食品中微生物的控制(共9篇)
在中国传统月饼、蛋糕、酥饼等均属糕点,约有3000多种花式。但大多数糕点都是以现做现卖或前店后场的加工模式,微生物是其品质的最大拦路虎,即菌落总数、大肠菌群、霉菌三指标超标。对于消费者它是影响食用安全的重要因素,对于生产厂家它是影响企业利润及品牌信誉的重要因素。由于糕点产品的保质期短,等政府在市场上抽检出微生物超标,产品基本卖完,即使追究企业责任可对消费者的伤害已不可挽回。所以说食品产业是道德工业,生产环节是食品微生物控制的重中之重。
历年来关于烘焙行业的抽检中,微生物污染问题一直是严重问题。如今春季到了,在这种暖湿的天气情况下,特别容易使糕点类食品的菌落数超标,这种天气情况给了细菌滋生更多的空间,所以,糕点类的生产企业需要做好一定的安全工作,防止这种情况的发生。
糕点是我国的传统产业,控制内源性污染比较容易。如何控制外源污染,在糕点生产过程中通过蒸煮或烘烤的方法进行熟化,改变了微生物生长繁殖的内外部条件,从而控制微生物消长。据此分析,糕点受微生物污染的关键危险点在于冷却和包装阶段,而此阶段是难以预防的空气途径污染,难道真的束手无策吗?
在安全工作中,最为主要的就是要采用更加安全高效的消毒灭菌方式对整个糕点的生产过程进行有效的消毒灭菌。但是糕点类的食品的消毒灭菌工作有其独特性,不能简单的采用化学喷洒的方式,采用添加剂防腐剂的方式也被业内称之为一把“双刃剑”。那么,该采用什么样的方式才能对整个糕点的生产过程都进行有效的消毒灭菌呢?动态消毒灭菌技术以其消毒灭菌的不间断性,被很多食品企业所广泛采用。据上海康久消毒技术有限公司工程师周立法介绍,这种消毒灭菌技术的杀菌原理是通过特殊的脉冲信号使NICOLER发生腔产生逆电效应,生成大量的等离子体。在负压风机的作用下,污染空气被抽进发生腔内,带负电细菌被分解击破,整个杀菌过程只需0.1秒,再经药物浸渍型活性炭等组件二次杀菌过滤后,受控环境保持在“无菌无尘”标准。由于在对车间消毒时,人可同时在车间内工作,所以,该杀菌技术也可称作为“食品动态杀菌机”。
一、微生物检验过程的特殊性
相比理化与仪器分析实验, 食品微生物检验过程具有自身的特殊性。对食品中微生物的检验需要有专门的仪器和设施, 并且负责进行操作必须由受过专门知识技术培训的工作人员, 其中的技术手段和要求也与其他检验不同[3]。
㈠生物检验具有时效性
食品生产为保证食品的食用安全, 常采用不同的手段对食品中微生物威胁和污染进行控制, 以达到延长食品保质期的效果。但是为了保证食品的口感、新鲜程度和营养价值, 许多食品要求尽快地转入消费者手中, 并且由于微生物繁殖速度快、食品成分多样, 长时间存放难以保证食品的安全。微生物检验工作中包括许多限量指标的检验项目, 如菌落总数、乳酸菌总数、大肠菌群计数、真菌和酵母计数。这就要求食品微生物检验工作及时准确, 一方面送检或抽检样品要在短时间内开展工作;另一方面实验操作过程中要求检验人员的熟练、迅速。
㈡微生物种类多样
微生物在食品生产中有着重要的地位, 如酸奶中乳酸菌也会对食品造成污染, 危害健康。不同微生物间差别细微, 但作用与危害却明显不同。这就首先要求食品微生物检验人员具有过硬的专业知识和丰富的经验。其次在检验过程中通过对不同方法分离培养, 反复验证, 这些过程至关重要。
㈢食品微生物污染来源广泛
在对食品的污染方面, 微生物无论是从原材料、生产加工、储藏运输或是市场流通过程中, 都有可能造成危害。并且在这些环节中, 产品污染程度各不相同[3]。食品微生物检验过程中, 需要了解和掌握微生物污染来源的情况, 以便于检验结果的科学性。
二、食品微生物检验过程影响检验质量因素分析
㈠待检样品的准备工作
一是确保待检样品的完整性, 一般为包装完好的正常食品。其中散装样品包装保证样品不会受到空气、手直接接触等造成的污染。二是待检样品应保证缩短存放时间和应具备良好的存放条件。微生物对食品污染程度各不相同, 繁殖速度快导致实验结果的不确定性。
㈡环境设施、人员的灭菌消毒处理
良好的环境条件和实验室设施是食品微生物检验质量的重要保证。实验室环境灭菌处理保证无菌室空气环境的无菌效果, 包括洁净区、工作台达到无菌状态的要求。空气中充满的微生物的通过空气作为污染样品的媒介而成为重要的污染源。
㈢实验操作人员消毒处理
人体本身是微生物的污染源和传播媒介, 其中包括实验操作人员的头发、皮肤以及穿着和饰品。同时人员进入洁净区的携带物, 在未消毒灭菌处理的情况下也是重要的污染源。
㈣实验用设备处理
实验用培养基、材料器皿、仪器的不正确处理会直接对样品造成污染, 导致实验事故的发生。一般通过干热灭菌、高压蒸汽灭菌等方法可以有效消除这些因素的隐患, 但是为确保灭菌效果, 必须保证灭菌设备的工作状态和稳定性。
㈤实验过程中注意事项
实验操作过程不应发生操作人员的操作手法不当、操作时间过长以及对实验方法掌握熟练程度不足等情况。实验操作过程中过度频繁重复操作以及时间过长, 将不能保证检测结果的准确性。实验操作过程中应注意的一些常见问题。如培养基温度、划线接种手法以及试验用器材在操作过程中的消毒等[4]。
㈥检验结果处理
检验结果处理后及时记录, 实验原始记录满足反应信息量的要求, 并且具有溯源性问题[5]。
三、质量控制方法分析
为保证待检样品的完整性和稳定性, 对样品应检查后在短时间内完成检验工作。例如豆腐、酿皮等食品在一定时间后污染程度增加。按照GB4789.2-2010中菌落总数测定方法进行实验比对分析[5]。将附近市场随机抽取干净、完好器皿内放置的豆腐样品并分为三组, 每组两个样品。第一组在常温过夜12小时后检测;第二组将豆腐样品放入冰箱保持4℃并过夜12小时后检测;第三组检测过程在最短的时间内完成。经严格按照国家标准菌落总数测定, 同一人员相同检验环境下操作, 检验结果如下:第一组两个样品结果分别为55000细菌菌落总数/克、18000细菌菌落总数/克;第二组结果为2600细菌菌落总数/克、1000细菌菌落总数/克;第三组结果为1900细菌菌落总数/克、810细菌菌落总数/克。通过以上比对不难看出, 不同存放时间和条件下样品检验结果有明显差异。缩短存放时间和具备良好的存放条件能够较好解决待检样品完整性和稳定性的问题, 减小检验结果的误差。
