自我鉴定表2

自我鉴定表2（精选8篇）

自我鉴定表2 篇1

xxx同志于2013年2月至2013年7月在我公司项目部工作。其在工作期间勤学好问，工作努力，组织协调能力强。期间能与同事和各班组和谐相处，并能够较好的完成领导所交代的任务。现对其工作鉴定如下：

勤学好问：该同志在工作期间，学习勤奋，不懂就问，下班后努力钻研施工手册及其他相关规范和施工工艺等，认真做笔记及编写施工日志。在项目经理和其他施工员的帮助下，成长迅速，并在学习中不骄不馁

工作努力：该同志在工作期间，经常顶着烈日和酷暑，穿插于地下室和屋面，配合其他施工员做好测量及放样工作。保质保量的完成当月施工任务，组织协调能力强：该同志在工作期间，认真的完成测量工作，为下一步工作进程做好准备，并积极与各班组成员、甲方、监理及混凝土公司等进行沟通、协调，顺利的进行各项工作的交接，并经常对各班组的工作质量进行检查，不合格的及时联系负责人进行整改，为工程的质量和进度奉献自己的力量。

xxx建筑工程有限公司

自我鉴定表2 篇2

1 材料与方法

1．1材料

供试材料为PRRSV-VR2332毒株(标准毒株);主要试剂及仪器为反转录试剂盒、PCR仪、PCR试剂盒、琼脂糖、电泳仪、高速冷冻离心机、DL-5000Marker、微量移液器、XhoⅠ和KpnⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒和去磷酸化试剂盒。

1．2方法

1．2．1引物的合成

根据GenBank上公布的PRRSV Nsp2pro基因序列，用Primer Premier5.0设计1对特异引物，上游引物为：5′-CGGT-GAA GGTACC TACTCCCCGCCTGCCG-3′(下划线部分为KpnⅠ酶切位点)，下游引物5′-GCATCAG CTCGAG TTA CAAGGACTTTT-GAG-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点，双划线部分为终止密码子)。

1．2．2 PRRSV RNA的提取

取500μL病毒悬液，加入800μL Trizol细胞裂解液振荡摇匀5min;加入200μL氯仿，剧烈振荡1min，室温下静置5min;4℃、12 000r·min-1离心15min，吸取上清液，向其中加入等体积的异丙醇，颠倒摇匀，-20℃静置2h;室温静置10 min，随后4℃、12 000r·min-1离心20min，除去上清液;向沉淀中加入70%乙醇1mL，混匀，4℃、12 000r·min-1离心5min;弃去液体，待管壁干燥后加入20μL DEPC处理过的超纯水溶解，得到PRRSV总RNA。

1．2．3 PRRSV cDNA的合成

总体系(20.0μL)：PRRSV总RNA 5.0μL，5×Buffer 4.0μL，10mmol·L-1 dNTP 1.0μL，Amr 0.5μL，RNAsci 0.5μL，Random primer 1.0μL，超纯水8.0μL。反应条件：50℃反应45min;95℃反应5min。

1．2．4 Nsp2pro基因的扩增

总体系(20.0μL)：病毒cDNA模板2.0μL，10 mmol·L-1 dNTP4.0μL，10×Pfu Buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL，Pfu酶1.0μL，DEPC处理水36.0μL。在PCR仪内采用Touchdown方法扩增，条件为90℃预变性10 min;90℃变性5 min，78℃退火1min(退火温度从78℃到50℃共29个循环)，72℃延伸1min;然后90℃变性5min，55℃退火1min，72℃延伸1 min(25个循环)，72℃延伸10min。核酸电泳鉴定，按胶回收试剂盒使用说明进行回收。

1．2．5 Nsp2pro基因的克隆与鉴定

PCR产物与SUMO载体分别双酶切。酶切目的基因体系(50.0μL)：Nsp2pro基因26.0μL，10×H Buffer 5.0μL，XhoⅠ、KpnⅠ各2.0μL，超纯水15.0μL;酶切质粒体系(20.0μL)：SUMO载体10.0μL，10×H Buffer 2.0μL，XhoⅠ、KpnⅠ各1.0μL，超纯水6.0μL。37℃恒温水浴反应2h。酶切产物做电泳鉴定，分别用胶回收试剂盒纯化目的条带。

质粒去磷酸化体系(50μL)：CIAP 1.5μL，超纯水13.5μL，10×Phosphatase Buffer5.0μL，质粒30μL，37℃恒温水浴反应2h。

连接体系(25.0μL)：10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL，Ligase 1.0μL，Nsp2pro基因5.0μL，SUMO载体16.5μL，4℃过夜。重组质粒转化DH5感受态细胞，涂布于含氨苄西林的平板上，37℃培养18h，挑取单个菌落，LB试管扩大培养，提取质粒，然后进行双酶切鉴定，阳性质粒命名为SUMO-Nsp2pro。

1．2．6序列的测定

将SUMO-Nsp2pro质粒送华大基因进行序列测定。

1．2．7 SUMO-Nsp2pro原核表达及纯化

将阳性质粒SUMO-Nsp2pro转化宿主菌Rosetta2，无菌条件下加入到含氨苄霉素的LB培养皿中，37℃温箱保存过夜，挑取单个菌落至LB培养液中，37℃振荡培养至OD600值为0.6左右，使其终浓度为1.0mmol·L-1。分别取1和5mL培养液到EP管和新的LB培养液中作为对照组和菌种，试管中加入1.5μL IPTG诱导剂，22℃继续振荡培养过夜。收集菌液在12 000r·min-1条件下离心10 min，弃上清液，将沉淀悬浮于1×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液中，进行超声波裂解后，12 000r·min-1离心5 min。对照组弃上清，用100μL SDS-PAGE凝胶上样缓冲液悬浮后标记为1号;菌液取100μL上清标记为2号;弃去上清，沉淀用100μL SDS-PAGE凝胶上样缓冲液悬浮后，标记为3号，然后进行SDS-PAGE。

