, 不仅要学生由外部刺激的被动接受转变为对信息进行处理、加工的主体, 成为学习知识、创造知识的主动者, 而且要求教师要由知识的传授者、灌输者转变为学生主动学习、创造的帮助者、促进者。在建构主义理论指导下, 学校要更新教育教学观念, 改变培养目标、评价方式和调整课程设置, 教师在教学过程中要采用新的教学模式、新的教学方法和新的教学设计, 以建构主义理论为宗旨, 最终达到关键技能的培养目标。
建构主义学习理论认为, 学习是在一定的情境之中, 借助他人的帮助, 即通过人际协作, 利用必要的学习资料, 构建自己知识结构的过程。这种学习理论强调以学生为中心, 不仅要学生由外部刺激的被动接受转变为对信息进行处理、加工的主体, 成为学习知识、创造知识的主动者, 而且要求教师由知识的传授者、灌输者转变为学生主动学习、创造的帮助者、促进者。提倡的学习方法是在教师指导下、以学生为中心的学习。
3 课程授课模式的探索和改革
在以上理论的指导下, 对生物分离技术课程按照以工作过程为导向的模式和建构主义教学模式指导改革课程授课模式并改革学生学习效果评价模式, 才能解决目前学生的学习现状, 最大化调动学生学习积极性, 最终提高教学质量, 提升教学内涵建设。
首先建立以工作过程为导向的课程授课模式: (1) 通过市场调研:调研了江苏奥赛康药业有限公司、南京同凯生物技术公司等生物技术公司, 以及部分毕业后从事相关工作的毕业生, 确定生物分离技术课程的典型工作任务, 包括确定学习领域。 (2) 根据学习领域, 确定教学大纲及工作过程并根据情况实施。
然后课程教学模式探索中及教学结束后, 建立建构主义模式指导下的学习评价方式如下。
(1) 建立以学生出勤、课堂参与、小组成员合作情况、平时作业及实验报告五项共同构成的过程评价。
(2) 建立以读书报告 (读与工作任务相关的书或相关文献) , 课程实验期末考核两项构成的, 其中对课程实验期末考核进行改革, 侧重于考核学生分析解决问题的能力。改革传统的闭卷考试的方式, 采用论文或几个论述题的方式进行。
(3) 通过以上的过程评价和课程期末评价, 按照5∶5的方式最终得出课程学习结果评价。
4 结语
通过以上授课模式的探索, 确定了生物分离技术课程的典型工作任务和学习领域, 确定了教学大纲及工作过程, 并在课程实验课中进行实施。学生提交了平时作业, 实验报告, 也进行了课程实验期末考核, 从学生的平时作业、实验报告、课程实验期末考核情况, 反馈出学生的学习积极性有了很大提高, 课堂利用率提高了, 学生的主动学习和参与性有了很大提高, 成为学习知识、创造知识的主动者, 而且教师也在一定程度上由知识的传授者、灌输者转变为学生主动学习、创造的帮助者、促进者。学生对所学理论知识能灵活运用了, 实践操作技能也得到很大锻炼和提高。
参考文献
[1]周平儒.基于建构主义学习理论的教学模式[J].雅安教育学院学报, 2001, 15 (2) :48.
[2]聂淼.建构主义理论对高职生英语教学的指导意义[J].课程.教材.教法, 2004, 4:15～16.
[3]欧阳平凯, 胡永红.生物分离原理及技术[M].北京:化学工业出版社, 2007.
【关键词】生物分离工程 教学 多媒体 体系 学生
【中图分类号】G642 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2013）12-0186-02
生物分离工程的教学主要研究生物的分离、提取和精制的过程。与化工分离过程不同的是，生物分离工程研究的目标产物通常都有浓度低、物料的组成复杂、容易失活以及对产品质量的要求比较高等共性，因而生物分离工程是一门综合性很强的科目，物理学、机械、生物、化学以及数学等学科的知识点在生物分离工程这一科目中都会有涉及。在这样的情况下，学科的学习难度自然就不用说了。针对这种情况，本文提出了一些建议，希望可以帮助大家更好的学习生物分离工程这门学科。
一、教师多钻研教材，对教学类内容进行优化，增强讲课的针对性
