蛋白酶

蛋白酶（共8篇）

蛋白酶 篇1

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分离和浓缩，常用的方法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等电点沉淀法等。用新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋白酶，操作简单，产率也较高，但酶的产量与单宁的用量密切相关，而且所含单宁有毒，导致这种方法逐渐被淘汰了。以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋白酶时，酒精的加入量会对菠萝蛋白酶产生较大的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋白酶沉淀下来，浓度太高容易使酶变性失活。酒精的浓度为80%时，酶的收率最高。从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可用于菠萝蛋白酶的分离，用0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝 蛋白酶进行沉淀最多可达78%，其最大沉淀率明显比单宁法高。（2）离子交换色谱法

离子交换色谱层析法是蛋白质研究领域内比较高效的纯化技术，目前国外用于分离菠萝蛋白酶常用的离子交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离子交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离子交换树脂、CM-纤维素阳离子交换柱、Q阴离子交换柱。国内常用的有羧甲基纤维素（CMC）、二乙胺乙基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若干色谱纯化技术联合使用来实现的。Ota最早用SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。用DEAE-52离子交换柱层析结合Sephadex G-75分子筛柱层析色谱法纯化果酶，能 获得比活力为12.5U/mg的单一电泳纯酶制剂。（3）固定化金属离子亲和色谱法

固定化金属离子亲和色谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和足够暴露的金属离子，制成亲和吸附剂，进行分离纯化蛋白质的方法。此法介于高特异性的生物亲和分离法和低特异性的离子交换色谱法之间，对组氨酸基团有特异性。Huali Nie 等（2008）首次应用固定化金属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是一种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，用其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋白酶，可使菠萝蛋白酶纯化 15.4 倍，回收率达 94.6%，而且不会造成任何变性。固定化金属亲和层析技术正逐渐被采用，Pawan Gupta等（2007）将菠萝蛋白酶成功固定在亚氨基二乙酸载体琼脂糖凝胶 6B 型中。Cu2+ 与亚氨基二乙酸（IDA）的络合被用来作为螯合配体将单个组氨酸结合到菠萝酶上。固定化高亲和性载体的制备是试图将可溶性交联菠萝蛋白酶制剂固定到铜-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶上。（4）超滤法

超滤法是在离心力或较高的压力作用下，选择适当孔径的超滤膜，使水和其他小分子物质通过，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超滤法提取酶蛋白，具有无相变、生物活性不易丧失、得率较高，不会改变溶液糖酸比等特点。用超滤法浓缩有机溶剂提取的菠萝蛋白酶产品质量好，对环境污染少，可以实现清洁生产，酶粉得率比高岭土工艺高出47%。超滤法分离提取的粗酶比活力较单宁沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超滤法浓缩提取菠萝蛋白酶需要对操作条件进行研究，尽最大可能提高超滤效果，促进工业化生产。杨辉等研究认为压力差在300kPa，透过液通量为50L/m2·h时即能保持较大的流量，又不会对酶活造成损失。在对菠萝汁进行超滤的过程中，料液透过通量随压力差增加和循环速度的增大逐渐上升并趋于稳定。用超滤法浓缩提取生物大分子时因不同膜材料的透过通量和截留率不同，而导致不同的分离特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜浓缩工艺较适合对菠萝蛋白酶进行超滤浓缩，可使果菠萝酶回收率达93.3%，截留率达97.8%。用PSA膜超滤菠萝皮汁制得的菠萝蛋白酶酶活总回收率为65.7%。李兴，林哲甫用二氧化钛吸附菠萝果汁中的菠萝蛋白酶再用截留值2万和5万的超滤膜超滤浓缩，能获得较高比活的果酶。得到的果酶活力回收率为54%，比活力为911单位/mg。目前将纳米氧化锌吸附、陶瓷膜超滤浓缩和冷冻干燥法结合的综合性技术已达到国际先进水平，创新性较好。(5)双水相萃取法 利用两种多聚物，或多聚物与盐在水相中的不相容性，可以从细胞破碎后的细胞碎片中直接分离、纯化并浓缩蛋白质。该方法的优点是比较温和可在室温下进行，一般不造成酶的变性失活，还可提高其稳定性。与其它分离纯化方法相比，利用双水相萃取法有很多优点，如易于放大、成本低、可以连续操作、并且是环境友好的。这就使其成为分离纯化生物分子的诱人的替代方法，在国外进行了大量的应用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用该法从菠萝中分离纯化菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，结果使菠萝蛋白酶的纯度提高4.0倍，得到约228%的活性回收率。双水相萃取法提供了一种有效的、经济上可行的分离纯化菠萝蛋白酶的方法。在双水相体系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分离纯化菠萝蛋白酶，其活性回收范围为7.5%~79.5%，纯化倍数0.1~1.25倍。在双水相体系中，各种参数如聚合物的分子质量、聚合物和形成相的盐浓度和分离体系的pH对分离纯化的结果影响较大。(6)反胶团萃取法