大剂量诱导表达蛋白，使用His-Bind Purification Kit进行纯化，具体操作按His-Bind纯化试剂盒说明书进行，利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

1．2．8 Nsp2pro抗原表位分析

采用DNAStar软件提供的Protean模块对Nsp2pro蛋白的B细胞抗原表位进行预测。分别以Garnier-Robson法、Chou-Fasman法预测其二级结构，以Karplus-Schulz法预测其柔性区域，以KyteDoolittle方法进行亲水性区域分析，以Emini方案进行氨基酸位于分子表面可能性分析，以Jameson-Wolf法进行抗原指数分析。

2 结果与分析

2．1 PRRSV Nsp2pro基因扩增结果

RT-PCR检测结果表明，在831bp处出现的特异性条带与预期结果一致(见图1)。

2．2重组质粒酶切鉴定分析

SUMO-Nsp2pro重组质粒双酶切，可以切出较大片段的质粒和Nsp2pro基因片段(见图2)。

2．3 SUMO-Nsp2pro的小剂量表达结果

重组质粒SUMO-Nsp2pro转化Rosetta2大肠杆菌中，经IPTG诱导后，SDS-PAGE的电泳结果表明，SUMO-Nsp2pro为可溶性蛋白(见图3)。大小约为49kD，与预期相一致。

M:标准蛋白;1:对照组超声波裂解沉淀;2:超声波裂解上清;3:超声波裂解沉淀

M:Protein marker;1:Precipitate of the lysate of control;2:Supernatant of the lysate;3:Precipitate of the lysate

2．4纯化蛋白SUMO-Nsp2pro的SDS-PAGE结果

表达的融合蛋白用His-Bind纯化试剂盒进行纯化，取前6管收集液20μL进行SDS-PAGE电泳，结果在49kD左右出现表达量较大的蛋白条带，杂蛋白很少，表明纯化良好(见图4)。

M:标准蛋白;1～6:SUMO-Nsp2pro的纯化结果

M:Protein marker;1～6:purified protein

2．5 Nsp2pro的二级结构预测

分别以不同的方法(Garnier-Robson法、Chou-fasman法)预测Nsp2pro的二级结构，可看出其上α螺旋及β折叠区域较多，转角区域较少，结构较为复杂。两种方法预测共有的α螺旋区域主要集中在19～22位，40～50位，69～79位，123～131位，136～142位，204～212位，220～230位;共有的β折叠区域在12～16位，80～83位，155～167位，177～190位，202～203位，213～216位，237～239位，244～27位，257～260位，267～275位;共有的转角在4～11位，37～39位，62～63位，102～106位，149～150位，168～171位，191～198位。Karplus-Schulz法预测其柔性区域结果显示Nsp2pro上含有大量的柔性区域，其中较大的几个柔性区域分别位于23～45位，145～156位，195～206位，253～263位(见图5)。

A.α螺旋区域;B.β折叠区域;T.转角区域;C.柔性区域

A:Alpha regions;B:Beta regions;T:Turn regions;C:flexible regions

2．6 Nsp2pro的B细胞抗原表位预测

按照Kyke-Doolittle的氨基酸亲水性标准，Nsp2pro具有较高的亲水性，主要包括第1～12、21～48、145～154、166～178、194～208、226～242区段;根据Emini原则分析表面可及性，结果显示Nsp2pro中表面可及性较高的区域主要分布在第25～42、147～151、196～203、229～233区段，而且这些区段都位于亲水性区域;Jameson-Wolf法预测ORF1编码蛋白抗原指数的结果表明，Nsp2pro的亲水性区域抗原指数都很高(见图6)。综合预测结果，Nsp2pro上位于蛋白分子表面且亲水的区段很可能是B细胞表位的优势区段。

3 结论与讨论

Nsp2是PRRSV基因编码的最大非结构蛋白，其在病毒复制过程中起到重要的作用。编码Nsp2pro的基因具有高度保守性，该段基因的缺失或者置换将降低病毒的复制能力。该试验通过PCR方法扩增Nsp2pro目的片段，连接构建原核表达载体SUMO-Nsp2pro，转入到宿主菌Rosetta2感受态细胞，进过双酶切及测序鉴定，阳性质粒用于原核表达。经IPTG诱导，获得高浓度的可溶蛋白Nsp2pro，经SDS-PAGE鉴定，在49kD左右得到高纯度的目的蛋白。Nsp2pro二级结构及抗原表位进行预测的结果表明Nsp2pro空间结构较为复杂，位于蛋白分子表面且亲水的区段很可能是B细胞表位的优势区段。

2006年PRRS在我国大部分省份流行起来，给养猪业造成了极大的损害[3]。目前除了免疫接种PRRSV疫苗外，还没有有效的抗病毒药物治疗该疾病。进一步的试验证明，目前的只基于一种毒株的疫苗不能或只能部分对同源病毒有效[4,5]。因此在开发新型疫苗的同时，对于能够抑制病毒的小分子抑制剂的开发也是防控PRRSV的重要研究方向[6]。一般来说，能够阻碍病毒侵入机体、病毒增殖、包装及出胞的任何过程都可以作为抗病毒药物设计的靶点。Nsp2是猪繁殖与呼吸综合症病毒编码的最大的非结构蛋白，其半胱氨酸蛋白酶正确切割nsp2～3之间的连接以及自身，是病毒复制的关键[7,9,10]。该试验主要对PRRSV的Nsp2pro基因进行了分子克隆和鉴定[8]，为该片段蛋白的表达提供了基础。通过原核表达分离纯化蛋白，得到高纯度的蛋白。如果能够获得晶体，将可以通过X-晶体衍射解析蛋白空间结构，找出适合小肽作用的靶位点，从而抑制病毒的活性，可为抗病毒药物的设计提供基础。