生物分离工程这门课程需在专业学习的较高年级开设，而此时这些高年级的学生不仅需要应付课业的压力，同时也面临着就业找工作的压力。因此，对于这门课程在将来就业时的重要性他们会非常的关注。生物分离工程这个专业毕业以后的去向主要有两类，一类是进行生物工业的生产和管理，这类工作性质需要学生工作在生产一线；然后就是到各种研究院进行生物分离的应用研究。这两种选择对生物分离工程的教学要求并不相同，因此教师需要在进行教学活动时兼顾学生的不同需求。比如，在讲解分离技术的相关知识时，既要让学生了解到离心技术在进行科研时的应用，也需要让学生了解它如何应用于工业生产中。而离心技术的讲解，除需要对离心原理进行解释外，还可以结合实际生产的操作流程来介绍离心设备的使用方法，这对于将来从事生产一线工作的学生将会非常有用。对于将来想要继续深造的学生则可以介绍一下低速、高速以及超速这三种离心机的不同之处以及它的应用实例。
生物分离工程课程的教学内容包括了分离的基本理论、分离过程的要点以及分离设备的使用等，涉及的内容不仅多而且复杂。而生物分离技术也在随着时代的发展而进步，因此，教师在教学的时候应该注意将最前沿的生物分离技术与教材的内容相结合，而不应该让学生的眼界被局限在当前。
二、创造活跃的学习氛围，让学生的学习热情得到释放
教师在课堂教学的过程中应该注意课堂氛围对学生的影响，通过生动的实例分析来吸引学生的注意力，并用贴近生活的实例分析来加深学生对知识点的理解。比如在讲授膜的分离技术相关内容时，可以将纺织和制药废水作为例子来讲述微滤膜、反渗透膜以及超滤膜在污水处理时的不同应用。学生可以在三者的对比中更加深刻的理解微滤膜和超滤膜去除污水中的微粒和杂质的原理，而反渗透膜是如何除去污水中的有害金属离子的，进而了解到不同膜的不同作用原理。
另外，将前沿技术与所学课程内容相结合不仅可以让学生加深对技术创新过程的了解，也可以激发学生对科学创新的动力，进而对学习更加的充满热情。
课堂中实例的引入增加了学习过程的新颖性和趣味性，这对培养学生的探索能力十分有利。而实例中技术创新者的科学精神也可以让学生受到感染。比如，胰岛素的发现过程非常的艰辛，这个例子的提出可以让学生充分的了解到科学家孜孜不倦的科研精神，这些人文精神的熏陶对学生人生道路的发展也是非常重要的。
三、多媒体教学的利用，让学生充分的参与课堂教学
教师对多媒体教学的利用不仅节省了书写的耗时，也不会让课堂气氛太过沉闷。多媒体教学不仅可以让教师的讲课内容图文并茂，也更有利于课程的教学互动。例如，在讲解色谱分析技术时，就可以利用多媒体演示的方式将色谱纯化的过程清晰地呈现出来，然后让学生自由讨论，对不同的色谱技术进行原理以及特性的比较。学生在课堂上的积极参与不仅可以锻炼他们分析、解决问题的能力，同时他们的表达能力也可以得到提高。
四、布置课外阅读的任务，提高研讨式教学的效果
研讨式教学的核心是学生自己，因而在这种教学模式下学生可以得到各方面的锻炼，综合能合理会得到最大程度的提高。教师在确定讨论的选题时应该搜集充分的资料，找出最适合学生发挥的题目。
由于在实际的讨论过程中，学生知识面的狭窄以及理论水平的限制，使得学生的讨论热情不高，研讨式教学始终没有达到预期的教学效果。这一问题我们可以通过制定虚拟目标的方式来解决。虚拟目标的制定可以留给学生足够的准备时间，让学生对研讨的选题有充分的了解。为帮助学生在最短的时间内整合到最多有用的信息，教师还应该为学生提供相关书籍，这样既可以通过研讨式教学锻炼学生各方面的能力，也可以增加学生的课外阅读量。
五、加强实验教学，培养学生的动手能力
生物分离工程的综合性与实践性决定了实验课的重要。实验作为一个不可缺少的教学手段，应该得到生物分离工程教师的充分重视。课程中的各种操作如离心分离、盐析、离子交换、活化、干燥等都会在实验中得到锻炼。实验中的相关操作，可以让学生更加熟悉生物制品的操作流程，也有利于学生对实际生产操作的适应。在实际的动手操作中，学生会有更丰富的感性认识，不管是对他们的继续深造还是就业之路都有很大的帮助，也会让他们更有信心。
六、结语
生物分离工程这门学科的学习需要结合好理论与实验，实践性很强，这为高校学生学好这门学科带来了不小的难度。教师在平时的教学工作中应该及时的进行总结，为学生发掘出最适当的教学方法，并对课程内容进行优化，通过各种教学手段的运用让学生可以更高效的学好生物分离工程这门学科。教学过程中不仅要考虑学生所面临的压力，也应该重视学生各方面能力的培养，让生物分离工程这门课程有更好的教学质量。
参考文献：
[1]张轩，陈海燕.高校生物分离工程教学改革探索[J].中国科教创新导刊，2012（34）.
[2]陈婷，张兴群.“生物分离工程”课程的教学改革[J].纺织服装教育，2012（3）.
[3]杨艳，吴韶红，贾士芳.谈“三结合”教学方法在生物分离工程课程教学过程中的探索与实践[J].化工高等教育，2012（2）.
