色谱方法学验证

色谱方法学验证（精选7篇）

色谱方法学验证 篇1

所谓方法验证(validation，又叫认证)就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性一般指所用仪器配置是否全部可作为商品购得(实验室自己制造的仪器部件就欠实用)，样品处理方法是否简单易操作，分析时间是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性则包括定量的线性范围、检测限、方法回收率、重复性、重现性和准确度等。下面就简单讨论这几个可靠性参数。

1．方法的线性范围

即检测器响应值与样品量(浓度)成正比的线性范围，它主要由检测器的特性所决定。原则上。这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。线性范围的确定通常是采用一系列(多于3个)不同浓度的样品进行分析，以峰面积(或峰高)对浓度进行线性回归。当相关系数大于0．99时，就可认为足线性的，小于0．99时，就超出了线性范围。一个好的GC定量方法，其线性范围(以FID检测器为例)可达10；，线性相关系数等于或大于0．9999。

2．方法的检测限

检测限(DL)是指方法可检测到的最小样品量(浓度)。一般的原则是按照3倍信噪比计算，即气样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度就被作为最小检测限，与此对应的该组分的进样量就叫做最小检测量-此外。忆验证定量方法时，还将10倍信噪比所对应的样品浓度叫做最小定量限，当用于法规分析时，这一数据应等于或低于法规方法所要求的实际样品中待测组分的最低允许浓度。

检测限的测定可用一个接近检测限浓度的样品进行分析，据所得色谱峰的峰高来计算。设此时浓度为c、相应的峰高为h(信号强度单位)、基线噪声为N(与h的单位相同)，则检测限可按下面公式计算：

c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h 噪声的大小与仪器的性能，特别是检测器及其电子电路的稳定性直接相关，也与载气的纯度、色谱柱的性能及操作条件有关。噪声的测定是在正常操作条件下，仪器稳定时，将信号放大(降低衰减或放大纵坐标)来测量，一般是测定样品出峰前后1min的基线噪声。

作为分析方法，检测限无疑是越低越好。为此，应选择灵敏度高的检测器，使用高纯度的载气和辅助气，同时要定期维护仪器，保持进样口和检测器的清洁，保持色谱柱的性能。此外，仔细优化分离条件、适当加大进样量(如采用大体积进样技术)也是降低检测限的常用方法。

3．方法回收率

即方法测得的样品组分浓度与原来样品中实有浓度的比率。如果样品未经任何预处理，则回收率一般可不考虑。只有当某些样品组分被仪器系统不可逆吸附时，回收率才是需要考虑的问题。如果样品经过了预处理，如萃取工艺，那就必须考虑整个方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。

回收率可用下述简单方法测定：配置一定浓度的标准样品，将其两等分，其中一份按方法步骤进行预处理，然后用GC分析。另一份则不经颈处理而直接用GC分析。两份样品所得待测组分峰面积的比率乘以100即是该组分的回收率。有时实际样品很复杂，特别是样品基质对预处理的回收率影响较大时，就必须用空白样品基质(确信不含待测物)制备标准样品，比如测定废水中有机农药残留量时，就要采用不含农药的水作空白基质，在其中加入已知量的农药标准品，然后进行处理和分析。处理后测得的组分含量与处理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很显然，回收率太低时会影响方法的检测限。当样品处理过程较复杂时，应分步测定回收率，最后针对回收率最低的步骤进行方法改进，以期提高整个方法的回收率。

4．方法重复性和重现性

重现性(reproducibility)足指同一方法在不同时间、地点、不同型号仪器、不同操作人员使用寸所得结果的一致性。与此近似的另一个术语是重复性(repeatability)，常指同一个人在同一台仪器上重复进样所得结果的一致性。事实上，文献中二者常常混用，多数人不做严格区分。但大多数欧洲学者会严格区分二者的不同。我们认为对现代仪器来说，分析重复性是容易实现的，而重现性则是更重要的，也是方法验证所必须考察的。重现性和重复性都用多次分析所得结果的相对标准偏差(RSD)来表示。

方法的重现性应包括多次连续进样分析的重复性、不同时间(天与天之间)分析的重复性、不同型号仪器之间的重现性和不同实验室之间的重现性。作为方法开发人员，首先应测定重复性，即在相同条件下连续进样5—10次，统汁待测组分的保留时间和峰面积(或峰高)的RSD，一般要求保留时间的RSD不大于1％，峰面积的RSD不大于5%。文献报道的最佳重复性数据为保留时间的RSD小于0.1%，峰面积的RSD小于1%。