摘要：为了获得PRRSV非结构蛋白2-半胱氨酸结构域的高纯度原核表达蛋白以及了解该蛋白的抗原表位,试验以从PRRSV-VR2332毒株上提取的病毒全基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增非结构蛋白2-半胱氨酸结构域(Nsp2pro)基因,连接构建原核表达载体SUMO-Nsp2pro,转入宿主菌Rosetta2,经IPTG诱导,获得高浓度的可溶蛋白Nsp2pro,经亲和层析His-Bind后得到高纯度的目的蛋白。同时,运用生物信息学方法对Nsp2pro二级结构及抗原表位进行预测。结果显示,Nsp2pro的α螺旋及β折叠区域较多,转角区域较少,结构较为复杂,位于蛋白分子表面且亲水的区段很可能是B细胞表位的优势区段。获得较高纯度的蛋白,将为后续进一步研究Nsp2pro基因编码的蛋白在病毒复制过程中的作用奠定基础。

关键词：PRRSV,Nsp2pro,基因克隆,原核表达,抗原表位预测

参考文献

[1]秦爱建,韦平.重要动物病毒分子生物学[M].北京:北京科学出版,2008.

[2]Jun Han MSR,Kay S Faberg.The porcine reproductive and re-spiratory syndrome virus Nsp2cysteine protease domain posses-ses both trans-and cis-cleavage activities[J].Journal of Virolo-gy,2009,83(18):9449-9463.

[3]严景华,瞿李侯.Expression and purification of porcine repro-ductive and respiratory syndrome virus Nsp2protein and analy-sis of cleavage activity[J].微生物学报,2009,49(11):1502-1508.

[4]de lima M PAK,Flores E F,Osorio F A.Mapping of B-cell lin-eat epitopes on Nsp2and structural proteins of a North Ameri-can strain sf porcine reproductive and respiratory syndromevirus[J].Virology,2006,353:310-421.

[5]Ying Fang JC-H,Elizabeth Brown,Liu Haixia,et al.Develop-ment of genetic markers in the nonstructural protein 2region ofa US type 1porcine reproductive and respiratory syndrome vi-rus:implications for future recombinant marker vaccine develop-ment[J].Journal of General Virology,2008,89:3086-3096.

[6]毛君婷,周碧君,史开志.Prrsv特种野猪分离株Nsp2基因序列分析和疫苗免疫效果[J].畜牧与兽医,2009(10):88-90.

[7]Oleksiewicz MB BA,Toft P,Normann P,et al.Epitope mappingporcine reproductive and respiratory syndrome virus by phagedisplay:the Nsp2fragment of the replicase polyprotein containsa cluster of B-cell epitopes[J].J.Virol,2001,75(7):3277-3290.

[8]郭杨,陈世界,林华.高致病PRRSV Nsp2变异株PowerSYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学,2009,39(5):410-415.

[9]Eric J,Snijder HvT.Norbert Roos,Ketil W Pedersen.Non-structural proteins 2and 3interact to modify host cell mem-branes during the formation of the arterivirus replication com-plex[J].Journal of General Virology,2001,82:985-994.

量化自我的苹果表篇3

过去几年里，智能设备、量化App和社交媒体正将人类逐渐编织在一个机器思维的罗网里。在这个罗网里，人类的各种活动正在被转化为数字。比如行走——戴一个Fitbit的腕带，你会发现自己每天平均行走在3000-4000步之间;比如睡眠——戴一个睡眠监测器，你会知道自己一天睡眠时间8小时，早晨5：30到6：45 之间睡眠质量最好，所以闹钟最好别设在6：15;比如情绪，你的智能手机能从你的声音中识别出你在过去20秒之内的热情程度，谷歌眼镜的面部识别系统能通过分析你当下的表情，测量你的各种情绪指标——1.生气程度 2.高兴程度 3.沮丧程度4.惊讶程度;硅谷的发明家们发明了一款名为Spreadsheets的App，只要把你的智能手机正面朝上搁在床垫上，就能跟踪做爱时的声音、长度，并由此计算你的性能力。

几个月前，苹果手表推出的时候，人们对其寄予厚望，希望它能整合市场上各种零散的小设备和App，将这场运动扩散到更大众层面的消费品市场。他们宣称，这些最贴身的小设备以及它们所采集的数据对我们的生活一定有积极的意义——这些数字提供了一个关于我们自己的清晰、干净、容易消化的信息包裹。它们可以作为我们审视自己的一面镜子，揭示我们日常生活中的某些秘密规律，帮助我们看到平常意识不到的因果关联和相关性，帮助我们更好地认识自己。

更重要的是，这些数字还会提供我们行动的依据或者指引——每当我们想做一些愚蠢的、不健康的、或者不好的事情时，这些数字会提醒我们，甚至直接进行干预。比如苹果手表内置了触感反馈，如果你坐得太久，手表会振动提醒你该站起来走走。也许以后iWatch2能测量你的血清素水平。iWatch3会知道你完整的基因组图谱，到时候Siri会体贴地告诉你，“基于你的心脏情况，我已经取消了你的有线电视，给你报了一个6星期的健身课程，把你刚才预订的比萨改成了沙拉。”

自我鉴定表2 篇4

自我鉴定范本

预备党员目的在于对新党员进行严格的党的组织生活和实际工作锻炼，对他们继续进行教育和考察，使他们端正入党动机，进一步提高思想觉悟，增强党性修养，成为合格的共产党员。下面由本小编精心整理的2018预备党员考察表自我鉴定，希望可以帮到你哦!