电泳：荷电的胶体粒子在电场中的移动。PPT
或者：荷电溶质（电解质）或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象P362
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。PPT
或者：单位电场强度下的电泳速度。P363
膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。PPT
或者：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。P56
离子交换: 在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。PPT
亲和层析：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。PPT
过滤：是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。PPT
或者：利用薄片形多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。P20
沉降：离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程，当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。PPT
重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。PPT
分辨率：也称分离度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。PPT
晶体：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。PPT
分子伴侣：是一种热休克蛋白质，在体内和体外都具有抑制蛋白质伸展肽链错误折叠和聚集、促进肽链折叠成天然活性肽的作用。P394
对流干燥：对流干燥过程中载热体对对流方式与湿物料颗粒（或液滴）直接接触，向湿物料对流传热，故对流干燥又称直接加热干燥。P440 07生技2班 生物分离工程 2010-7-4 初级分离：指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。P35
双水相系统：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。P116
双结点线：双结点线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。P117
反胶团：表面活性剂在有机溶剂中形成的胶团。P149
泡沫分离：根据表面吸附的原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离，又称泡沫吸附分离，或泡沫分级，或鼓泡分级。P46
双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。网上找的
截留率 ：表示膜对溶质的截留能力，可用小数或百分数表示。P71（真实截留率和表观截留率）
自溶：通过调节温度、PH值或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法，也是一种酶溶法。P31
盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象。P36
硫酸铵饱和度：P39
临界点：物质均具有其固有的临界温度和临界压力，在压力—温度相图上称为临界点。P170
交换容量(exchange capacity)指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数之一。PPT 工作（有效）交换容量：实测值，与实验条件有关。网上找的
分离因数：离心设备所能达到的离心力与重力的比值。P14
带溶剂：由于萃取剂与抗生素形成的复合物分子的疏水性比抗生素分子本身高的多，从而在有机相中有很高的溶解度。因此，在抗生素萃取中萃取剂又称带溶剂。P100
物理萃取：溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。例如，用乙酸丁酯萃取青霉素。(物理萃取广泛应用于石油化07生技2班 生物分离工程 2010-7-4 工、抗生素及天然植物中有效成分的提取过程)P92/PPT
化学萃取：用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应，包括离子交换和络合反应等。如用萃取剂季铵盐(氯化三辛基甲铵，R+Cl-)萃取氨基酸A-。P92/PPT
盐溶：向蛋白质的水溶液逐渐加入电解质是，开始阶段蛋白质的活度系数降低，并且蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶。P37
沉析：利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。
了解：特定：操作简单、经济、浓缩倍数高； 种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等；
缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强）
一般沉析操作过程：
1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；
2、沉淀物的陈化，促进晶体生长；
3、离心或过滤，收集沉淀物。网上找的
吸附等温线：当吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量q*同溶液中溶质的平衡应与温度有关。当温度一定时，吸附量只和浓度有关，q* = f(c)。PPT
保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。色谱PPT
死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算。色谱PPT
理论塔板高度：单位理论塔板的长度称为理论塔板高度。它等于色谱柱长度除以理论塔板数。用理论塔板数与板高表示柱效率时是等价的。网上找的。估计是计算题。色谱PPT
过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出。结晶PPT
介电常数：是一个化合物摩尔极化程度的量度，物质的介电常数ε可表示为ε=C/C0（C为物质在电容器中的静电容量值(F)；C0为无介质时，同一电容器中的静电容量值(F)）。根据溶质的介电常数选择极性相近的溶剂作为萃取剂，这是溶剂选择的重要方法之一。网上找的，在有机溶剂萃取里
分子筛层析法：又称凝胶过滤层析法，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。色谱PPT 07生技2班 生物分离工程 2010-7-4 溶解度参数：溶质对聚合物的溶胀能力可用溶解度参数δ或内聚能密度（cohesive energy density,CED)来表征。
CED=δ2=E/V（E—摩尔内能；V—摩尔体积）
分子结构越相似，就越接近；两个物质溶解度参数的数值接近时，有利于互相溶解。大孔树脂吸附PPT
阻滞因数：是在色谱系统中溶质的移动速度和一理想标准物质（通常是和固定相没有亲和力的流动相）的移动速度之比，即 R=溶质的移动速度 / 流动相在色谱系统中的移动速度
网上找的