如果样品要经过预处理，还应测定同一样品多次处理的重复性。即同一样品取3—5份做平行处理，看最后测定结果的重复性。这一RSD值应不大于5％。当然，有些工业分析要求不大于10％即可。至于天与天之间的重现性也不应大于10%、当上述重复性满足要求后，说明该方法在你的实验室是可靠的。要将此方法作为标准方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同实验室之间的重现性。当这些重现性(RSD)都能满足要求时。这一方法的可靠性就得到了较为满意的验证。

方法的线性关系及检测限

准确称取 7种目标物的标准品, 用甲醇稀释配制成 7种目标物的标准溶液, 根据需要用甲醇分别稀释配制成 5级标准工作溶液, 浓度范围如表 3所示,在选定的色谱条件下,分别进样分析。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标作回归方程,结果见表 3 , 回归方程的相关系数 R2均大于 0.9999,线性关系良好。以最低浓度标样重复进样 5次, 取其 3倍标准偏差为检测限, 10倍标准偏差为定量限, 根据样品处理过程将结果换算为ug /g , 得到该方法的检测限和定量限

方法的回收率和重复性

采用标准加入法测定方法的回收率。取一种已知目标物含量的样品(7 #),加入与其含量相当的混合标

准溶液,重复 5次,测定其加标回收率和重复性, 结果如表 5所示。5次重复实验的 RSD范围为 1.3 % ~3.1 %, 回收率范围为 97.0 % ~ 99.6 %, 可以满足定量需要。

——引自《RP-HPLC法测定烟用香精香料中的7种防腐剂》

内标法方法学注意事项（引自网页论坛）

选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。

内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

那么内标法的方法学研究就是将过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值，也就是一个比值，来进行一些精密度、准确度、线性之类的研究。

具体就是配制不同浓度的标准溶液，记录样品和内标峰面积，计算样品/内标峰面积比值R样品/内标，利用样品浓度C对比值R样品/内标作直线回归，得回归方程，作为标准曲线。精密度、准确度也如此。

首先你要了解何为内标法

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。化学方面的因素包括：

1、内标物在样品里混合不好；

2、内标物和样品组分之间发生反应，3、内标物纯度可变等。

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

所以，当你确定应用内标法之后，就不需要进行这些实验的。因为你在加内标时它就是一个已知浓度了。做方法学的时候，内标和待测物标准品(比如你的白三烯待测物）要分别单独进样，然后再做标液的色谱图（含有内标和样品），然后再是提取或者回收后的样品（如血浆或者一些细胞，组织提取物等等），最后比较两者的封面积。

色谱方法学验证 篇2

随着IC(Integrated Circuit) 设计规模不断增加,芯片功能验证的复杂度加大和验证周期延长,如何提高验证效率、缩短验证周期和加快芯片研发速度是目前芯片验证亟待解决的问题[1,2]。

验证方法学的发展提高了验证的效率,同时促进验证的完备性成为可能[2]。目前市面上基于System Veriog语言的验证方法学主要有VMM(verification Methodology Manual)、UVMOVM(Open Verification Methodology)。UVM代表着验证技术的最新进展,使用它能创建坚实、可重用、具互操作性的验证IP和测试流程(testbench)组件[3]。

本文在结合工作经验的基础上,将FFTbuffer模块作为验证对象,使用System Verilog语言并结合UVM验证方法学构建了完整的验证平台,完成了模块验证需求,提高了验证效率和平台的可重用性。

1 UVM验证方法及验证对象

1.1 UVM验证方法概述

在集成电路(Integrated circuit) 设计人员使用verilog语言将集成电路特性翻译成RTL(register-transfer level)代码后,验证人员使用验证平台验证RTL代码并寻找其中存在的错误[4,5]。需要被验证的RTL在本文中均称之为DUT。UVM通过树形结构来管理平台的各个部分。UVM中所有的节点都是由一系列通用验证部件(Universal Verification Component)组成的[6,7,8],这些通用验证部件不仅具有可配置性、封装成型、可重用等优点而且具有phase自动执行特性(将component分割成几个不同的执行阶段并且按照一定的先后顺序来执行)。phase的引入,在很大程度上避免了由代码书写不规范引发的问题。UVM节点间的通信采用事务级建模(Transaction Level Modeling) 的方式,把某一特定功能的一组信息封装在一起之后,各个节点间再进行传输通信。

图1 为一个典型的UVM验证平台[7],agent对应的是物理接口协议,接口协议规定了数据的交换格式和方式,它通过monitor和driver来实现这些接口协议。通常验证平台中包含了多个agent,如i_agent中封装了monitor和driver, 用于向DUT发送数据, 而o_agent中只有monitor,用于监测DUT的输出数据。env就像一个大的容器,把所有的component都包含在内并作为其内部的一个成员变量。reference-model(参考模型)通常是模拟DUT的行为。scoreboard接受来自reference-model的数据和DUT输出数据并将二者的数据进行对比。