【2018预备党员考察表自我鉴定】一

敬爱的党组织：

2018年5月11日，经党支部大会讨论通过，上级党委批准，我成为了一名光荣的中国共产党预备党员，至今已届一年。按照党章的规定，我的预备期已满，为此特向党组织正中提出转为正式党员的申请，请党组织根据我在预备期间的表现，讨论通过我由预备党员转为中国共产党正式党员。下面，我将自己在预备期间的表现，向党组织作详细的汇报。

在一年的预备期里，我严格按照一个共产党员的标准要求自己，认真履行党员义务，努力学习、踏实工作、争当模范，从而使自己在思想、工作和作风上都取得了较大进步。

一年来，我认真学习马列主义、毛泽东思想、邓小平理论和“三个代表”重要思想和科学发展观，特别是通过深入学习三中、四中、五中全会精神的学习，使自己对党的认识更加深刻，对党的崇高理想和建设中国特色社会主义的信念更加坚定。通过学习，自己的马列主义理论水平有了进一步提高。作为一名未来即将踏入新闻工作行业的学生和预备党员，我拥护党的基本理论、基本路线、基本纲领和方针政策，自觉遵守党和国家的法律法规及党委的各项规章制度，恪守新闻从业人员的职业道德。一年来，我结合工作实际，认真学习党和国家的方针政策，始终与党中央保持思想上、政治上的高度一致，始终坚持了正确的舆论导向。在暑假实习期间中，我严格用共产党员的标准要求自己，模范遵守党纪国法和职业道德，在社会上和单位中树立了良好的形象。

为了不断提高自己的学习和工作能力，努力为学校和班级多贡献自己一分力量，一年来，我努力学习、使自己的专业技术能力有了长足的进步，有效地保证了自己能够圆满地完成在学校帮助辅导员，学生会影像部及电视台的实习期间的各项工作任务。过去一年中，我先后在校担任班长和实习单位的实习记者工作，完成了很多编辑采访和写作任务，编辑与采写能力也有了很大提高。也赢得了学校老师与实习单位领导和同事的一直好评。

一年来，我在党组织的悉心培养下，在同志们的热情帮助与指导下，我能够积极认真地、以高度负责的态度独立地完成党交给的各项工作任务，在政治上、思想上都有了一定的进步与提高。如果我能够顺利地转为中共正式党员，对我自己来说，是一件非常高兴的事情，这将成为我人生中一个重要的里程碑，是我自己政治生活新的开端。我将以此为继续前进的新起点，用党员标准更加严格地要求自己，真正实践自己的入党誓词，使自己无愧于共产党员这一光荣的称号。

此致

敬礼!

申请人：

申请日期：

【2018预备党员考察表自我鉴定】二

敬爱的党组织：

我于**年5月成为了中国共产党预备党员中的一员，至今已将近有一年了。身为中国共产党的一名预备党员，我现将我考察期的工作汇报如下：

成为预备党员没多久，我就到了师军需科工作。在这段时期里，我时刻以一名党员的身份处处严格要求自己，模范带头，尽党员应尽的职责。

在思想上认真学习马列主义、毛泽东思想以及邓小平理论来武装自己的头脑，认真落实三中四中五中全会精神。作为保管员，我想自己应该进入角色，应该首先从自己的服务态度做起。专业技术精不精，是一个人对工作的熟练问题，而服务态度好不好，是一个人对工作的态度、对本职工作热爱程度的问题，我认为服务态度占重要地位，所以我立足本职，树立起以官兵对服装发放的意见就是我工作标准的意识，尽自己最大能力让大家都穿得及时、穿得合体。其次，努力尽快掌握保管业务，遵守保管员职责，自己多学习一些本专业的理论知识，提高专业技术，协助助理员干好被装的发放和管理工作。

平时我在思想上坚定理想信念，树立正确的世界观、人生观、价值观，保持思想稳定，及时调节自我，保持愉快的心情去干工作。注意政治理论的学习，使自己接受正确思想，确实做到“常在河边走，就是不湿鞋”，能够经受住各种诱惑，永葆一名革命军人的政治本色。多主动汇报思想，让自己的思想让党组织知道，增强配合意识。

在工作中我以共产党员的标准来要求自己，牢记入党誓词，克服并纠正自身存在的问题，工作中大胆负责，脏活、累活干在前面，遇到困难挺身而出。牢记党对我的培养和教育，吃苦在前，享受在后。我要学习雷锋的“钉子精神”，要不断进取，知难而进，“三百六十行，行行出状元，”我作为军人，应该充分利用部队这所大学校，努力地锻炼自己，使自身素质不断提高。在学习上作为一名保管员，由于工学矛盾，虽然对一些课、一些作业来不及补上，我在态度上端正思想，不应该产生混淆思想，处理好工学矛盾，坚持当天的工作当天完成，决不拖到第二天。在课余时间我积极投入到各种活动中去，并且努力抓好政治理论和文化学习，以及自己函授学习，做到工作、学习两不误。注意平时的学习、平时的自我调整。使自我约束能力提高，使自己能正确对待他人的批评，并且及时地纠正。

为人处世上团结同志、尊重领导，处理得当与上级、同级、下级之间的关系。尊重上级，诚恳接受上级批评，不管批评是否正确，查找自身原因，决不与上级争执。与同级的关系，跳出老乡圈子，多与战友们交往，确实做到团结同志这一点。与下级关系，决不以新老兵拉长与他们的关系，以兄弟关系去帮助他，以身作则，确实体现出一个老兵的模范作用。军人入党转正申请书范本推荐由精品学习网提供!