分离因子：某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数，又称质量分布比。即 α=q / Ct（Ct为溶质总浓度，包括游离和被结合）。
网上找的
解离常数：有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值。即 Kp=m*C / q。通常应用解离常数Kp 来讨论分子间的相互作用。网上找的
膜组件：由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元，又称膜装置。P67
膨胀度：离子交换树脂含有大量亲水基团，与水接触即吸水膨胀。当树脂中的 离子变换时，如阳离子树脂由H+转为Na+、阴离子树脂由Cr转为OH，都因离子直径增大而发生膨胀，增大树脂的体积。通常，交联度低的树脂的膨胀度较大。在设计离子交换装置时，必须考虑树脂的膨胀度，以适应生产运行时树脂中的离子转换发生的树脂体积变化。（网上找的）
吸附层：指离子导体颗粒表面的密度较大的正离子层。离子导电体颗粒和溶液接触时，由于固体表面吸附力场的作用，岩石和土壤中的颗粒都吸附负离子，溶液中则出现过剩的正离子，表面则形成电偶层。靠近颗粒表面密度较大的—层就是吸附层。其厚度d=10-8米。吸附层外正离子密度逐渐减小的部分叫散漫层，其厚度因条件不同而变化。一般其厚度δ=10.7—10.6米。
亲和吸附:是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用,从而实现分离.网上找的
扩散层：在胶粒周围的一部分阳离子由吸附层表面分布至胶粒阴电荷不能吸引的最小距离所形成的非牢固结合层。网上找的
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏雨林木风 第 4 页 2013-3-28蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解07生技2班 生物分离工程 2010-7-4 聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；PPT
体积浓缩倍数：即料液体积与溶剂体积的比值。网上找的
比较微滤、超滤、反渗透的区别和共同点？网上找的
答：超滤(UF)和微滤(MF)都是利用膜的筛分性质,以压差为传质推动力。UF膜和MF膜具有明显的孔道结构，主要用于截留高分子溶质或固体微粒。UF膜的孔径较MF膜小，主要用于处理不含固形成的料液，其中相对分子质量较小的溶质和水分透过膜,而相对分子质量较大的溶质被截留。因此，超滤是根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法。
微滤过程中，膜两侧渗透压差较小，所以操作压力比反渗透操作低，一般为0.1～1.0MPa。微滤一般用于悬浮液（粒子粒径为0.1～10μ）的过滤,在生物分离中,广泛用于菌体细胞的分离和浓缩。微滤过程中膜两侧的渗透压差可忽略不计，由于膜孔径较大，操作压力比超滤更低，一般为0.05～０.5ＭＰa。
反渗透：溶质浓度越高，渗透压越大。如果欲使高浓度溶质一侧溶液B中的溶剂（水）渗透到纯水侧A，在B侧所施加的压力必须大于此渗透压，这种操作称为反渗透。
1. 离子交换树脂法
提取液
│
│通过强酸型（氢型）阳离子交换树脂
┌──────┴───────────┐
↓↓
流出液 树脂柱
（非碱性物质） ┌──────┴───────────┐
│方法一 │方法二
│氨液碱化树脂│碱液洗脱
│晾干后，亲脂性有机溶剂提取 │
↓↓
亲脂性总生物碱亲水性总生物碱
2. 有机溶剂萃取法
提取液
│
│碱化，亲脂性有机溶剂萃取
┌──────┴───────────┐
↓↓
有机溶剂层 碱水层
│
│浓缩
↓
总生物碱
·醇类溶剂提取液的净化
醇提取液
│
↓浓缩
浸膏
│
│酸水溶解
┌──────┴───────────┐
↓↓
不溶物 酸水液
（非碱性脂溶性杂质） │
│碱化，亲脂性有机溶剂萃取
┌───┴───┐
↓ ↓
有机溶剂层 水层
│
│浓缩
↓
摘要:【目的】探索药用植物内生环境可培养放线菌的分离、培养方法，总结药用植物内生放线菌的生物学特
性，探讨其物种多样性，挖掘新的微生物资源。【方法】采用 10 种分离培养基对 37 个新鲜的药用植物样品
进行内生放线菌的分离;通过比较，选择适合植物内生放线菌生长的培养条件;根据菌落形态和细胞特征观 察结果，选择其中 174 株菌测定 16S rRNA 基因序列，分析药用植物内生放线菌的多样性;应用 Biolog GEN III 微孔培养、API 50CH 以及 API ZYM 试剂条测试 27 株代表菌株的生理生 化特性。【结 果】分 离 得到 940 株植物内生菌，分属于 47 个属，30 个科，其中放线菌 600 余株，分属于 34 个属，共发现潜在的新分类单元有 个;本研究中药用植物内生放线菌的培养条件是:PYG 培养基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株间的生物学特性的
差异与菌株系统进化关系呈正相关关系;不同环境植物的内生菌菌株的生物学特性差异较大，相同环境的不
同植物内生菌的生物学特性差异较小。【结论】药用植物内生放线菌物种丰富多样;药用植物内生放线菌在 唯一碳源利用、发酵碳源产酸及酶学活性等生理生化特性方面没有表现出和宿主植物的直接相关性，而是呈
现出和宿主植物的地理分布有一定的相关性。
关键词:药用植物，内生放线菌，生物学特性，多样性
中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2013)01-0015-09 药用植物有着独特的药理活性，特别是在治疗
一些疑难病症上有着不可替代的作用。如茵陈主治
黄疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治结核、气喘等，还具有抗肿瘤的作用。药用植物的有效成
分的提取和研究一直是国内的热门课题。1993 年，美国蒙大拿州立大学的 Stierle 研究小组首次从短叶
紫杉(Taxus breviforlia)中分离得到一株能合成抗癌
物 质 紫 杉 醇 的 内 生 真 菌 新 种 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并证明内生菌具有合成
与宿主植物相同或相似的活性成分的功能。由此掀
起了对药用植物内生菌研究的热潮。《微生物学通
报》编辑部的郝荣乔于 2009 年初对 2008 年的 点评中报道“植物内生菌成为我国当前微生物研究
领域的热点” ［2］
。的确，药用植物内生菌的研究和 有效开发对药用植物资源、特别是濒危植物资源的
保护具有重要的意义。
本研究选取采集自北京、贵州、云南和西藏等地 的药用植物样品 37 份，经过表面消毒处理后，应用
放线菌分离培养技术从中分离放线菌菌株;根据菌
株的 16S rRNA 基因序列信息以及系统进化关系，探讨药用植物内生放线菌的物种多样性;通过生理
生化实验测定，揭示药用植物内生放线菌的生物学 杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)进行分析，构
建表型数值分类聚类图，分析实验菌株的生物学特 性。2 结果
2.1 菌种分离结果
从 37 份药用植物中共分离、纯化得到 940 株纯
培养物(表 1)。从云南、贵州和西藏来源的植物样
品中分离得到的放线菌的比例稍高于北京的植物样
品;来源于植物根、茎、叶的菌株数量基本相当，没有
明显差异;和其它 9 种分离培养基相比较，丙酸钠分
离培养基(M7)分离得到的放线菌数量占显著优势。
表 1 药用植物内生菌分离结果统计
Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19
通过菌落形态以及菌株细胞显微形态的初步观