图1 中,实线连线表示验证平台和DUT的物理接口,虚线连线表示验证平台中不同component之间的数据连接。

1.2 验证对象概述

FFTbuffer模块用于缓存FFT的输入数据, 其接口上有三套总线,一套用于ZSP总线访问FFTbuffer,一套用于FFT模块直接将数据写入buffer,一套用于SD模块直接读取buffer中的数据用以信号检测。在访问时,FFT具有最高优先级,SD次之,ZSP优先级最低。图2是FFTbuffer模块的结构功能图,其主要由4 个模块组成,分别为fftbuff_zdec、fftbuf_fdec、fftbuf_switch、以及memory(mem0~17) 模块。fftbuff_zdec模块实现ZSP总线访问buffer中不同的物理存储块时的地址译码功能,fftbuf_sdec模块实现SD读buffer中不同的物理存储块时地址译码功能,fftbuf_fdec模块实现FFT写buffer中的不同物理存储块的地址译码功能。fftbuf_switch模块包括18 个选择模块。fftbuf_switch0~17 对应18 块memory的访问总线选择。

2 模块级验证方案与平台

2.1 模块验证方案

由于FFTbuffer模块最主要的功能是进行数据缓存,因此我们对模块的功能点进行了提取,包括了5 个功能点:1)总线对memory( 存储器) 读写操作是否正确;2)三套总线对一片memory同时发起申请操作时,模块选择操作总线的优先顺序;3)memory存储数据的大小;4)模块对超出memory地址范围内的操作处理方式;5)中断信号是否正确触发并持续固定的时钟周期。

为了实现对上述功能点的验证,我们提出如图3 的验证方案,首先是通过随机约束对项目中的变量进行约束,产生的随机数据通过driver( 总线数据驱动器) 驱动到DUT相应的驱动部件上,DUT对数据进行处理,并在DUT处理数据前后通过Monitor对数据采样分别传输给reference_model( 参考模型) 和scoreboard( 计分板)。Scoreboard对最终的数据进行自动对比。

2.2 基于UVM的模块验证平台

图4 为基于FFTbuffer的UVM验证平台。整个验证平台由外部环境(脚本文件)和内部环境(UVM环境)共同组成。脚本文件控制着整个平台的编译指令、仿真运行指令、RTL代码路径、功能覆盖收集指令和随机种子等。

顶层virtual sequence在整个平台中起着统一调度的作用,一方面通过控制TOP_pkt产生的控制信息来控制test_sequence的数据操作流,另一方面则通过控制外部环境变量PRE_COV(由脚本文件定义的变量)来控制平台是否将产生的激励驱动到DUT。当PRE_COV=OFF时,平台产生的激励将不驱动到DUT,只对覆盖率进行收集;当PRE_COV=ON时则产生的激励将由底层driver驱动到DUT上。test_sequence则控制着验证平台的关闭和底层test_packet( 定义总线相关数据变量) 数据的产生,用户编写的测试例可以通过调用对应的sequencer来产生期望的激励。

virtual_sequencer对平台中所有底层的sequencer进行统一管理,并且通过申明analysis port(广播端口)为virtual_sequence产生的广播控制信息提供通道。

由于平台中包含三套总线和一系列检测信号,同时为了提高验证平台的可重用性,平台例化了六个agent,包括CLK_agent(产生所有的时钟信号)、RST_agent(产生所有的复位信号)、IRQ_agent(产生监控中断信号)、FFT_agent(控制FFT总线相关的写操作)、SD_agent( 控制SD总线相关的读操作)、ZSP_agent(控制ZSP总线相关的读写操作)。每一个agent下封装了driver、sequencer和monitor, 定义了对应的总线接口(interface) 与DUT进行连接,并且提供两种匹配模式UVM_ACTIVE和UVM_PASSIVE( 只例化了monitor,对总线的行为进行监测)。reference_model接收来自TOP_pkt的控制信息并对monitor传输过来的数据做模拟DUT的行为。而scoreboard接受zsp_monitor、fft_monitor以及sd_monitor传过来的结果并将其与reference_model传过来的结果做数据对比,同时scoreboard接收virtual_sequencer传过来的结果并将其作为收集coverage的数据。基于断言(一种基于System Verilog的描述性语言,能够描述时序相关的状况)的时序检查,其SVA_checker用于检查中断信号的时序变化。