㈠实验无菌间可通过整体设计来保证实验环境的洁净度
每次实验前实验室环境用紫外灯灭菌应大于20分钟, 主要用于空气环境和物品表面的灭菌。无菌间内空气灭沉降法定期做效果验证, 可每隔3个月做一次并做相关记录。实验前后用消毒剂擦拭工作台面[6]。消毒剂可选用75%酒精、0.05%~0.2%苯扎溴铵 (新洁尔灭) 等, 但应注意微生物对化学试剂易产生抗性, 应定期更换消毒剂, 避免长期使用。市售或自配的各种消毒液尽量选择长时间储存和温度变化中稳定的试剂。无菌间应严格控制进入的人数, 操作人员尽量减少出入的次数, 而对临时外来人员进入无菌间前应进行相对应的指导, 并进行登记, 在专业基础的实验人员监督下工作。
㈡试验操作人员进入无菌间注意事项
实验操作人进入无菌室前员必须穿带专用的帽子、口罩、拖鞋、工作服并放在无菌间的缓冲间内, 进入无菌室前手部需清洗, 并用用75%酒精棉球消毒后进行检测工作。实验人员应随时保持个人清洁和不携带个人物品进实验区, 手在消毒之后, 不再接触容易造成污染的物品, 不裸手直接接触样品和药品, 特殊情况有需要者应及时消毒。
㈢仪器设备的灭菌过程
对于实验用培养基、材料器皿、仪器设备的灭菌过程中, 干热灭菌适用于耐高温但不宜用高压蒸汽灭菌法灭菌的物品, 如玻璃器皿、金属容器等, 而高压蒸汽灭菌应用广泛有效, 适用于大多数试验用物品的灭菌。定期检查灭菌用仪器设备的工作情况并做保养, 高压灭菌器每次灭菌加入灭菌效果测试条以保证灭菌效果。已经配好的培养基, 必须立即灭菌, 并冷却至所需温度, 长时间保存在高压灭菌器内容易影响培养基的选择性和营养成分。在灭菌温度的控制上严格把关, 防止灭菌不彻底造成的实验结果错误。
㈣微生物实验操作的整个过程要保证严格的无菌操作, 防止样品在操作过程中的污染
样品处理时, 一般瓶装样品在处理时可以用点燃的酒精棉球灼烧瓶口, 达到更好的效果。袋装及盒装样品应用75%酒精棉球对袋口和盒口消毒后剪开包装检验。检样时操作速度快、操作稳, 避免不必要的工作, 熟练的完成检验项目。培养基的倾倒温度控制在45℃左右并加入15毫升~20毫升, 倾倒完成后轻轻摇动应使培养基与样品稀释液液充分混合, 避免培养基结块和未冷却凝固的情况下倾斜、翻转培养皿。划线接种等操作揭开培养皿的角度尽量小, 以保证不遭到空气污染。实验操作中保持台面的清洁整齐, 方便、快速地完成实验操作过程[6]。
三、总结
随着食品安全领域的不断发展, 对食品检验要求也不断提高。在食品微生物检验工作不断进步的过程中, 对食品微生物检验过程中的质量控制, 确保提高食品及微生物检验结果的准确程度, 以进一步保障食品的安全卫生。
参考文献
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[5]胡巅.关于食品卫生微生物检验方法若干问题的探讨[J].中国卫生检验杂质, 2002, ⑹.
食品微生物检验质量控制概述
微生物检验主要内容。食品微生物检验主要含两个方面:食品污染程度指示菌检验和食品中致病菌的检测。针对前者,菌落总数是衡量食品和生活饮用水污染程度的重要指标,对食品以及生活饮用水检验时要在一定条件下对样品进行处理和培养后检验出菌落个数,以细菌总群和大肠菌群为主;而针对致病菌,则包括金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、沙门氏菌等致病菌类的检验与测定。
质量控制。质量控制是食品微生物学实验室为了保证检验结果实事求是地反映客观存在而建立的操作程序体系。食品微生物学的质量控制是保证食源性致病菌的培养、分离、鉴定及血清学试验等的准确性,避免因操作变化导致检验结果错误。
食品微生物检验的方法
选择正确的检验方法是保证微生物检验质量的前提。选用了错误的检验方法很可能会导致结果产生重大差异,因此取得样品后检验人员首先应做的是确定所采取的操作标准是否正确有效,再此基础上再严格执行,进行检验。目前我国采取以检验食品中微生物含量的方法主要有:电阻抗法;运用快速酶触反应及代谢产物的检测;采用分子生物学技术进行检测;采用免疫学检测技术对细菌抗原抗体进行检测。从中可以看出我国通常使用的检测手段一般基于目的性微生物的有效培养进而确定食品是否被污染。由于所得检测结果均需配备专业展开计算作业,如此一来,会耗费大量时间,形成一定误差问题,直接影響到结果准确性。规模较小的企业会因为资金限制难以自行检测因此只能在生产后送达相关部门进行,由此一来,保质期较短的食品在等待结果的过程中变质。
食品微生物检验的质量控制
质量控制是确保检验结果准确的重要保证,该过程受到多因素影响,如实验操作人员、样品质量、实验设备和实验环境等均可能导致结果出现偏差,因此应从影响质量控制的因素人手,逐个分析并进行严格控制,由此保证食品微生物检验的正确性。
检验人员。食品微生物检验工作中有很多需要专业知识储备充足、经验丰富、技术高超的检验人员来完成的步骤,这不仅要求该人员具有一定主观判断、分析能力,还需要其能够做到工作认真严谨、操作细致、讲究卫生,条件非常严苛。
为在人员这一基础要求上达到标准,检验机构应在挑选之初便严格要求,对所有检验人员进行上岗前培训,不仅熟悉基本知识,还要使其熟悉相关法律法规和先进仪器等的使用规程,同时定期进行专业知识和操作能力的考核,提高并保持检验人员队伍的高素质。