现在我还是一名预备党员，我恳切希望党组织能认可我，让我转正成为一名正式党员。今后我会更加严格要求自己，牢记入党誓词。如果党组织不予批准，则说明我离真正党员的要求还有距离，我不会灰心或失望。我会更加勤奋工作，努力学习政治、理论文化等知识，以更高的工作标准和工作姿态去争取党组织的批准。

以上是我的转正申请书，请党组织审查。不足之处请组织上批评指正。

此致

敬礼!

申请人：

年月日

【2018预备党员考察表自我鉴定】三

2018年1月7日经党支部批准，我实现了梦寐以求的愿望，成为一名光荣的中国共产党预备党员。现在我的预备期已快满一年，我郑重向党组织提出转正申请，申请希望转为中国共产党正式党员。一年来，在党组织的带领下，在支部党员的悉心帮助下，通过一系列的理论知识学习和活动，我的政治、思想水平都有了很大提高，也增强了自身的党性修养，更进一步的认识到做一名合格的党员不仅要解决组织上入党的问题，更重要的是要从思想上入党。在党组织的培养教育下，我一直都按照党员的标准来严格要求自己，加强政治理论学习，特别在此期间赶上我党科学发展观的深入学习，只有不断学习进步，我们才有能力为我党的建设奋斗终身!为了便于党组织对我的考核审查，我将自己一年来的情况向组织作如下汇报：

一、思想政治方面

这一年来，我主动加强政治学习，利用更多时间认真学习党史和党章，了解我们党的光辉奋斗史，进一步系统学习了马列主义、毛泽东思想、邓小平理论、“三个代表”重要思想、和科学发展观，学习了党的三中、四中、五中全会精神。不断提高自己的共产主义觉悟，不断提高自己的政治素质、业务素质和工作能力。在学习过程中，坚持理论联系实际，把改造客观世界与改造主观世界结合起来。用理论、用知识武装头脑、指导实践，始终以饱满的政治热情、积极的生活态度为实现崇高理想而坚持不懈地努力。通过学习，我认识到，我们党一直把全心全意为人民服务作为党的宗旨，把实现和维护最广大人民群众的根本利益作为一切工作和方针政策的根本出发点，是那样的以人为本，党的一切工作或全部任务，就是团结和带领人民群众为实现这些利益而奋斗!这一年最大的收获就是通过学习党的群众路线、“三严三实”，让我更加认识我党，它不仅仅阐述我党的根本信念，而且是我们人类发展到现时代，是领导时代更好发展的重要武器，更是我们个人去生活、去奋斗的重要思想指导，我把它更加看成是80后的人生观和方法论!另外，我还及时学习国家领导人在两会上的讲话和党中央颁布的最新决策、决议，在思想上和党组织保持高度一致。对于即将召开的两会，我也会密切关注，及时了解国家的最新动态。同时，我经常向老党员学习经验、交流心得，按期向党组织汇报自己的思想状况，及时解决自己的思想问题，表达入党的迫切愿望。通过以上的努力，我对党有了进一步的认识，思想政治素质得到了一定的提高。

二、工作方面

作为班级的团支书，我积极带动同学学习科学发展观，利用课余时间搜集资料，与同学们共同学习了八个课时的科学发展观，并在最后进行了一次测试，我还及时了解国家时政，并通过网络博客和群邮件和同学一起学习，深入同学之中，与同学相处融洽，团结同学，关心同学，带头完成组织上安排的任务，较好地完成了各项工作，同时还能够团结同学一道工作，虚心接受他人的批评意见。对自己工作中暴露出来的工作方法等缺点，认真地进行了改正。另外，我还积极参与实践活动，在十一运期间，志愿服务全运会，为全运贡献了自己微薄的力量，并获得了济南市优秀志愿者称号。

三、学习方面

现在已是一名大三的学生，我深知当今时代是科学技术高速发展的时代，没有丰富的现代科学文化知识和较强的业务能力，是很难适应时代发展，为党的事业做出较大贡献的。为此，我坚持勤奋学习，认真研究本专业知识并获得三等优秀奖学金，同时，还利用课余时间不断努力扩展学习面，时代需要多知识推动进步，我们就要多学习才能创造未来;诚然，我的学习成绩还不够理想，仍需要继续努力，使自己的学习成绩再上一个台阶。

一年来，我在党组织的帮助和支持下取得了一定的成绩，但我深知自己还存在一些缺点和不足，主要表现在：政治理论基础不够扎实，理论联系实际的能力有待进一步加强，自己的综合整体素质还有待进一步的提高。在今后的工作和学习中，我要更进一步严格要求自己，虚心向先进的党员同志学习，注意克服自己的缺点和不足，争取取得更好的成绩。

以上是我一年来的基本情况的小结，不妥之处，恳请组织批评指正。作为一名预备党员，我渴望按期转为中共正式党员，为此，我郑重向党组织提出申请，如果党组织能批准我为正式党员，我一定牢记入党誓词，努力学习，勤奋工作，处处以共产党员的标准严格要求自己，做一个名副其实的党员。如果组织不批准或者延期转正，我一定加倍努力，继续接受党组织的考验，争取早日成为一名中共正式党员。

此致

敬礼!