3 验证结果及其分析

为了验证FFTbuffer模块功能的正确性,搭建了完整的基于System Verilog语言的UVM验证平台,并通过VCS仿真软件进行了仿真。图5 给出了三套总线同时访问同一片memory的场景时序,通过对memory数据检查对比,最终写入memory的数据与fft总线写入的数据一致,由此表明FFT总线的优先级最高。通过对任意两套总线的冲突访问场景进行了仿真,最终得到三套总线优先级验证结果为:FFT>SD>ZSP。

图6 给出了基于断言的中断时序检查结果图。在整个优先级验证场景中,当不同的总线同时对同一片memory发起了操作申请,模块会优先选择优先级最高的总线进行操作并且发出中断信号,并且持续4 个zsp时钟周期。其结果表明每一次中断的触发都会使中断信号持续4 个时钟周期。

图7 给出了断言检测的统计结果,其结果表明成功断言次数为2 881 713 次,断言失败的次数为零。由此表明模块的中断信号能够正确触发。

图8 显示了整个平台的功能覆盖和RTL统计覆盖率百分比,总的覆盖达到99.99%,其中只有条件覆盖(COND)未达到100%,其原因是RTL中存在一个互斥的条件,故所有的条件不会同时满足。由此,本平台对FFTbuffer模块的验证能够满足实践项目中模块级的验证需求。

4 验证结论

由于覆盖率收集一般在几个小时之内完成,而数据驱动则长达几天甚至更长时间,因此本文首次提出采用覆盖率收集和数据驱动分离的方法,即先通过改变随机种子,产生大量随机数据并进行覆盖率收集。若全部覆盖率收集符合验证要求则开始将之前产生的数据逐一驱动到DUT,与一般工程上采用的产生一包数据即刻驱动给DUT的方法相比,该方法更能提高验证的效率,缩短验证周期。

其次,本文在验证平台将时钟信号、复位信号、中断信号、zsp总线、fft总线和sd总线进行分离构造出多个独立的agent,这样在对下一个项目进行验证的时候,每一个独立的子agent都可以被其他环境进行例化重用。而一般工程中上将所有信号集中在一个总的agent中,一旦项目中模块稍有变化便不能进行复用。因而,将信号进行分离的方法使得验证的环境变得更加灵活,同时极大的提高验证环境的重用性。

5 结束语

色谱方法学验证 篇3

【关键词】高效液相色谱法 检测 头孢替唑 残留

【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0231-02

人们的生活水平越来越高，对自身的健康也越来越关注，为了提高自身的免疫力，人们必须做好疾病预防工作，相关医护人员也要提高治疗的水平，合理使用抗生素，帮助患者尽快恢复健康。头孢是临床治疗中常用的一类抗生素，其药效比较显著，可以有效防止细菌滋生。根据调查显示，头孢这类抗生素在药品市场有着较高的销量，人们对这类药品的安全性也比较关注，所以，药品检测人员一定要发挥自身职能，采用有效的技术对头孢替唑残留进行验证。本文分析了应用高效液相色谱法检测头孢替唑残留技术验证的效果，以供参考。

一背景概述

1、头孢替唑概述

头孢替唑最早是由日本研发出来的，属于半合成的头孢菌素药物，研究人员采用注射的方式对头孢菌素进行提取，制成具有较高药效的抗生素药物，在临床治疗中发挥着重要的作用。头孢替唑在药品市场中比较常见，如果头孢的替唑制备工艺不高，会影响头孢替唑的质量，会增加头孢替唑中的杂质，而且会引起患者的过敏反应，为了保证药品的安全，必须对头孢替唑残留进行技术验证。头孢替唑的药用价值很高，可以抑制细菌的生长，主要是通过抑制细菌细胞壁的合成达到杀灭病菌的效果。头孢替唑这类抗生素有着广泛的应用范围，而且有着较长的应用时间，有一定临床经验。头孢替唑对革兰阴性菌有着较好的治疗效果，服用头孢替唑后，可以治疗由细菌感染引起的呼吸道炎症，头孢替唑这一药物对革兰阴性菌以及格兰阳性菌均有着较好的疗效，在临床中应用也比较多，而且不会引起患者的不良反应。

2、高效液相色谱法检测头孢替唑残留的方法

头孢替唑是一种有效的抗生素，其具有耐酶、低毒等特性，是一种高效的药物，在临床治疗中，头孢替唑发挥着重要的作用，而且服用头孢替唑副作用比较小。现代社会，人们对药品的安全越来越关注，相关药品检测部门对药品安全检测也越来越重视，检测人员会经常运用到高效液相色谱法对头孢替唑残留进行技术验证，为了提高这类药物的要求，相关研究人员也在不断的改进技术，将头孢替唑的药效发挥到极致，并整理出有效的治疗方案。头孢替唑的副作用比较小，而且有着较为显著的治疗效果，尤其是对革兰阴性菌以及格兰阳性菌，有着极强的灭菌效果。头孢替唑残留对头孢替唑的药效有着较大的影响，质量检测人员一定要合理应用高效液相色谱法对头孢替唑残留进行准确的检测，这样才能保证药品的质量，才能保证药品使用的安全性。