察结果以及菌株来源，选择 174 株代表菌株进行
16S rRNA 基 因 序 列 测 定 和 比 对，结 果 显 示，174 株
分离菌株隶属于 30 个科、47 个属，其中的放线菌 139 株，分属于 34 个属(图 1)。以菌株的16S rRNA
基因序列与 NCBI 数据库中有效描述菌种相似性 ＜
98.2% 作 为 操 作 分 类 单 元(taxanomic operational
units，OTU)的划分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表
了 7 个新的操作分类单元。
2.2 药用植物内生菌的生物学特性
为了比较研究药用植物内生放线菌的生物学特
性，选择了 27 株分离菌株进行了生长温度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源产酸以及酶学特性测试，其
中包含了 2 株药用植物内生细菌。来源于韩国菌种
保藏中心的 3 个典型培养物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T
和 KCTC 19037 T
(分离自不同土壤环境)同时 做了平行对照实验(表 2)。起初，分离菌株在对应的原始分离培养基和继
代培养基 PYG 上生长良好，但是随着传代次数的增
加，部分内生菌生长变弱，甚至无法继续传代，而 3 株来源于土壤样品的对照菌的生长状态则几乎不受
传代次数的影响。内生菌菌株的温度生长范围是
10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生长 较 好;多 数 菌 株 在
pH 6.0 － 10 范围 内 都 能 生长，在 pH 中 性 至 弱 碱 性 条件下生长最佳。
本实验中 27 株植物内生菌对碳源的利用呈现
以下趋势:菌株对二糖和多糖类的利用率最高，接下
来依次是单糖，脂类，氨基酸及衍生物。27 株植物
内生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作为
唯一碳源和能量来源:亚碲酸钾，丁酸钠，甘露醇，纤
维二糖，葡萄糖，麦芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻
糖，蔗糖，水 杨 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分类学研究 时，用 来 源于 土壤 环境 的近源
菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作为参比进行
了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 产 酸 和 API ZYM 酶学特性测定和比较分析。植物内 生 菌 I10A-
01402 以及其 它 26 株 内 生 菌 都 能 够利用 Biolog 微
孔板中葡聚糖和 D-麦芽糖，但是，来源于土壤环境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T
和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T
等 3 株类诺
卡氏菌属的菌株都不能利用这两种糖;I10A-01402
不能利用 N-乙酰类化合物，其它 26 株内生菌也都
不能或很少利用此类化合物，而这 3 株土壤来源的
菌株则全部能利用 N-乙酰类化合物作为唯一碳源
和能量来源。27 株药用植物内生菌和 3 株土壤来
源的参比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并产酸的情
况以及酶学特性上也表现出较大的差异。本实验中 株药用植物内生细菌和 28 株 放线菌 相 比较，细菌
能够更多地利用 Biolog GenⅢ中列举的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中单个碳源并产酸实验的阳性 率也高一些，但在 API ZYM 酶学特性测试结果中没 有明显差异。
16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分
生理生化特性也趋于相近。例如，草药菌属菌株
(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 药 菌 属 菌 株
(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 药 菌 属 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 杆 菌 属 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 植物样品:玉竹、黄精、知母、蒙古黄芪、肥皂
草、藿香、薄荷、金银花、仙鹤草、樱桃、大叶玉竹、白
芷、紫苏、喷瓜、金银木(橘色果实)、红色果实金银
木、虎杖、薯蓣和穿龙薯蓣等 19 份植物样品采集自
北京(编号 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黄瑞香、藏茵陈和云南重楼等 6 份采自云南(P22 － P27)，贵 州重 楼 和 三 七 采 自 贵 州(P28，P29)，绵
头雪莲(P20)、包叶雪莲(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共计 37 份药用植物样 品。
1.1.2 培养基:(1)内生菌分离培养基: 使用了 10 种分离培养基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培养基是
本实验室在红树植物内生放线菌研究中使用的 8 种
内生放线菌分离培养基 ［3］，M9 和 M10 的组成如下: M9(g / L): 柠檬酸 0.12，柠檬 酸 铁 铵 0.12，硝
酸钠 1.5，磷 酸 氢 二 钾 0.4，硫 酸 镁 0.1g，碳 酸 钙
0.05，碳酸钠 0.2，琼脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝
酸钾 0.1，海洋微量盐 微量，复合维生素 微量，琼
脂 12，pH 7.2。
(2)菌种纯化和继代培养培养基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜碱 1.25，丙酮酸 钠 1.25，复合维生素 微量，琼脂 12，pH 7.2。
1.1.3 抑制剂:抑制真菌和革兰氏阴性细菌的抑制
剂的种类和剂量参见文献［3］。
1.1.4 菌 株: 参 比 菌 株 人 参 地 类 诺 卡 氏 菌
(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韩国类
诺卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐
碱类 诺 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T
来源于韩国典型培养物保藏中心(KCTC);其它实验菌均为本研究的分离菌株。
1.1.5 主要试剂:硫 代 硫 酸 钠、次 氯 酸 钠、碳 酸 钠、萘啶酮酸、制霉菌素、重铬酸钾等化学试剂均为国产
分析纯试剂;PCR 扩增相关试剂和引物测序均来源
于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基
础培养液购于美国 BIOLOG 中国代理，API 50CH 和
ZYM 试剂条及相关试剂购于生物梅里埃公司。