仪器设备与试剂。检验仪器和设备也是影响食品微生物检验的要素,大型微生物实验室的主要仪器及设备包括:高压灭菌器、干热灭菌器、无菌室、显微镜、培养箱、微生物自动鉴定仪、微生物快速初筛仪、菌落计数器、离心机、蒸馏设备、洁净室(超净工作台)、酶标仪、水浴箱、冰箱、厌氧箱、洗板机等。检验人员应该严格遵守操作规程,严格按照要求去操作,同时对每台仪器设备进行建档、详细记录其使用、保养、维修等情况,并进行科学保管、定期检查,由此才能从根本上保证微生物检验结果的准确性。例如,显微镜使用后用擦镜纸擦拭镜头的油,再使用沾有二甲苯的擦镜纸擦拭,最在用干净的擦镜纸擦干;对于干热灭菌器,放人其内的器皿不宜过于拥挤,器皿与底板不可直接接触。灭菌完毕后须先关闭电源且等待温度降至室温才可以开门取物,带有纸包装的物品灭菌温度不能超过160度。仪器设备是微生物检验过程中样品所接触到的环境,而培养基和试剂则是关系微生物生长、分离等变化过程的重要条件。培养基的配置将直接影响微生物生长,因此检验人员需严格按照相关说明配置试剂进行实验,注意时间、温度等因素,观察其变化,并做好记录。检验人员应对保存的试剂进行定期清点,注意其有效使用期限和最佳保存方式,撤去不合格试剂。
检验操作的质量控制。在操作过程中,检验人员必须严格遵循无菌操作的要求。样品采集在食品微生物检验工作起到十分重要的作用。采样时应注意提前清洗、干燥采样,并经过一系列灭菌处理,基于无菌环境条件严格根据相关标准完成样品采集操作,同时将标签贴在已经采集好的食物样品上。检验食品微生物时,建议选用对照品对比样品试验过程与成果,让所得检验工作结果拥有较强可靠准确性。收到样品后,实验室应检查实际样品与标签是否相符,当其不符合时间、温度、运输条件等影响样品微生物检验准确性时则拒收样品,对于合格样品须及时进行检验。检验人员在进行检验的过程应动作轻快,既保证工作质量,确保检验准确性,同时也防止致病菌扩散。
检验报告。实验过程中应真实、及时、清晰、准确地进行记录数据,当实验结束后,需对原始数据进行整理和分析,排除误差,编制报告。报告应主题明确,书写清楚,表达得当,而且严格的复查必不可少,最后还需相关人员在报告上加盖公章,由此报告才具有实际意义,兼具科学依据和法律依据。
食品微生物检验的质量控制工作至关重要而且过程繁琐,对人员、仪器、环境等等都有极高要求,目前我国对此仍无统一规范标准,因此其质量控制工作进行艰难,这需要食品质量检测部门设身处地为人民健康着想,做好监管工作,为人民生活提供保障。
廖国东
(茂名市疾病预防控制中心,广东茂名 525000)
【摘要】 目的 探讨疾病预防控制机构微生物实验室质量控制的重要因素和关健环节,最大限度地避免实验误差,确保实验结果及时准确和客观公证。方法 采用回顾性分析方法,对影响疾病预防控制机构微生物实验室实验结果的重要因素和关健环节进行总结和分析。结果 拥有充足优秀的实验人员(人)、配备先进优良的实验设备(机)、应用标准科学的实验方法(法)、建设规范安全的实验环境(环)、使用合格优质的实验材料(料),加上对实验全过程的规范控制(过程控制),则可以确保实验结果及时准确和客观公证。结论 “人、机、法、环、料+过程控制” 的“5+1”是疾病预防控制机构微生物实验室质量控制的重要因素和关健环节。
【关键词】疾病预防控制机构;微生物实验室;质量控制
疾病预防控制机构微生物实验室是疾病预防控制工作中一个十分重要的技术支持部门,主要承担着各种突发公共卫生事件的应急检验、传染病监测检验、食品及环境卫生微生物检验、医疗及托幼机构消毒效果监测检验、生活饮用水监测检验等任务[1],所出具的检验结果是卫生行政执法、疾病预防控制工作的重要基础和参考。如此重大的意义决定了疾病预防控制机构微生物实验室必须时刻注重实验室的质量控制工作,确保实验结果及时准确和客观公证。本文就是通过对影响疾病预防控制机构微生物实验室实验结果的重要因素和关健环节进行总结和分析,为各级疾病预防控制机构微生物实验室的质量控制工作提供参考。材料与方法
依据ISO/IECl7025:2005《检测和校准实验室能力的通用要求》[2]、《实验室资质认定评审准则》(国认实函[2006]141号)、《食品检验机构资质认定评审准则》(国认实[2010]49号)[4]的相关要求,结合本中心微生物实验室的质量控制工作进行回顾性总结和分析。2 结果
2.1 实验人员条件
2.1.1 客观方面 微生物实验室专业技术人员过硬的检验水平是保证实验结果准确可靠的
[3][作者简介] 廖国东(1974-),男,大学本科,医学士,副主任技师,主要从事微生物检验工作。重要条件。因此,疾病预防控制机构微生物实验室应根据工作需要, 从专业、学历和职称等方面合理配置足够的检验人员,满足实验的要求,如果承担了食品检验任务的疾病预防控制机构的食品检验人员还应是只能在一个食品检验机构中执业[4],不得同时在其它食品检验机构中兼职;所选用的实验人员应该是正规医学院校检验相关专业毕业的学生,较好地掌握了英语、生物化学、环境生物学、医学生物学、医学微生物学、医学免疫学、医学寄生虫学等医学知识;检验人员上岗前应经过专业化的检验技术和操作技能培训,并经考核合格后持证上岗,上岗后还应有不定期接受继续医学教育、参加学术交流会、专题讨论会等外出学习交流和培训提高的机会。
2.1.2 主观方面 疾病预防控制机构微生物实验室的检验人员应有高度的责任心和严谨务实的工作态度,认真对待每一次实验和每一份标本,最大限度地避免实验误差, 确保检测结果客观公证、准确可靠;此外,检验人员还应不断提高自学能力,通过岗位自学如及时研读近期专业学术期刊和专业书籍等途径及时了解微生物检验领域的新进展和新动态,更新和掌握微生物检验新知识和新技术,并应用于实际工作中。2.2 实验设备配置