二头孢替唑残留的技术验证准确以及具体流程

高效液相色谱法由于也良好的适应性，所以，该检测方法也成为了药品检测中一种极为常见的方式，同时，该检测方式对于头孢替唑残留物质的检测也是一种极为常见的手段，该检测方式在头孢替唑残留物质检测的过程中，其检测的精确性直接影响到了药物的检测结果，同时也对于药物的正常应用带来了直接的影响。在利用高效液相色谱法进行检测的过程中，主要是利用药物流动期间其相自身所携带的各种不同混合物质，流入或者经过固定相，并且在这一过程中和固定相产生一定的相互作用，并且利用这一作用方式，便能够达到影响混合物发生解体和变化的目的。依据这方面的反应、变化情况进行深入研究和总结之后，能够切实有效的提取出在残留物志之中所存在的其他成分。并且要针对这一环节提出成分进行深入分析、研究之后，才能够对于其中的工作核心、要点进行总结。当前，实验执行中所采取的措施、手段如下：

1、实验材料

1.1仪器

实验仪器挑选期间，高效液相色谱仪是其中的关键所在，同时也是的基础设备。其在应用的过程中多是采用Aglent1100型高效液相色谱仪。天平通常都是选择CP225D型，并且在工作之初准备好相关的容量瓶和移液管，避免在试验的过程中，出现试验中断的情况，既有可能会导致试验中断，或者直接影响试验的具体结果精确度带来较大的影响，因此，仪器准备的过程中应当列出一份清单，照单准备。

1.2试剂

在针对试剂进行选择、准备期间，其准备的试剂应当要有乙腈、枸橼酸、相应纯水。

2、色谱条件

2.1色谱柱

SGEEXSILODS5μ150x4.6mmSN：E09-034

2.2流动相

枸橼酸溶液（取枸橼酸3g，加水溶解并稀释成900ml）-乙腈（90：10）为流动相流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μl。

3、操作步骤及计算

3.1储备液的制备

精密称取头孢替唑对照品25.47mg置25ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

3.2定性、定量重复性试验

3.2.1高浓度对照品溶液制备

精密量取储备液1.2ml，置100ml量瓶中加水定量稀释至刻度，摇匀。2中浓度对照品溶液制备：精密量取储备液1.0ml，置100ml量瓶中加水定量稀釋至刻度，摇匀。

3.2.2低浓度对照品溶液制备

精密量取储备液0.8ml，置100ml量瓶中加水定量稀释至刻度，摇匀。

3.2.3测定法

分别摄取高浓度、中浓度、低浓度对照品来注入到液相色谱之中，次数为3次、6次、3次，过程中要对于色谱图进行记录。数据如表1所示。

4、线性方程及相关系数

4.1待测溶液的制备

精密量取储备液0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml，分别置100ml量瓶中，加水定量稀释至刻度，摇匀。

4.2测定法

分别取上述已知浓度的待测溶液，注入色谱仪，记录色谱图。数据如下：

其浓度分别为（mg/ml）：0.005502-0.007335-0.009169-0.01100-0.01284其峰面积分别为：175.92-247.41-307.87-369.43-430.60

其线性方程为：Y=3.442×104X-9.3946相关系数为：r=0.9995

范围：在0.005502mg/ml～0.01284mg/ml有良好的线性关系。

4.3检测限

当高效液相色谱仪之中所存在的基线基本稳定之后，便可以在其中注入适量的空白溶液，并且至少记录色谱图20分钟，这期间所检测噪音为2.3。根据线性方程，将量取储备液0.6ml置100ml量瓶的待测液再次稀释，精密量取1.0ml该溶液置于100ml量瓶中，加水定量稀释至刻度，摇匀。该溶液浓度为5.502×10-8g/ml。注入液相色谱仪20μl，记录色谱图，计算信噪比为5.0>3，符合规定，确定其检测限为5.50210-8g/ml。