申请人：

年月日

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自我鉴定表篇5

个人基本情况 :

姓名:韩臣臣

填表日期：２０１３年２月１９日

血型：忘了

性别：男

民族：汉

出生：辛未羊年十月十四（农历）１９９１年１１月１９日（阳历）

籍贯：河南省洛阳市孟津县小浪底镇柳树摊村

手机：１３６１３８８２１３８

婚姻状况：已有所爱

你的身体状况：亚健康

你的精神状况：一般

你目前的睡眠状况：一般

你决心冲刺的业绩是：

八万

对自己的综合满意程度：差

掌握哪些方言：哪些外语：

最高学历： 所学专业： 爱好或特长：

你的个性属于：

内向

你的座佑铭是：经验不是财富会灵活运用经验才是财富

1、你觉得学习有那么多的好处，你学了什么？你改变了学员什么？学员想改变什么？

答：MQE管理素质、深度修炼、论道中国以及参加了全国四大演说家之一彭清一老师以及刘景澜、廖若庆老师的精彩演讲等等。

通过学习帮助学员变得更加自信，有积极阳光的心态，扩大了学员的交际圈，同时了解工厂的部门运作流程及更多的管理方法。

学员希望让自己学到更多的知识，让自己讲话更有说服力，学会更多的舞蹈变得更加有魅力，将管理方面加强走向白领岗位！

2、你对目前自己的思维能力满意不？有哪些不足的地方？

答：不是很满意，因为有的时候考虑事情不够全面，遇到不懂的事情没有信心，想像力不够丰富。

3、你在销售方面做得怎么样？还有哪些做得不足的地方？

答：还不错但还是有很多提升的空间，首先还没有完全放下面子，展示自己把握每一个机会，没有主动的去学习更多的方法和总结经验，没有将现有的资源合理的利用起来，多观察竞争对手的动态。

4、在管理方面如果满分是10分，你会给自己打多少分？哪些方面做得比较好？还有哪些方面需要提升？

答：6分；做的好的方面有：积极乐观，微笑较多，心态好，疯狂。

需要提升的地方：没有足够的个人魅力，管理知识要不断加强，提升团队管理。

6、你觉得你缺什么？怎样改善？什么时候改善？有决心吗？

答：缺乏管理知识经验，社会经验，团队管理，创新能力，优秀的口才，专业的销售能力。

心须下定决心现在当下改善：通过向其它优秀的大师学习，经常拜访，多在网上学习查询更多的资料及视频，不断尝试和承担，总结经验；多思考，保持良好的心态不断向更多的学习。

7、你想成为优秀的企业管理者，你认为你该具备什么？

答：一定要具备：优秀的销售力能和突出的业绩，教学培训质量和管理水平优秀，积极正面的心态，敢于表现自我和承担责任，口才不错，有一颗奉献之心和爱心，超强的学习力，有着和上下游客户一起发展的决心和意愿，善于思考和钻研新的事物。

8、你认为同事朋友对你满意的是什么？不满意的是什么？大家对你的印象是什么？答：满

意：平易近人，容易相处，用心，坚持，付出。

不满意：经常骂人

印象是：用心，不解风情，是个好男人，思想怪异，对女孩子冷漠

9、你的业绩跟什么有关系？

答：人际关系，沟通能力，销售技巧，思维能力，实践经验，学习能力，团队

10、描述自己是一个怎样的人？

自我鉴定表档篇6

在政治上，我有坚定的政治方向，积极上进，了解时事政治，关注国际政治发展动向，热爱祖国，热爱人民，坚决拥护中国共产党的领导，拥护党的各项方针政策，遵纪守法，勇于批评和自我批评，树立了正确的人生观和价值观并在大三成为中国共产党党员。

在学习上，凭着对未来生活的渴望与追求，我一向严于律己，刻苦钻研，勤奋好学，态度端正，目标明确，为把自己，变成一个掌握现代信息和职业技能的合格大学生，我牢固掌握了。本专业的基础知识和技能，除此之外我还广泛猎取其他学科的知识，给自己更多的机会参加社会实践，做到理论联系实际。我曾荣获一等奖学金和国家励志奖学金的荣誉等。

在工作上，除了积极参加学校、系、班级组织的各项活动外，作为一名学生干部，我积极主动的完成本职工作，与同学老师相互配合，顺利的组织开展了校园企业参观和系列知识讲座等活动。在校期间，我荣获学院的“优秀裁判员”和体育系“优秀裁判员”称号，以及学院“优秀学生干部”的称号等等。

在生活上，我严格要求自己,勤俭节约,遇事冷静思考,加以认真对待。勇于自我检讨。为人热情大方，诚实守信，乐于助人。有自己为人处世的原则，与同学，朋友和睦相处，共同进步。

自我鉴定表2 篇7

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属, 为单链正股RNA病毒, 只有1种血清型。基因组序列包括6个开放阅读框 (ORF) , 从5'端到3'端依次为复制酶多聚蛋白1ab (pp1ab) 、纤突蛋白 (S) 、ORF3、小膜蛋白 (s M) 、膜糖蛋白 (M) 和核衣壳蛋白 (N) 基因。M基因和N基因相对保守, 在PEDV的分子生物学诊断方面具有很好的应用前景[3,4]。S基因虽然相对于M基因和N基因变异性较大, 但其编码的S蛋白包含主要中和抗原表位 (core neutralizing epitope, COE) , 能够刺激机体产生中和抗体[5,6], 在S蛋白介导的免疫反应中发挥重要作用, 仍然是PEDV检测和疫苗研制的重要抗原物质[7,8]。本研究利用原核表达系统表达COE蛋白, 并用胶体金和Western-blot方法检测反应原性, 用表达蛋白免疫兔制备高免血清, 为建立检测PEDV感染的免疫学方法奠定坚实的基础, 现将试验结果报道如下。