1.2 菌种分离和保藏 具体方法参见文献［3］。
1.3 菌种初步鉴定和多样性分析 菌种初步鉴定参照徐丽华等主编的《放线菌系 统学》 ［4］
相关方法操作。根据菌落和菌丝形态初步 观察排除重复菌株，选择代表 性菌 株测 定 其 16S
rRNA 基 因 序 列，并 将 结 果 提 交 EzTaxon 网 站
(http:/ /parative studies of nucleotide sequences． Journal of Molecular Evolution，1980，16: 111-120．
［8］ Kimura M． The Neutral Theory of Molecular Evolution．
Cambridge: Cambridge University Press，1983． ［9］ Saitou N，Nei M． The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees． Molecular Biology and Evolution，1987，4: 406-425． ［10］ Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S． MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0． Molecular Biology and Evolution，2007，24: 1596-1599．
［11］ Chen HH，Li WJ，Zhang YQ，Wang D，Tang SK． Study on isolation and systematic taxonomy of strains of genus Nesterenkonia． Acta Microbiologica Sinica，2004，44(6): 811-815．(in Chinese)陈华红，李文均，张玉琴，王栋，唐蜀昆． 涅斯捷连科 氏菌属 菌 株 的 分 离 及 系 统 学 研 究． 微 生 物 学 报． 2004，44(6): 811-815．
［12］ Keswani J，Whitman WB． Relationship of 16S rRNA
sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes．
International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology，2001，51(2): 667-678． ［13］ Stackebrandt E，Ebers J． Taxonomic parameters
revisited: tarnished gold standards． Microbiol Today，2006，33，152-155． ［14］ Indananda C，Matsumoto A，Inahashi Y，Takahashi Y，Duangmal K，Thamchaipenet A． Actinophytocola oryzae gen． nov．，sp． nov．，isolated from the roots of Thai
glutinous rice plants，a new member of the family
Pseudonocardiaceae． International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology，2010，60(5): 1141-1146． ［15］ Behrendt U，Schumann P，Hamada M，Suzuki KI，Sprer C，Ulrich A． Reclassification of Leifsonia ginsengi
(Qiu et al． 2007)as Herbiconiux ginsengi gen． nov．，comb． nov． and description of Herbiconiux solani sp．
nov．，an actinobacterium associated with the
phyllosphere of Solanum tuberosum L． International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61(3):1039-1047．
［16］ Tao TS，Yue YY，Chen WX，Chen WF． Proposal of Nakamurella gen． nov． as a substitute for the bacterial genus Microsphaera Yoshimi et al． 1996 and Nakamurellaceae fam． nov． as a substitute for the illegitimate bacterial family Microsphaeraceae Rainey et al． 1997． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54: 999-1000．
［17］ Cho KM，Hong SY，Lee SM，Kim YH，Kahng GG，Lim YP，Kim H，Yun HD． Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens．
Microbial Ecology，2007，54(2): 341-351． ［18］ Amann RI，Ludwig W，Scheidler KH． Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation． Microbiological Reviews，1995，59(1): 143-169．
［19］ Xu HS，Roberts N，Singleton FL，Singleton R，Attwell W，Grimes DJ，Colwell RR． Survival and viability of nonculturable Esherichia coli and Vibro cholerae in the estuarine and marine envoroment． Microbial Ecology，1982，8(4): 313-323．
杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation
conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells
of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal
plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog
GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30
families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth
of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．
Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences
were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．
［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the
endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of
carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．
学生通过对该课程的学习，能针对不同的产品的特性，运用所学的相关知识，设计合理的提取或精制的工艺路线，并能从理论上解释生产实际中的各种现象，提高学生分析和解决问题的能力。因此该课程的教学直接影响了学生的专业素质。
1. 生物分离技术主要内容和课程特点
生物分离技术课程内容主要包括原材料的预处理、萃取技术、吸附与离子交换、膜分离技术、浓缩与干燥技术、细胞的分离与破碎、结晶、干燥等。因本课程开设在大二下学期，所以有些内容对学生来说是初次涉及，如细胞的分离与破碎、结晶、干燥;而有些内容被涵盖在其他课程之中，如液相色谱和亲和色谱在仪器分析中已有讲解，吸附技术在发酵原理也有重要讲述。
生物分离技术不同于传统的化工分离过程，近年来在国内外大受重视，发展非常迅速，许多适合生物活性物质的新型分离纯化技术也不断产生，被广泛地应用到工业、农业、医药等各个领域[1,2]。它所涉及的相关课程和知识较多，包含的基础理论、基本知识较散，各知识点间相互联系不是很紧密，内容相对比较抽象。若单纯地讲授理论知识，则学生很难理解。
2. 明确课程定位，改革教学内容
生物分离技术是在生物化学、发酵技术基础、微生物学、化工原理等学科的基础上发展而来，是生物工程专业的必修课程。鉴于生物分离技术在现代生物技术产业领域的重要作用，首先明确该课程在专业培养计划中的定位和核心任务：培养学生理论联系实际，提高学生将分离技术的基本原理与基础理论应用于生物产业下游领域的能力。在教学计划中，将其作为专业必修课安排在第4学期进行讲授。此时，学生已修完了生物化学、发酵技术基础、微生物学等相关课程，为本课程的学习奠定了扎实的基础知识。
围绕各专业核心能力和岗位需求，将内容进行统筹整合，形成单元模块，使技术理论和实践有机结合，缩短了理论与应用实践之间的距离，有效实现学以致用的培养目标。本课程在教材内容上，将整本书的内容整合为三个项目，每一项目包含几种分离技术知识，并在具体讲解之后用具体案例让学生自己动手实践。例如，项目一：质粒DNA的分离纯化，以质粒DNA的分离提取为背景，将分离提取过程中涉及的分离技术，如生物材料的预处理、固液分离技术、细胞破碎技术、沉淀技术、干燥技术融入到这个项目中去讲解(见图1)。在学生掌握了理论知识后再让其动手实践，这样既加深了学生对知识的理解，又培养了他们动手实践的能力。
3. 改革教学手段，拓展学生知识结构
就生物技术专业的学生而言，生化分离技术这门课程涵盖了大量基础理论，传统以教材为主的板书教学方式，效率较低，易使学生产生疲劳，不利于调动学生课堂学习的积极性。在讲授大纲基本知识点的同时，加大授课容量以开阔学生视野。为增加教学信息量，丰富信息资源，我们除了采用多媒体技术进行辅助教学外，还借助于网络技术的高速发展和普及，合理运用因特网等现代信息技术进行视频教学，在讲授各种分离技术原理的同时，补充相应的仪器、设备图片等，使互联网成为拓展学生知识面的一个有效平台[3]。
4. 强化实践教学，培养学生动手能力
生物分离课程是一门实践性很强的学科，有些内容较为枯燥，因此如何调动学生的积极性，使学生始终保持很高的学习热情也至关重要。开设实验课程的目的之一是如何在实训环节充分锻炼学生的动手能力和创新能力，这同时也是该课程的最终教学目标。目的之二是可以使学生较好掌握相应的实验技能，为以后进入相关的工作岗位打下坚实基础。在实验课上，要让每个学生尽可能多动手，这样才能达到较熟练的程度。具体改革方法：一是强调预习。采取分组轮流让学生参与实验准备工作，使他们在实验前考虑到需要什么，怎样准备，这对学生以后从事科学研究和教学等工作很有帮助;二是加强实验过程中的指导，启发学生思考、分析并加以解决，以培养学生的探究创新意识。摒弃之前的老师做学生看的做法，突出以学生做主，教师指导为辅。充分体现学生的主体作用，使学生能积极主动地走进实验课堂;三是规范示范操作，提高学生实验技能。良好的科学作风和熟练而又规范的操作，是一个实验成功的关键。在实验过程课程组老师注重对学生基本技能的培养，使学生养成正规的操作习惯，有效提高了实验课的教学质量;四是注重实验过程与结果分析。实验结束后，教师带领学生针对实验结果进行深入分析，以小组为单位进行讨论，使学生每做一次实验都有提高，有利于培养学生分析问题和解决问题的能力。实验完成后布置相关的思考题，要求学生在实验报告中除了对实验数据进行处理和实验过程与结果描述外，特别注重实验过程与结果的分析、对思考题的回答，以及对相关理论知识的学习体会[4,5]。
5. 改革考核方式，建立多样化考核模式
成绩考核是教学过程中的一个重要环节，是促进学生学习和教师评定学生成绩、进行教学评价，取得教学反馈信息的主要方法。可采用多样式的评价体系来对学生进行考核，提高平时成绩所占比重，从而综合体现学生对知识的掌握，达到能力培养的目的[6,7]。最终考核成绩由平时成绩、实验成绩和期末考试共同组成，即包括课堂小测验成绩、平时作业成绩、实验报告成绩和期末卷面成绩。课堂小测验占10%，主要针对近期所学的重点内容，在课堂上布置一些小题目，以检测学生对近期讲课内容的理解程度;平时作业占20%，主要设置一些思考性较强的问题，考查学生对当堂课内容的掌握程度;实验成绩30%，以实验的结果、实验中的表现，以及实验报告册的完成为评定标准，培养学生动手能力、分析问题与解决问题的能力。期末考试占40%，主要考查学生对该门课程知识框架的掌握与理解程度。
6. 教学体会
6.1 培养和激发学生的学习兴趣
初上这门课程时，由于教学经验不足，注重详细地讲解教材内容，教材中的内容绝不遗漏，但发现满堂灌的教学，学生学习被动，上课易疲劳，课堂教学效果差。通过几轮教学，总结经验后发现培养学生对课程的学习兴趣，是学生能否学好这门课程的关键。因此在该课程的绪论中首先说明生物分离技术在生物技术中的重要地位，讲述国内外生物分离技术的差别，目前我国生物分离技术的现状，以及我国目前生物分离技术所面临的巨大商机等，并列举生活中的实例说明。这样学生很快认识到这门课程并非空泛的理论，而是一门实践性及实验性很强的课程[8]。
6.2 采用灵活多样的教学方式
在有效的上课时间内，要让学生理解所学的基础理论和分离技术并非易事。在教授的过程中，要尽量采用启发式教学，师生互动，使学生和教师的思维同步，要在设问、思考、学生回答以及教师解答和进一步讲述中完成讲解。这样就可针对学生的难点疑问进行重点讲解，还能够活跃课堂气氛，提高学生的学习兴趣。总之，教师要走出只从书本上单纯的以自我为中心的讲解，要与学生进行互动，以增强教学效果[5]。
6.3 加强与培养学生的自学能力
在当今的信息社会里，由于知识的快速更新，因此培养学生自学能力至关重要。在大学阶段，学生主要是学会学习方法，获得知识的途径，这就要求学生能利用各种有效的方式和途径去获取知识，查阅文献就是其中很重要的一点。当今时代是信息高速发展的网络时代，同时也带动了学校图书馆的发展，现在不仅可以到图书馆去索寻书籍、期刊，而且在图书馆网站上还购买了许多数据库，如中国知网、万方数据库、中国期刊网、中国硕博士论文库等。学生可以借助强大的网络去寻找各种资料，查阅前沿知识，以开阔学生的视野[7]。
7. 结语
本课程通过合理安排教学内容、精心选择教材、多媒体技术应用，多层次实训教学等环节的积极探索，丰富了教学手段，优化了教学质量，锻炼了学生分析问题、解决问题的能力，教学实践中取得了良好的效果。同时，我们也不断总结经验，改革创新，利用各种途径调动学生的学习积极性，选择更合适的方法和手段，为其将来从事相关专业打下良好的基础。
参考文献
[1]邹玉红, 吕英海, 李桂江, 等.生物工程专业产学研一体化实践基地的构建[J].陕西教育, 2009 (7) :7-15.