三结语

通过本文的分析可以看出，采用高效液相色谱法检测头孢替唑残留有着良好的效果，其检验的准确性比较高，所以检测结果有着较高的可信度。头孢替唑是一种高效的抗生素，这类药物对革兰阴性菌以及阳性菌有着较好的灭菌效果，可以抑制这类细菌细胞壁的合成，有效的杀灭病菌。人们对自身的健康越来越关注，对头孢这类抗生素的安全性越来越关注，所以，药品质量检测人员一定要提高工作质量以及效率，对残留物的含量进行准确的检测，这样才能保证我国药品市场更加安全的运营。

参考文献

[1] 儲春才，王慧琴. 高效液相色谱法测定药物中安乃近的含量[J]. 仪器仪表与分析监测. 2004（01）

[2] 高立军，王维贤，梅兴国. 高效液相色谱法测定盐酸非索非那定片的含量[J]. 科学技术与工程. 2004（11）

[3] 王宏枫. 高效液相色谱法检测头孢替唑残留的检验方法验证[J]. 科技创业家. 2012（24）

色谱方法学验证 篇4

1、为什么检验方法需要验证，直接用产品的法定标准不就得了吗？

残留目标物是从设备上取样得来的，因为设备清洁时使用了清洁剂、消毒剂等，擦拭取样得来的样品已经不是单纯原本产品标准里面的供试品了，里面有可能有擦拭用的溶剂、清洁剂、消毒剂等等，那这种充满了很多其它可能物质的样品检测还能不能适用原先的产品法定标准，这就需要验证了。当然取样方法的验证就更要做了，因为它对最终的计算结果有着很大的影响。

2、取样方法如何验证？

取样方法大体主要可以分为棉签擦拭法和最终淋洗水法，棉签擦拭法首先要做一个擦拭溶剂选择的验证，即采用不同的溶剂各做一次取样回收率的验证，最终选择回收率较高（大于50%），无毒性在擦拭后在设备不会有残留污染且易于得到的溶剂作为首选溶剂，对最终选择好的擦拭溶剂还要做一个再确认，即采用相用的方法操作多次确认其回收率大于50%，偏差小于20%。致于最终淋洗水法的取样回收率这个做起来实际很难操作，实际欧盟的验证指南也要求这个方法也要做回收率的验证，但在我们的指南中没有这一条的要求，我想也是考虑到实际的情况，在翻译后没有把这一条加入我国的指南中。

3、检验方法如何验证？

具体的我就不说了，可以参照药典附录，主要要验证的项目有准确度、精密度（重复性、中间精密度）、专属性、定量限、检测限、线性、范围、耐用性、还应要考虑一项是供试品溶液的稳定性。

4、清洁残留物检验方法验证如何与产品的检验方法的确认结合起来做？

实际在很多情况下，最终验证选择出来的溶剂有可能就是产品法定标准含量项下的供试品的溶剂，采用的方法也是产品法定的检验方法，如果不考虑设备清洁中使用清洁剂、消毒剂。在法定标准经过确认的前提下，那清洁残留物检验方法的验证项目只需要验证定量限、检测限、范围、溶液稳定性。有的同学可能会问为什么准确度、精密度就不用了呢？

1、这个是法定标准，这些项目已经是通过了方法学验证了。

2、与法定标准不同的是供试品的浓度变了，那最主要的就是验证其范围了，这个范围的验证实际就已经包含了有准确度的内容在里面了（不理解可以自己看下药典）。

3、当然法定标准虽然是经过了验证，但我们还是要去进行确认的了，而确认的工作比较验证而言就简单了很多。简单的说就是在这种情况下法定标准做一个确认，清洁残留物检验方法验证就可以不用每项都去验证了。

分析方法验证或确认内容 篇5

（1）化学（仪器）分析方法验证内容可按下表确定

（2）化学（仪器）分析方法确认内容可由两名检验人员分别对同一批产品进

行检验（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性，也可根据确认目的和评估结果选择相关内容进行确认。

（1）生物分析方法验证内容可按下表确定

注：“是”代表该项内容需要验证，“否”代表该项内容不需要验证。（2）生物分析方法如需确认，则根据确认目的和评估结果选择相关Ⅱ内容进

行确认。

微生物分析方法验证内容确定

（1）若为药典或其他法规的方法，验证时按药典的规定进行验证（2）若为药典或其他法规的替代方法，则需按下表进行验证

色谱方法学验证 篇6

中药质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法是否适合于相应检测要求。在建立中药质量标准时，分析方法需经验证；在处方、工艺等变更或改变原分析方法时，也需对分析方法进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草说明或修订说明中。

需验证的分析项目有：鉴别试验、限量检查和含量测定，以及其他需控制成分（如残留物、添加剂等）的测定。中药制剂溶出度、释放度等检查中，其溶出量等检测方法也应作必要验证。

验证内容有：准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。应视具体方法拟订验证的内容。附表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。