2.2.1 合理配置所需的仪器设备 先进优良的实验设备是微生物实验室实现检验工作的基本硬件要求。随着医疗器械研发水平的不断提高,越来越多的检测设备进入了疾病预防控制机构微生物实验室,疾病预防控制机构微生物实验室的检验手段已经从以前的主要依靠手工操作发展为以手工操作结合先进优良的检测设备来实现检验工作。目前,疾病预防控制机构微生物实验室最常用到的仪器设备有恒温培养箱、二氧化碳培养箱、冰箱与低温冰箱、高压蒸汽灭菌器、生物安全柜、实时荧光PCR扩增仪、蛋白印迹仪、流式细胞仪、高速冷冻离心机等。因此,疾病预防控制机构微生物实验室应根据本辖区的实际情况和检测工作的需要正确配置所需的仪器设备,以满足当前疾病预防控制工作的需要,特别是要满足食物中毒、传染病疫情等突发公共卫生事件应急检验的需要。
2.2.2 加强仪器设备的管理 随着政府和社会对疾病预防控制工作的重视不断提升和经费投入的不断加大,疾病预防控制机构微生物实验室所拥有的各种实验仪器设备也越来越多。为了确保这些仪器设备能正常运行和高效地为实验工作服务,应加强实验仪器设备的管理工作,对影响实验结果的设备要进行有效的控制,包括建立仪器设备档案、确定仪器设备保管人、制作仪器设备操作规程(SOP文件)或作业指导书、加贴仪器设备状态标识、规范仪器设备使用和维修的登记、对仪器设备进行检定/校准和定期维护等。2.3 实验方法应用
2.3.1 尽量应用标准检验方法 疾病预防控制机构微生物实验室出具的检验报告是具有一定的法律效力的,因此疾病预防控制机构微生物实验室应优先选用现行有效的国家、行业、地方、企业标准中规定的检验方法,并对这类标准检验方法进行学习和受控,编制标准操作规程(SOP文件),在实际工作中严格按照标准检验方法及其标准操作规程(SOP文件)开展实验工作。
2.3.2 非标方法应进行验证和审批 有部分实验工作确实没有现行有效的标准检验方法时,可从知名的技术组织或有关科技文献、权威期刊公布的方法中选择合适的方法,或者自行研制实验方法。但这类方法在开始正式使用之前应按相关程序对该方法进行准确性和精密度的验证和鉴定,并经机构学术委员会和质量管理部门的审批同意,再经过对方法进行一定样本数量的预实验,证明实验室能够重复试验中的指标才可使用, 并要及时告知被检方,从而保证得到可接受的检测结果。2.4 实验环境建设
2.4.1 建设规范的生物安全实验室 随着我国疾病预防控制机构改革事业的推进,特别是随着我国各种重大传染病监测力度的不断加强,如艾滋病监测、流感监测、手足口病监测等,我国疾病预防控制机构微生物实验室已经面临越来越多的高生物危险性标本,这就要求疾病预防控制机构微生物实验室必须建设规范的生物安全实验室,实验室的总体布局和各部位的安排要充分考虑减少潜在的对样本的污染和对人员的危害,实验室内部设置明显的分区(污染区、半污染区、清洁区)标识,采取有效的隔离措施防止交叉污染,确保标本、实验人员和外环境的安全。
2.4.2 规范实验室的管理 根据工作流程和实验要求对实验室进行规范化管理,室内温度控制在 18∽26℃, 相对湿度控制在 45∽65%,每天进行记录;利用沉降法定期监测无菌室或洁净实验室的空气洁净度及紫外线强度,并要进行消毒效果监测,以保证符合样品检测所需的环境要求。当无菌效果监测不合要求时, 应立即采取有效措施进行彻底消毒, 直至检查后达到要求为止,同时,在此条件下的检测结果视为无效结果, 应重新安排检测。2.5 实验材料选择
2.5.1 选用合格的供应商 实验材料是开展各种实验活动和必需物资,其质量的优劣会直接影响到实验结果的准确性,疾病预防控制机构微生物实验室需要用到的实验材料种类非常多,包括各种培养基、增菌液、诊断血清、染色液、生化及免疫试剂、标准菌株、样本容器、试管、一次性吸嘴、一次性手套等等。这些实验材料的生产厂家多、材料质量好差掺杂,稍 有不慎就会造成错误的实验结果。所以对实验材料的选择必需谨慎和严格,一定要选择合格的供应商,选择的原则是国内外知名品牌和市场信誉度高的产品、有质量保证能力和服务保证能力的企业,并且要求供应商应出具三证资质证明(许可证、注册证、经销证)。2.5.2 加强实验材料的验收 验收人员在验收实验材料时, 应仔细核对实验材料名称、数量、规格、批号、生产日期、保质期及密封状况等,做好入库登记手续。对于一些特殊的实验材料还应进行相关的验收试验,如革兰氏染色液应分别用革兰氏阳性和阴性标准菌株进行染色试验;诊断血清除了要检查其透明度与色泽是否与标准相符外还要采用已知阳性及阴性菌株测试其敏感性和特异性;对各种生化试剂和培养基(分离培养基、选择培养基、鉴别培养基、增菌培养基、显色培养基等)应选用已知特性的标准菌株分别进行性能试验, 符合要求者才可使用。此外,实验材料还应按各种实验材料的保存要求妥善规范保存,如避光、低温、干燥等;培养基或试剂盒一旦打开使用, 应及时记录开启日期,使用过程如发现培养基结块、变色则不能使用。2.6 实验过程质量控制
2.6.1 样品的采集和流转 实验开始前应按实验项目的要求正确采集样品,并规范保存和运送,否则会对结果造成很大的影响。疾病预防控制机构微生物实验涉及的样品种类有食品、血液、粪便、咽拭子、空气等,有些项目对标本是有特殊要求的,如进行艾滋病CD4检测的血液样品在采集时应使用抗凝剂且不能在冰箱保存、培养脑膜炎双球菌的样品应在室温下运送和保存等等,只有熟悉各类样品的采集方法和保存方式,才能确保下一步的实验能顺利进行下去。
2.6.2 实验及实验原始记录 要严格按照微生物实验的各项标准化操作规程进行实验,不得随意改动操作程序;严格进行无菌操作, 避免实验环境中微生物污染,并要做好生物安全防护;实验前认真核对样品送检单和样品编号;通过对照(包括空白对照、阴性对照和阳性对照)对PCR等分子生物学实验和血清学试验结果进行质量控制,绘制室内质控图,并对质控图进行分析以指导和改进工作;进行细菌学实验的同时用标准菌株进行质量控制。实验过程应详细书写实验原始记录,记录的信息包括样本的情况、检测项目、检验步骤、检验结果、检验人、检验开始和结束日期、所用仪器设备、试剂、环境温湿度等,以保证在必要时可以再现检测过程。