[2]曹学君, 赵延斌, 童望字, 等.生物分离工程精品课程建设推动教学质量跃上新台阶.化工高等教育, 2006, 88 (2) :32-34.
[3]赵世光, 杨超英, 薛正莲, 等.生化分离技术课程教学改革的探索与实践[J].安徽农学通报, 2009, 15 (23) , 181-182.
[4]任平国, 徐启红.《生物分离纯化技术》课程教学改革与实践[J].科技博览, 2009, 20-22.
[5]丁新丽.生物分离与纯化技术课程的实践教学改革初探[J].安徽农业科学, 2012, 40 (8) :5061-5062.
[6]周红梅, 张茂润.教学方法及手段的改进对培养学生工程设计能力影响的探讨[J].淮南师范学院学报, 2006, 8 (3) :107-108.
[7]刘爱玲, 粟挺.生物分离工程课程的教学改革与体会[J].现代农业科学, 2010, 17:29-30.
【关键词】改进 纤维素 微生物 纤维素酶
【中图分类号】G633.91 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）06-0157-01
1.前言
“分解纤维素的微生物的分离”是人教版高中生物选修教材《生物技术实践》中的一个课题，开展这一课题的主要目的是使学生掌握从土壤中筛选纤维素分解菌的技术，培养学生的动手能力，组织好这一课题的教学能激发学生学习生物学的兴趣和积极性，提高学生进行科学研究的素养。
鉴于此，本文从教学实际出发，对实验 “分解纤维素的微生物的分离”进行了改进，使实验的操作更加简单快捷，从而能更有效的开展教学，对教学具有积极的指导意义。
2.材料与方法
2.1材料
刚果红染液（1mg/mL）；NaCl溶液（1mol/L）；培养基 ：羧甲基纤维素钠（CMC—Na）5g，NaNO3 1g，Na2HPO4.7H2O 1.2g，KH2PO4 0.9g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g ，酵母膏0.5g，水解酪素0.5g ，琼脂20g，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL，PH6.6—6.9。超净工作台、摇床、高压灭菌锅、培养箱、微波炉、电子天平、100mL和250mL锥形瓶、称量瓶、药匙、培养皿、涂布器、EP管、1000uL微量可调仪及配套枪头，将试验用玻璃器皿、配置好的培养基在高压蒸汽灭菌锅内，于121℃灭菌30min。
2.2方法
采集土样1份（采集时去除表层5-8cm后再取样，以免其他杂菌影响实验结果）。称取采集到的土样5克，在超净工作台上放入含有45mL无菌水的锥形瓶（锥形瓶中加入6～8粒玻璃珠）中，进行震荡（5～10min），使土样充分打散。震荡后静置10～20min，取上清液2mL进行离心（转速1000rpm/min，时间1min）。离心后量取上清液0.1mL进行稀释，分别量取稀释率为10-3，1/10-4、1/10-5 和1/10-6的培养液0.1mL接种于培养基中（每一浓度做三组同等对照并做好标记），放入温箱，于30℃培养24h。
3.结果
涂抹平板放入温箱，于30℃培养24h后，各稀释率平板上的单菌落数及染色后透明圈数统计结果（每一稀释率的结果取3个平板的平均值）见下表：
4.分析与讨论
在人教版高中生物选修教材《生物技术实践》中为了完成实验“分解纤维素的微生物的分离”使用两种培养基配方：纤维素分解菌的选择培养基配方：纤维素粉 5g，NaNO3 1g，Na2HPO4.7H2O 1.2g，KH2PO4 0.9g，MgSO4.7H2O0.5g，KCl 0.5g ，酵母膏0.5g，水解酪素0.5g ，将上述物质溶解后，蒸馏水定容到1000mL。鉴别纤维素分解菌的培养基配方：羧甲基纤维素钠（CMC—Na）5-10g，酵母膏1g，KH2PO4 0.25g，琼脂 15g ，土豆汁100mL，将上述物质溶解后，蒸馏水定容到1000mL。
其中纤维素分解菌的选择培养基是液体培养基，主要用于选择培养，对土壤中的纤维素分解菌进行富集；鉴别纤维素分解菌的培养基是固体培养基，主要作用是形成单菌落，以便于用刚果红染色后能观察到透明圈。
在进行教学时我们发现以下问题：（1）配置鉴别纤维素分解菌的培养基时，100mL土豆汁不好控制；（2）在纤维素分解菌的选择培养基配方中加入琼脂形成固体培养基，用于培养纤维素分解菌的培养也能形成单菌落，用刚果红染色后透明圈很清晰；（3）纤维素粉难容，实验最后在观察透明圈时影响观察效果；（4）在45min的课堂上学生完成两份培养基的配置及相关内容的教学，时间非常紧张。
我们认为可以对培养基进行如下改进：羧甲基纤维素钠较容易溶解，可以替代纤维素，解决纤维素难容，影响透明圈观察的问题；在选择培养基中加入一定量的琼脂形成固体培养基作为鉴别培养基。这样，在配置培养基时只需要配置一份选择培养基，然后分出一定量加入琼脂即形成鉴别培养基，从而减少了实验的操作环节，缩短了实验的进度，提高了实验的可操作性，更有效地开展实验教学。同时也解决了土豆汁不好操作的问题。
参考文献：
[1]王倩.纤维素酶高产菌株选育与玉米秸秆生产酒精工艺研究河北农业大学硕士学位论文.2003.5
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