1 材料

由Gen Bank中查得PEDV-COE基因序列 (登录号为JN599150.1) , 由上海捷瑞生物工程有限公司合成;兔源抗PEDV高免血清, 由北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室保存;雌性新西兰白兔, 购自北京金牧阳实验动物有限责任公司;带His标签抗体的Ni-琼脂糖填料, 购自QIAGEN公司;Anigen Rapid PED Ag Test Kit, 购自韩国安捷公司;HRP标记的鼠抗免Ig G, 购自北京康为世纪生物科技有限公司。

2 方法

2.1 原核表达载体p ET-30a-COE的构建

合成的COE基因5'端加Bam HⅠ酶切位点, 3'端加终止密码子和SacⅠ酶切位点。对载体p ET-30a进行Bam HⅠ和SacⅠ双酶切, 与目的基因连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑取单个菌落提取质粒, 进行酶切和测序鉴定, 将阳性质粒 (p ET-30aCOE) 转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中表达。

2.2 目的蛋白的表达

挑取p ET-30a-COE单个菌落接种于含50μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中, 37℃振荡培养过夜;按照1∶100的比例接种于含50μg/m L卡那霉素的LB液体培养基中, 37℃振荡培养至OD600值达到0.7左右;加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 继续振荡培养1 h;取1 m L菌液, 离心收集菌体, 利用PBS悬浮细菌;加入上样缓冲液, 水浴5 min后离心;取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。

2.3 目的蛋白的纯化和复性

参照QIAGEN公司蛋白纯化说明书进行蛋白纯化, 从1 L培养物中收集菌体后用PBS重悬, 加入溶菌酶至1 mg/m L, 4℃作用1 h;超声波破碎后用裂解液Ⅰ (50 mmol/L Na H2PO4·2H2O、300 mmol/L Na Cl、10 mmol/L咪唑、p H值为8.0) 洗沉淀2次;将沉淀悬浮于20 m L裂解液Ⅱ (50 mmol/L Na H2PO4·2H2O、300 mmol/L Na Cl、10%甘油、3%Empigen BB、10 mmol/L咪唑、p H值为8.0) 中, 4℃搅拌作用1 h;离心后取上清液, 经滤膜过滤后用5 m L带His标签抗体的Ni-琼脂糖填料装柱, 将上清液装入平衡好的镍柱, 4℃过夜;先用洗液Ⅰ (50 mmol/L Na H2PO4·2H2O、300 mmol/L Na Cl、10%甘油、2%Empigen BB、10 mmol/L咪唑、p H值为8.0) 和洗液Ⅱ (50 mmol/L Na H2PO4·2H2O、300 mmol/L Na Cl、10%甘油、1%Empigen BB、60 mmol/L咪唑、p H值为8.0) 洗涤, 再用洗脱液 (50 mmol/L Na H2PO4·2H2O、300 mmol/L Na Cl、10%甘油、1%Empigen BB、300 mmol/L咪唑、p H值为8.0) 洗脱目的蛋白, 最后对洗脱蛋白透析, 浓缩, 备用。

2.4 目的蛋白的胶体金法检测

利用Anigen Rapid PED Ag Test Kit检测表达蛋白的反应原性, 取上述纯化蛋白溶液, 滴入加样孔中, 5~10 min内观察结果, 同时以诱导前的样品作为对照。

2.5 目的蛋白的Western-blot法检测

表达的蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜, 将转印后的膜转移至封闭液中, 于37℃封闭1 h;一抗为按照1∶50稀释的兔源抗PEDV高免血清, 于37℃反应1 h;用PBST洗膜3次, 每次10 min;然后加入按照1∶2 000稀释的HRP标记的鼠抗兔Ig G, 于37℃反应1 h;用PBST洗膜3次, 每次10 min;最后用DAB作为底物进行显色, 条带清晰后终止显色反应。

2.6 高免血清的制备和ELISA检测

选择体重为2~3 kg的雌性新西兰白兔4只, 随机分成2组, 即目的蛋白的免疫组和非免疫对照组。复性后的蛋白按Bradford方法测定浓度, 与等体积的弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下多点注射免疫, 免疫剂量为1 mg/只。第14, 28, 42天各免疫1次, 与等体积的弗氏不完全佐剂乳化, 免疫剂量和途径与首免相同。第49天心脏采血, 4℃静置过夜, 5 000 r/min离心10 min;取上清液分装后于-20℃保存, 备用。

每孔用1μg纯化的COE蛋白包被ELISA板, 4℃过夜;PBST洗涤3次, 每孔加入200μL封闭液 (3%BSA) , 37℃孵育2 h;洗涤3次, 每孔加入100μL倍比稀释的血清, 稀释度为1∶100至1∶25 600, 于37℃孵育1 h;洗涤6次, 每孔加入100μL按照1∶2 000稀释的HRP标记的鼠抗兔Ig G, 于37℃孵育45 min;洗涤6次, 每孔加入底物TMB溶液100μL, 于室温避光孵育15 min;每孔加入100μL浓度为1 mol/L的HCl终止反应。在酶标仪上450 nm波长处测定各孔OD值。判定标准为大于阴性对照2.1倍的样本为阳性。

3 结果

3.1 表达载体的鉴定结果

将合成的COE基因与p ET-30a载体连接后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞, 提取质粒, 用Bam HⅠ和SacⅠ双酶切鉴定, 得到大小为5 400 bp和420 bp的2条带, 与预期结果一致, 见图1。测序正确后转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中用于表达。

3.2 表达产物的SDS-PAGE电泳结果

取1 m L菌液收集菌体, 用PBS洗涤后加入SDS上样缓冲液充分混匀, 煮沸离心后取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。结果显示, 重组菌在37℃、1 mmol/L IPTG的条件下诱导1 h后可见分子质量为20 ku的条带, 而诱导前的样品没有, 见图2, 表明在该条件下细菌能够表达目的蛋白。