方法验证内容如下。

一、准确度

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证

1.测定方法的准确度

可用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。

在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。

回收率%＝（C－A）/ B ×100%

A：供试品所含被测成分量B：加入对照品量C：实测值

2.数据要求

在规定范围内，用6～9个测定结果进行评价，设3个不同浓度，每个浓度分别制备2～3份供试品溶液进行测定，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1:1左右。应报告供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差（RSD%）或可信限。

二、精密度

精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。

精密度包含重复性、中间精密度和重现性。

在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度称为重复性。在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。

用于定量测定的分析方法均应考察方法的精密度。

1.重复性

实验要求在规定范围内，取同一浓度的样品，用6个测定结果进行评价；或制备3个不同浓度的样品，每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价。

2.中间精密度

为考察随机变动因素对精密度的影响，应进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备等。

3.重现性

当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时通过不同实验室的复核检验得出重现性结果。复核检验的目的、过程、重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果

4.数据要求

均应报告标准偏差、相对标准偏差或可信限。

三、专属性

专属性系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性。鉴别、限量检查、含量测定等方法，均应考察其专属性。

1.鉴别

应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定,显微鉴别、色谱光谱鉴别等应附相应的代表性图象或图谱。

2.含量测定和限量检查

色谱法和其他分析方法，应附代表性图谱，以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置，色谱

法中的分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测或质谱检测进行验证。

四、检测限

检测限系指供试品中被测物能被检测出的最低量。确定检测限常用的方法如下。1.直观法

可用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法。

用一系列已知浓度的供试品进行分析，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。2.信噪比法

仅适用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3∶1或2∶1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。3.数据要求

应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。

五、定量限

定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。用于定量测定的分析方法均应确定定量限。

常用信噪比法确定定量限。一般以信噪比为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定。

六、线性

线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。

数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。

七、范围

范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。中药由于含量差异大，对于有毒的、特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的±20%。

八、耐用性

耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体、柱温，进样口和检测器温度等。薄层色谱的变动因素有：不同厂牌的薄层板，点样方式及薄层展开时温度及相对湿度的变化等。

经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。

附表

①已有重现性验证，不需验证中间精密度。②重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。③如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。

无菌检查方法验证资料分析 篇7

1 资料及其他情况

1.1 无药品生产企业名称有9个, 占21%。

1.2 无验证环境洁净度记录39个, 占90%。

1.3 无培养基适应性检查有40个, 占93%。

1.4 无菌种记录或其记录不全 (未标明代数、菌种不全或仅用1株菌种) 有34个, 占79%。菌液无接种量 (个数) 记录有19个, 占44%。

1.5 无培养观察天数表格记录有3个, 占7%。

1.6 无验证结论有7个, 占16%。

2 讨论

2.1 药品生产企业提供验证资料应该有药品生产企业名称及电话号码、药品名称, 验证单位及药品质负责联系人。电话号码是索取方法验证资料重要来源, 也是检验者与药品生产企业技术人员商讨验证资料中不明确的技术问题的重要途径。药品生产企业名称是表明药品的来源所属, 也是验证资料的来源所属。同一药品, 不同的生产企业, 验证结论 (相应品种的无菌检查方法) 是不同的, 也是再次检查同一生产企业生产同种药品的重要依据。无验证资料, 无菌检查项目就无法进行, 故不可缺少。

2.2 验证环境洁净度记录。《中国药典》2005年版规定, 无菌检查应在环境洁净度10000级以下的局部100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行, 其全过程必须严格遵守无菌操作, 防止微生物污染[2]。不记录环境洁净度, 表明验证资料不够全面, 难以相信洁净室 (区) 是否符合要求。

2.3 培养基适应性检查包括无菌性检查和灵敏度检查。无菌性检查, 是检查配制好的培养基是否达到消毒灭菌的目的;灵敏度检查是检查培养基是否适合于《中国药典》2005年版规定的各种菌株接种量 (菌量应小于100 cfu/ml) 是否生长良好, 以监控培养基的质量。培养基的质量好坏, 稳定与否, 对检验结果有极为重要的影响。但因培养基的配方中各原料成分理化性能、稳定性不同, 致使检验结果也有较大的差异, 即使是同一个厂家生产的同一型号的原料产品, 各个批号之间质量都有较大的差异, 加之各地实验室配制的培养基方法不一, 同一实验结果常有显著不同[3]。现在绝大多数药品生产企业和药品检验机构用的都是干燥培养基。据了解有的药品生产企业在配制培养基时, 不按操作规程消毒灭菌, 难以保证消毒灭菌的目的, 难以保证培养基的质量。故做无培养基适应性检查是十分必要的。