2.6.3 数据处理及报告核发 实验数据出来后应按规范进行科学的处理,包括引用正确的计量单位、有效数字的正确修约及平均值的计算等;实验报告在发出之前要经过复核, 复核内容包括检测人员是否按规定进行对照试验、原始数据及导出结果是否正确、阴阳性结果 [5]是否发生偏离、原始数据记录是否准确清楚等,校核无误后, 实验室应及时编制、出具实验报告。
2.6.4 实验资料归档 全部实验结束后,应及时将采样记录、实验原始记录、留底报告等有关实验资料整理归档,按相关规定条件和期限保管。
3.讨论
实验室质量控制是一项十分艰巨的工作,特别是对于疾病预防控制机构微生物实验室而言,由于其主要从事的是产品、公共场所等样品的卫生指标菌检验以及传染病监测和突发公共卫生事件中相关病原微生物的检验工作,所出具的实验结果是卫生行政执法、突发公共卫生事件有效应对的重要技术支持和依据,具有一定的法律效力,因而疾病预防控制机构微生物实验室必须不断加强实验室的质量控制工作,确保实验结果及时准确和客观公证,这样才能确保有关卫生行政执法能够顺利实施和确保突发公共卫生事件的有效应对。实际上,在疾病预防控制机构微生物实验室的工作中,影响实验结果质量的因素是很多的,本文所讨论的“人、机、法、环、料+过程控制” 这六方面是任何一个微生物实验室都必须认真抓好的质量控制工作中的最基本的也是最关键的要素,只要这六方面做好了,整个实验室的质量控制工作也就上档次了。
[参 考 文 献] [1] 刘晓明,潘明亮.在经济欠发达地区建设卫生检验中心实验室的设想[J].国际医药卫生导报,2005,11(9):124-125.[2]《检测和校准实验室能力的通用要求》(ISO/IECl7025:2005).[3]《实验室资质认定评审准则》(国认实函[2006]141号).[4]《食品检验机构资质认定评审准则》(国认实[2010]49号).[5] 臧格,彭俊云,梁国明,等.细菌检验室间质评工作体会[J].国际医药卫生导报,2004,10(24):78.附:作者通信地址:广东省茂名市茂南开发区天桥路318号(邮政编码:525000)
作者联系电话:***
和动物健康的影响及其检验方法与指标的一门学科。
2.食品微生物检验指标:(1)菌落总数:指食品检样经过处理,在一定条件下培养后1g[1ml或1cm2(表面积)]检样中
所含细菌菌落的总数。(2)大肠菌群:指一群在37摄氏度培养24小时能发酵乳糖、产酸、产气,需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。(3)致病菌:即能够引起人们发病的细菌。
3.ICMSF取样方案:A.三级法 用做菌落总数和大肠菌群;B.二级法 用做致病菌。根据食品危害程度和 指标严重程度划
分。
4.美国FDA取样方案P69自已画图
5.样品可分为大样、中样、小样。要准确区分。大样指一整批;中样是从样品各部分取的混合样,一般为200g;小样又称
为检样,一般以25g为准,用于检样.6.食品常用的采样方法:(1)液体食品:充分混匀,用无菌操作拆开包装,用100ml无菌注射器抽取,注入无菌盛样容
器。(2)半固体食品:用无菌操作拆开包装,用无菌勺子从几个部位挖取样品,放入无菌盛样容器。(3)固体样品:大块整体食的代表性,小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品,放入无菌盛样容器(4)冷冻食品:大包装小块冷冻食品按小块个体采取,大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻快上锯取样品,也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品,放入无菌盛样容品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取,割取时应兼顾表面与深部,注意样品器(5)若需检验食品污染情况,可取表层样品;若需检验其品质情况,应取深部样品。
7.样品的制备是指对所采集的样品再进行分取、粉碎以及混匀等过程。制备的方法可以根据被检食品的性状和检验要求,采取剪碎振摇法、捣碎均质法、胃蠕动均质法、研磨法等。
8.检样处理:25+225 做成一个均匀的1:10的10倍递增稀释液。
9.菌落总数的测定:自已画示意图
菌落总数检验程序水样
做几个适当倍数的稀释度
选择3个适宜稀释度,各取1ml加入到灭菌平皿内
每个平皿内加入45摄氏度左右的适量琼脂
(36+-1)摄氏度(24+-1)h
菌落计数
报告
10.大肠菌群的检验:自已画示意图大肠杆菌为革兰氏阴性菌
(1)检样的处理(2)初发酵(3)分离培养(4)证实实验(5)报告:查MPN表
11.致病菌的检验:自已画示意图
(1)沙门氏菌的检验:沙门氏菌为革兰氏阴性菌
A.增菌:冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。B选择性增菌C分离D生化实验E血清学检验
(2)金黄色葡萄球菌的检验:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌
一、明确课程地位与目标
课程是实现教育目的的重要途径,是组织教育教学活动最主要的依据,也是集中体现和反映教育思想和教育观念的载体,只有明确了课程的地位与目标,才能有效推进课程建设与改革。
二、分析教学实践中存在的问题,寻找教改切入点
高职食品药品微生物检验技术没有对口的教材,即使相对对口的.《食品微生物检验技术》一书,其内容安排也过于强调知识传授的完整性,并没有直观反映微生物检验的实际工作过程,因此淡化了岗位能力和素质的培养,这对当今社会强调实用技能,强调知识创新等素质教育不能同步,与当前微生物检验工作实际需求脱节,难以适应社会的发展需要,因此急需对该课程的教学模式、教学内容、教学方法进行建设与改革。