M.DL-5 000 Marker;1.p ET-30a-COE经Bam HⅠ和SacⅠ双酶切。

M.蛋白质质量标准;1.诱导前的p ET-30a-COE;2.诱导1 h的p ET-30a-COE。

3.3 表达产物的纯化结果

超声波破碎菌体后, 分别收集上清液和沉淀, 由SDS-PAGE电泳分析可见, 沉淀中有20 ku的目的条带, 而上清液中没有, 表明目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。经包涵体裂解和目的蛋白纯化后, 收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳, 可见20 ku的目的条带, 而未见其他条带, 表明经纯化后得到了纯度和浓度较高的目的蛋白, 见图3。

3.4 胶体金法检测结果

利用Anigen Rapid PED Ag Test Kit检测重组菌表达的蛋白, 结果为阳性, 而诱导前的样品为阴性, 见图4。

3.5 Western-blot法检测结果

重组菌诱导后在20 ku处可见阳性条带, 而诱导前的样品无条带, 见图5。表明重组菌表达的目的蛋白具有良好的反应原性, 能够用于PEDV-COE抗体的检测。

3.6 免疫血清的效价测定结果

以纯化的COE蛋白包被ELISA板, 采用间接ELISA方法检测制备的兔源免疫血清效价, 血清样品稀释1∶6 400后, OD450值仍大于阴性对照的2.1倍;而稀释1∶12 800后, OD450值小于阴性对照的2.1倍, 表明所制备的兔源免疫血清效价达1∶6 400。

M.蛋白质质量标准;1.超声波破碎后的上清液;2.超声波破碎后的沉淀;3.纯化后的表达产物。

1.诱导前的p ET-30a-COE;2.诱导1 h的p ET-30a-COE。

M.蛋白质质量标准;1.诱导前的p ET-30a-COE;2.诱导1 h的p ET-30a-COE。

4 讨论

目前, PEDV的诊断多以全病毒抗原及其多克隆抗体为基础, 但PEDV的培养难度较大, 难以大量应用。大肠杆菌表达系统具有操作简单、周期短、价格低、获得量高等优点, 且人们对其基因背景、表达特性的了解比较清楚。虽然存在一些缺陷, 如没有翻译后加工的功能, 以及表达的蛋白没有足够的生物学活性, 但表达产物在与功能活性无关的免疫性质研究中效果较为理想, 故仍然是目前最受欢迎的异源表达系统之一[9]。

姜艳平等[10]将PEDV S基因分为连续的4段, 分别在大肠杆菌中表达并制备多克隆抗体, 结果目的蛋白都有很好的抗原性, 其中S1、Ps420抗血清能识别天然的PEDV粒子, 提示S1、Ps420抗血清在病原检测中有潜在的应用价值, Ps420基因就是COE基因。

基于以上研究, 本试验成功地将COE基因克隆入原核表达载体p ET-30a, 经过诱导条件的优化, 最终确定在IPTG终浓度为1 mmol/L、37℃诱导1 h条件下目的蛋白的表达量最高。表达的目的蛋白经SDS-PAGE电泳分析, 获得的融合蛋白分子质量为20 ku, 与预期大小相符, 是15 ku的COE蛋白和5 ku的His标签蛋白之和。胶体金法和Western-blot法检测结果证明, 大肠杆菌表达的COE蛋白能够与PEDV特异性抗体结合, 该蛋白免疫兔后获得的高免血清效价达1∶6 400。本试验结果为建立检测PEDV感染的免疫学方法奠定了坚实的基础。

摘要：为了获得具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 主要中和抗原表位 (COE) 蛋白及其多克隆抗体, 试验对已发表的PEDV基因序列进行比对, 并设计、合成COE编码基因 (420 bp) , 将其克隆入原核表达载体pET-30a, 转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞中, IPTG诱导表达, 利用胶体金和Western-blot方法检测表达产物;纯化后免疫兔制备高免血清, 并利用ELISA方法检测血清抗体效价。结果表明:表达的重组蛋白可与PEDV特异性抗体结合;免疫兔后获得的血清抗体效价达1∶6 400, 具有免疫原性。

关键词：猪流行性腹泻病毒,中和抗原表位,原核表达,纯化,免疫原性

参考文献

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[2]陈建飞, 冯力, 时洪艳, 等.猪流行性腹泻疫苗的研究[J].猪业科学, 2010 (12) :50-51.

[3]CHANG S H, BAE J L, KANG T J, et al.Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the Porcine epidemic diarrhea virus[J].Mol Cells, 2002, 14 (2) :295-299.

[4]DUARTE M, LAUDE H.Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus[J].J Gen Virol, 1994, 75 (Pt 5) :1195-1200.

[5]HOU X L, YU L Y, LIU J Z, et al.Surface-displayed Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) antigens on lactic acid bacteria[J].Vaccine, 2007, 26 (1) :24-31.

[6]YEO S G, HERNANDEZ M, KRELL P, et al.Cloning and sequence analysis of the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J].Virus Genes, 2003, 26 (3) :239-246.

[7]甘振磊, 汤德元, 李春燕, 等.猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J].猪业科学, 2010 (12) :24-28.

[8]GAO S Y, ZHA E, LI B X, et al.High-level prokaryotic expression of envelope exterior of membrane protein of Porcine epidemic diarrhea virus[J].Vet Microbiol, 2007, 123 (1/2/3) :187-193.

[9]STUDIER F W, ROSENBERG A H, DUNN J, et al.Use of T7RNA polymerase to direct expression of cloned genes[J].Methods Enzymol, 1990, 185:60-89.