2.4 菌种及菌液 (个数/ml) 制备记录是验证资料完整之中不可缺少的一项, 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]。传代次数越多, 有些菌株容易产生变异、衰退, 难以保证应有的生物学特性。这将影响硫乙醇酸盐培养基及改良马丁培养基的灵敏度检查 (验证培养基质量是否符合要求) 、直接接种法、薄膜过滤法的验证试验和无菌检查的阳性菌对照试验, 然而有些验证资料未注明代数及菌液制备方法。

2.5 培养观察记录在验证资料中是至关重要的内容。有些验证资料记录, 培养1 d就长出了肉眼观黑曲霉和白色念珠菌, 这显然不符合实际的, 通常这两株菌和细菌相比较, 生长缓慢、微弱。笔者认为培养1 d, 肉眼是难以观察, 最少需要培养2 d才可见生长。有些验证资料缺乏观培养观察记录内容, 这显得验证资料的真实性差, 没有连贯性。验证结论缺乏可靠性。

2.6 无菌检查目的, 既要保证标准 (Ch.P.2005) 规定的所有阳性对照菌正常生长, 又要准确无误检查样品染菌情况[5]。验证结论是检查药品的重要依据, 是进行无菌检查的可靠的方法, 是否详细明确, 直接关系到验证结论是否具有可操作性, 检验结果的准确性和可靠性。没有验证结论 (如规格500 ml 10%葡萄糖注射液) 或验证结论不明确的验证资料, 给检验工作者带来麻烦, 甚至难以理解。如像这样一些结论, 规格2 ml穿心莲注射液:本品按国家药品标准检查, 结果符合规定;规格2 ml复方大青叶注射液:根据上述结果由于采用直接接种法进行复方大青叶注射液的无菌检查, 存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长有抑制作用。因此, 复方大青叶注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查中的薄膜过滤法进行, 冲洗量规定300 ml等, 没有明确样品检验数量 (最少检验数量+作阳性对照菌所需样品的量) 、方法或方法叙述不简洁, 没有采用何种阳性菌、培养观察时间和结果判断。

3 建议

3.1 菌液 (个数/ml) , 洁净室环境、培养基灵敏度检查、直接接种法以及薄膜过滤法的培养观察记录不要用文字叙述, 最好以表格方式记录, 一目了然, 真实可靠, 容易理解。

3.2 菌液制备方法一般药检人员都是清楚的, 不要照抄药典, 照抄药典显得验证资料冗长不简洁, 一般叙述为按《中国药典》2005年附录××页方法制备即可。如果与药典方法有差异, 应详细描述。

3.3 验证结论, 叙述不能含糊不清, 要简明扼要, 准确, 突出有可操作性。验证方法结论应包括样品取样量、样品处理、接种方法, 采用何种阳性对照菌、培养观察记录及结果判断等内容。例1、规格:10 ml/支颈宁A注射液的无菌检查, 直接接种法:取11支供试品各2 ml分别加至含硫乙醇酸盐培养基10支及改良马丁培养基10支的试管中;于第11支硫乙醇酸盐培养基中加2 ml供试品及小于100 cfu的金黄色葡萄球菌作为为阳性对照。按规定培养14 d, 供试品管均澄清, 阳性对照管生长良好, 判为供试品符合规定。例2、规格40 mg/瓶注射用奥美拉唑钠的无菌检查, 取供试品30瓶溶于100 ml升0.9%氯化钠注射液中, 按薄膜过滤法滤至一次性全封闭的三个滤器中, 用0.1%蛋白胨冲洗3次, 每次300 ml, 冲毕。于两个滤器中加入硫乙醇酸盐培养基 (其中一个滤器加入小于100cfu的金黄色葡萄球菌作为阳性对照) , 另一个滤器加入改良马丁培养基。按规定培养14 d, 供试品管均澄清, 阳对照管生长良好, 判为供试品符合规定。以上两个结论比较完整, 具有可操作性。

3.4 要进一步完善网络资源共享, 虽然抗生素工作网站有少部分无检查验证方法, 远远达不到检验工作的需要。为了减少浪费, 避免传真资料字迹模糊不清, 效果差, 甚至缺页或半页, 故建议全国各地药检所, 药品生产企业, 验证单位将药品生产企业名称、电话号码、药品名称及规格, 验证结论 (无菌检查方法) 等, 输入在网上, 便于查询。

参考文献

[1]中国药典.二部, 2005:90.

[2]中国药典.二部, 2005:89.

[3]马绪荣, 苏德莫.药品微生物学检验手册.科学出版社, 2000:380.

[4]中国药典.二部, 2005:94.