三、理清课程建设与教学改革的思路
针对传统教学中存在的诸多问题,我们于进行了课程体系改革的初步探索,邀请生产一线的行业专家举行以岗位任务引领的头脑风暴论证会,讨论课程体系改革的可行性,并在行业专家引领与指导下,在食品药品检验技术专业教学领域的广泛调研基础上,理清课程建设与教学改革的思路,以“食品药品微生物检验专业工作任务与职业能力要求”为依据,打破以知识为主线的课程模式,转变为以能力为主线的课程模式。
四、实施课程建设与改革的主要措施
1.加强师资队伍建设,提高教师的整体素质
2.精心设计教学内容
(1)精心设计课程内容;(2)精心安排教学内容。
3.尝试多元化的教学方式,提高教学质量
教学改革的根本目标就是提高教学质量,而教学质量应当具有时代性、实践性和科学性。(1)充分利用多媒体,增强教学手段的功能性和先进性;(2)充分利用网络资源,提高学生学习兴趣;(3)创新教学方法,强化学生在“教”与“学”中的主体地位。
4.强化实践教学,加强实验课的教学指导
(1)重视实践教学环节的设计;(2)编写实用性实验实训指导书;(3)加强实验课的教学指导。
5.改革课程考核方式,实现课程考核全程化。
项目来源:嘉兴职业技术学院重点建设课程(项目编号:jx01010209)。
关键词:食品,微生物检验,质量控制
食品安全与我们每个人息息相关,是我们生活中必不可少的一部分。只有保证食品供给的安全,才能够保证人们的健康。
1 我国食品微生物检验的质量控制出现的问题
1.1 我国食品微生物检验中质量控制不完善的问题
食物中毒多是由致病性微生物污染食品引起,食源性疾病和食物中毒是影响人民群众身体健康甚至生命安全的重要事情,受到大家的广泛关注。微生物性食物中毒大多是胃肠道方面的症状,经常有发热的症状,但是有较长的潜伏期。微生物性食物中毒大都是因为使用常规的方式加热,但是这样做并不能够使食物中的毒素得到清除。在目前的情况中,食源性疾病爆发和食物中毒事故大部分是由致病性微生物污染食品引起的,食用有毒动植物,主要是食用未煮熟的四季豆和油豆,化学性食物中毒并不多。因此,如何完善我国食品微生物检验中的质量控制,成为重要的话题。
1.2 我国微生物检验的质量控制检测手段不完善的问题
在食品安全中,食物的各种卫生检测的标准是通过微生物检验的质量控制方式。对于我国的食品问题,大多使用微生物检验的质量控制进行检测,这个检测方式一般是通过培养有目的的微生物的方式来确定食品有无污染的情况。在不同情况下,培养时间也是不同的,都是相关人员在一定的条件下进行的。但是检测结果需要由专业人士进行计算,这样不但要花费大量的时间,而且也会产生一些误差,对结果的准确性造成影响。一些规模不大的企业,受到企业的规模和资金限制,不能自己进行检验,只能在食品生产后,在最快的时间内将其送到相应的部门进行检测,但是得到检测结果的时间一般比较长,例如一些保质期较短的食品可能会发生变质的情况,这会给企业带来巨大的损失。
2 我国食品微生物检验的质量控制的改正方案
2.1 提高检验人员的水平
提高检验人员的水平是完善我国食品微生物检验的质量控制的有效手段之一。检验人员要经过专业部门的相关技能培训后,符合要求才能够获得工作资格。微生物检验不能完全依赖全自动鉴定仪器,检验工作中每个步骤均需要有高度的主观分析和判断能力与个人技能和微生物检验的基础知识水平有着很大的关系。对于微生物检验人员不仅要有严格认真的工作态度、精密细致的观察力和娴熟的操作技巧,还要保持个人的卫生问题。为了更加准确地应用微生物学检验,检验人员在上岗前要进行培训,并且积极参加各种有关培训,相关讲座,不断地自我完善,学习新方法,新概念,掌握国家最新的动态,了解食品安全的相关内容。并且经常安排检验人员对专业知识的掌握情况和操作熟练程度进行考核,全面提高检验人员的水平。
2.2 加强卫生的管理
在食品微生物检验的质量控制中,要尽量加强卫生的管理。要防止原材料不干净,原材料在进行加工和运输等环节时,都有伴随着被微生物污染的情况,这会对食品安全有很大的影响。所以,我们要认真仔细地对原材料进行筛选,丢弃受到污染的原材料,控制被微生物污染的机会。对于原材料的选择,应挑选那些干净无污染的原材料,在处理时要及时清洗,去除原材料上面带有的杂质和已经腐烂导致变质的部分,在清洗的过程中应使用符合标准的干净无污染的水源。在人口比较多和工业比较发达的地区以及医院附近的水源,含有大量的、不同种类的微生物,这时必须要根据不同的情况对其进行人工净化和消毒处理等严格处理。加强环境卫生的管理也很重要,企业在进行选址建厂时要选在那些远离工业的地方,不应选在周围有污染源或易感染的地方,减少受到污染的情况。在生产过程中产生的污水要通过集中净化设备进行处理,经过化学或生物的方法净化后,清除那些有害的病原微生物,对水源不会造成污染时再排放。对于食品生产的地方的要求更加严格,形成一个干净整洁的环境。食品生产的地方要达到卫生标准,方便经常进行杀菌消毒,并放置一些空气过滤的装置,保持生产地方的空间是干净的。进行生产的相关仪器要定期、定时、有规律地进行清洗和杀菌消毒,保证其干净无污染,防止有害的病原微生物的成长。严格遵守各项规章制度,在生产的过程中要避免食品在空间中暴露的时间过长,工作人员不得未经消毒接触食品,这样可以有效增加食品质量。相关工作人员必须是身体健康,并定期要求相关工作人员进行身体检查,保证没有相关工作人员是病原菌携带者,对消费者健康安全进行保护。同时相关工作人员也要注意个人卫生,经常进行理发、剪指甲、勤洗手、勤洗澡,在工作过程中穿戴的衣物要经常清洗,保持干净,尤其是在工作前后要进行清洗和消毒。食品在储运、销售等环节中,要保证食品不受微生物的污染是非常重要的事情。要注意在食品保存的过程中微生物对食品的污染,可以根据微生物生长发育的各种因素,控制微生物的成长发育。例如,可以对其进行低温保存,在低温下微生物的生长变得缓慢。注意食品在运输过程中的卫生安全问题,防止二次污染的情况发生,因此需要有专门的车辆进行运输,特别是直接供食用的熟食制品,更应有高度清洁的消毒专用车。肉鱼蛋这种容易坏的食品应在具有冷冻设备的条件下进行运输,以防腐败变质。食品运输时要注意生、熟分装,食品与非食品分装,严格禁止食品与化肥、农药等有毒物质同车装运,防止微生物及有毒物质或异味、异气物质污染食品。
了解我国食品微生物检验的质量控制,提高检验人员水平,加强卫生的管理,才能更好地保障食品的安全。只有做好食品微生物检验中质量控制的研究,才能够使食品安全得到保障。
参考文献
关键词:食品 有害微生物 快速检测 防治
中图分类号:TS207.4 文献标识码:A 文章编号:1672-5336(2013)14-0017-02
1 前言
“民以食为天”,食品是人类生存最基本的条件之一。对于食品质量,人们习惯于用食品所具有的、满足用户需要的直接特性去评定它。特别是随着人民生活质量的改善,消费结构的不断变化,对食品工业的发展提出了更多的要求。如果食品质量有问题,给用户带来的不仅是经济上的损失,而且还可能造成生命危险,所以食品的质量更为重要。食品质量的提高将关系到越来越多人的利益。
传统的检测食品中微生物的方法大多数是采用平板计数检测法,这样的检验不仅耗时、繁琐,而且检测结果还会可能因检测过程中某些因素的介入导致检测结果不准确。此外,对于有些食品企业来说,产品在未等到检测结果出来就已经变质了,或者在检测结果出来之前,食品已经销售出去了,这样很可能造成意想不到的伤亡事故。所以,采用一种高度灵敏性、快速、准确、低劳动强度的检测方法可以缩短产品的存货期、减少消费者的损伤、提高产品的质量和信誉,在商业战略上有重要意义。
2 检测方法
对于食品微生物的检测方法,其方法有很多,本文介绍几种目前应用较为广泛而技术成熟的几种检出和鉴别方法:
2.1 生物发光法
生物发光法就是指利用微生物本身所含有的生物物质发光的特点或者其在生长过程中产生的物质所含有的发光特点来鉴别和检出微生物。所用的方法有荧光素酶测定法,这种方法是众多生物发光检测方法中效果最好、最敏感的方法。这种方法所依据得理论基础是ATP在众多生物中存在并包括了微生物的一切活细胞内,因此可以把ATP作为检测有无微生物的最好的标志。而且荧光素酶当镁离子存在时,会和还原荧光素及ATP产生化学反应,形成荧光素镁-荧光素-单磷酸腺苷复合物,当该物遇到氧气时具有发光的特性。光亮的强度大小,决定于在其化学反应过程中荧光素镁、荧光素、氧和ATP的浓度,在全部反应物产生过量时,其发光量、最大光强度与ATP量刑成正比例关系。而且到目前为止应用此技术的生物发光仪器已经被制造出了很多。在发达国家,该方法普遍应用于肉类、饮料料及酒品类的细菌快速检测业务中。
2.2 酶联免疫吸附测定法
这种方法属于免疫酶方法,被大量应用于细菌、霉菌的检测中,其应用领域较为广泛,如在检测大肠菌群,其速度较快,可以在4个小时内就可以得到结果。在检测时,把酶分子和抗原分子结合起来,形成酶标分子,当其与固相免疫吸附剂种相应抗原、抗体或抗抗体相遇时,会产生化学反应,形成酶-抗原-抗体。在加入酶的相应底物,由于酶的催化,会发生水解、氧化和其它反应,形成有色物质,据此可以依据颜色的不同深度,来检测溶液种抗原或抗体的量。
这种方法可以进行定量的特性,起反应敏感度及特异性较高,标记物较为稳定,结果判断较为客观、方便,这些优点使得该方法被广泛应用于各类产品的分析和检测,和常规检测法的相关性超过0.95以上。因此,此种方法已经被广泛商业化,而且随着单克隆抗体技术的发展及免疫试剂盒的广泛应用,这种方法被临床医学、食品分析广泛采用。
2.3 抗阻测定法
这种方法可以较快的检测出不同微生物对不同底物的作用,其检测结果较快,就是说对于含有几种不同底物的培养基种,将检测微生物接种到这些培养基种种,在经过一定时间的培养后,就可以使用阻抗测量仪,在观察培养基种生长状况的同时来鉴别其种、属。
这种方法目前已经被广泛应用于食品质量监测,包括一些特殊食品的病原菌的检测,这种方法在食品检测沙门氏菌方面已经获得AOAC的认可,成为快速检测判断食品微生物的最佳方法。
2.4 气相色谱法
这种方法主要使用气相色谱仪,事先将微生物的细胞进行水解,然后用甲醇进行分解和提取,在进行硅烷化和甲基化等衍生化后,使其分离以便用气相色谱仪进行成分的分析和判断。对于不同的微生物,其色谱峰是相同的,只有个别的峰是特殊的,因此可用来进行微生物鉴定。将之前检测过的各种普通的细菌、酵母菌、霉菌和其它微生物标准色谱进行建库,并存储与电脑中,在检测时将被监测的微生物与存储的标准图谱进行比较,即可很快的鉴定出其种类。
2.5 微生物自动检测法
这种方法,最早见于美国,是麦道保健系统公司发明的一种微生物自动检测方法和系统,其检测的最大特点是和传统的微生物检测方法相比有着明显的优点,不需进行微生物的分离培养和纯化,能够直接从样品进行特殊微生物种类和菌群的检测。
当然随着分子生物学及其它学科的发展,人类还发明了其它微生物检测方法,如DNA探针技术、单克隆抗体(MCB)等,这些新型方法的研究出炉为微生物的快速检测提供了更为广泛的方法选择。
3 展望
随着人们生活水平的不断提高,人们在越来越重视食物营养的同时,也开始越来越关注和重视食品的卫生质量问题。随着科学技术的不断进步,食品工业不断开发出新的产品,所需检测的产品种类也越来越多,对食品检测提出了更高的要求。因此,除了食品工厂要重视生产,重视原料及产品的选择外,还需获得更好的准确而快速的检测方法。因此我国的食品工业还需要重视食品的检测,不断开发和研究高度灵敏、快速而准确、低劳动强度的检测方法,这对于促进我国食品工业的快速发展,提高我国食品工业的竞争实力有着重要意义。
参考文献
[1]张迎雪.荧光检测能快速检测肉制品中的大肠杆菌[J].山东食品科技,2003,(4),36~37.
[2]康虹.啤酒酿造中微生物快速检测法的应用[J].啤酒科技,2003,(10),48~48.
[3]邢应寿.ELISA技术在畜产品安全测试中的应用[J].动物医学进展,2004,25(3),19~22.
[4]周向华.电阻抗法在食品微生物快速检测种的应用[J].粮油加工与食品机械,2003,(10),73~75.
[关键词] 微生物;食品;检验
文章编号:1004-7484(2014)-03-1756-02
微生物污染造成的食源性疾病仍然是世界食品安全中最突出的问题[1]。目前,已经有很多致病菌和水源致病菌。由食源性致病菌,如沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌等引起的病例越来越多。由于食品微生物污染的广泛发生,严重影响人民的健康,因此食品微生物检验工作对评价食品卫生质量,保证消费者饮食卫生有着极为重要的作用,并且研究特异性更强、灵敏度更高、简便快捷的食品安全检测技术和方法,建立和完善食品安全微生物检测技术和体系迫在眉睫。为了更好地开展食品微生物检验和调查研究工作,提高食品的卫生质量,保证消费者饮食安全,本文对微生物的检验技术在食品检验中的研究动向进行详细的介绍。
1 微生物检测技术在食品检验中的特点
1.1 食品微生物检验的范围较广包括 ①引起食品腐败变质的微生物;②经食物传播的病原微生物,是人类疾病病原微生物、畜禽疫病的病原微生物、人兽共患传染病病原微生物。这几类微生物可达数百种;③食品工业微生物,如酿造发酵工业用霉菌酵母等曲种、保健食品中双岐杆菌、乳酸菌等。在食品微生物检验中,采集样品极为重要。因此采样品必须有代表性。
1.2 食品微生物检验需要准确、快速。
1.3 食品中微生物检验具有数量观念。诊断食物中毒仅作定性试验是不够的,还需对致病菌定量检验。
1.4 因为食品中待分离的细菌较少,而杂菌有相对的比较多,所以对待检验的细菌的检验工作就有比较大的干扰。
1.5 对食品中的微生物检验有一定的法律性质。
2 微生物检测在食品检验技术的应用
2.1 电阻抗技术 ①电阻抗法:电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术,已经开始应用于食品微生物的检验[2]。②微量生化法。人们增加了对细菌快速检验的要求,所以高精度和高重现性试剂就有了飞速的发展。现在常用的MICRO—ID、API等。③快速酶触反应及代谢产物的检测。快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶,根据酶的特性,选用相应的底物和指示剂,反应的测定结果有助于细菌快速诊断。④放射检测技术。
2.2 采用分子生物学技术 其又包括两种技术:
2.2.1 核酸探针技术 根据碱基互补的原则,用特定的方法测定标记物。其优点是①特异性;②敏感性。但探针检测技术中也存在一定的问题,如检测一种菌就需要制备一种探针;要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养;探针检测是分析基因序列,对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测。
2.2.2 聚合酶链式反应(PCR)技术 其原理为通过加热使双链DNA经裂解成两条单链,成为引物和DNA聚合酶的模板;然后降低温度,使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火。一般情况下退火温度越高,扩增特异性越好。测定PCR产物的方法较多,如凝胶电泳法、比色测定法及化学发光测定法等。
2.3 采用仪器法 ①流式细胞术(FCM)。用流式细胞仪对细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术,根据FCM检测到的荧光强度强弱与DNA片段的大小成比例,根据荧光浓度的就可以知道细菌的DNA指纹图谱,从而确定细菌的种类。②全自动微生物检测法。其优点在于全自动操作,所有样品的结合、洗涤、基质读数及报告说明等都是全自动操作;快速测定,可以同时对60-480个样品进行分析,并且鉴定时间只需2-3h,这是效率非常高的一个检验系统,并且也是今后食品微生物检验技术发展的一个方向。③ATP生物发光法。ATP生物发光法快速,甚至可以将细菌计数时间缩短至几分钟[3],操作简便、灵敏度高,具有其他微生物快速检测方法不可比拟的优势,曾被称为是检测环境中微生物最方便可靠的方法[4]。④免疫磁性微球。这种技术不仅仅只在医学领域方面得到应用,在食品微生物的检验方面也能见到。由于食品的样品检验多为固液混合体,所以采用常规方法很难将少量的微生物提取出来。⑤电阻电导检测器。这种方法的工作原理是当细菌进行繁殖时,将蛋白质、各种糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机物等相对小一些的物质,在就培养液的电导度进行一定的改变,这样,根据电阻和电导度的变化,就可以计算出被检验样品的含菌数是多少。
总之,我们在对食品微生物检验时要遵守职业道德,严谨科学态度,注意各个环节来确保微生物检验数据的准确性,为食品卫生和安全提供可靠的依据。并且随着现代技术的发展,今后食品微生物检验技术的发展方向会是:①采用快速和大批量的检验方法,来提高检验效率;②形成标准化的实验条件;③提高和保证检验的精度和灵敏度。
参考文献
[1] 王云国,李怀燕.食品微生物检验内容及检测技术[J].粮油食品科技,2010.3.
[2] 张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展[J].现代食品科技,2005,21(2):221-222.
[3] 舒柏华,孙丹陵,王胜利,等.肉类食品细菌污染生物发光快速分析技术研究[J].中国公共卫生,2003,19(4):483-484.
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