生物技术的发展为重要生物分子的生产开辟了一条新的途径，在选择性提取的生物分子中，逆胶束有机相很有潜力发展为液液萃取的生物分离技术。反胶团是表面活性剂，使水滴稳定分散在有机溶剂中，这种表面活性剂是双亲性的有机复合物，既亲脂也亲水。反胶团萃取法有如下一些优点：不会造成原有功能或活性的损失、界面张力较低、易于规模化、有连续运作的潜力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲铵/异辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸钠/异辛烷的反胶束体系从菠萝废料的水提物中提取和初步纯化菠萝蛋白酶。用反向阳离子表面活性剂（CTAB）胶束体系能使菠萝蛋白酶获得一个较好的活性回收率可达106%，纯化 5.2 倍，而采用阴离子表面活性剂（AOT）则没有获得较好的产率。(7)新型纳米吸附剂法

随着一种以氧化铁纳米粒子为核心，聚丙烯酸为离子交换组的新型磁性纳米吸附剂的开发，其在生物分离和生物医学领域已经被广泛应用。它具有高的离子交换容量和快速的吸附/解吸率。这种纳米粒子用于菠萝蛋白酶的分离是很有效的。近年来，纳米纤维膜由于其非常大的表面积和体积比、优越的机械性能引起人们的广泛关注，Haitao Zhang 等（2010）通过一步静电纺丝技术以二甲基乙酰胺为溶剂制备出超细聚丙烯腈（PAN）纳米纤维膜，用化学的方法连接到壳聚糖的表面，共价连接到染料配体辛巴蓝上制成染料固定化亲和膜，而且可以重复使用，膜的再生显示出良好的机械性和化学稳定性。这种新开发的染料亲和膜首次用于菠萝蛋白酶的吸附，批次试验揭示出它具有一个很高的吸附菠萝蛋白酶的能力，可以实现高效率的大规模的吸附，这种低非特异性结合的亲和膜对于纯化高纯度的菠萝蛋白酶是很有效的。

供试酶液的制备（纳米二氧化钛吸附法分离纯化效果明显好于高岭土吸附法和超滤浓缩有机溶剂提取法，所得酶的比活力分别是后两者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠萝茎在 4℃冷室中预冷 12h，组织捣碎机捣碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，缓慢搅拌，浸提 10min，4 层纱布过滤，离（4000rpm，15min），上清液即为供试酶液，蛋白质含量为 1.62 mg/mL。（菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上）操作要点：选取干净的菠萝茎，除杂，清水中漂洗三次，沥干，放入 4℃冷室中 预冷备用。预冷后茎用高速组织捣碎机打浆，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸缓冲液浸提 10min，4 层纱布过滤，滤液在 4000 rpm 条件下，离心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中备用。1.纳米 TiO2吸附法

（纳米 TiO2的用量直接影响吸附效果。用量不足，对酶的吸附不完全；用量过多，增加处理和洗脱难度，浪费资源）（超滤过程中会发生浓差极化现象，导致菠萝蛋白酶的损失。在压力较低时，随压力增大，通量呈直线上升，但随压力增大，膜逐渐被压实，浓差极化（膜分离过程中的一种现象，会降低透水率，是一个可逆过程。是指在超滤过程中，浓差极化由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。）现象增加，膜通量增幅变缓。）

供试酶液中加纳米 TiO2搅拌均匀→离心（4000 rpm，15min）→取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱→搅拌（30min）→离心（4000 rpm，15min）→取上清液→超滤浓缩→冷冻干燥→酶制品。操作要点： ① 吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米 TiO2搅拌均匀，吸20~30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。② 超滤：洗脱液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。③ 冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。④ 纳米 TiO2吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复 90%以上。通过正交试验得影响实验效果的因素主次为：纳米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附时间＞吸附温度 高岭土吸附法（高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，酶活总回收率及纯化倍数都较低，投资较大。）

供试酶液→加 4%高岭土，搅 20min，10℃吸附 30~60min→静置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 调 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，搅 30min→压滤，滤液用 1:3（体积比）盐酸调 pH5.0→搅拌→加滤液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃静置过夜→离心→沉淀→干燥（王平诸等，2002）。操作要点：

①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入 4%的高岭土，搅拌约 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用 16%的 NaOH 溶液调节吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附质量为 7%~9%的工业食盐，搅拌 30min 进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，用 1:3 的盐酸调节 pH 至 5.0 左右，搅拌加入压滤液质量 25%的硫酸铵，待完全溶解后，4℃过夜；然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

3.超滤浓缩有机溶剂沉淀提取

供试酶液→超滤浓缩→有机溶剂沉淀→干燥→酶制品。

操作要点：①超滤：供试酶液先用截留分子量为 40KD 的超滤膜除去较大分子量 的杂蛋白，再用截留分子量为 20KD 的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及 其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至 0~4℃，边搅拌边加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为 50%，静置，使酶沉淀，移出上清液，即 为湿酶。

③干燥：将湿酶在 0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。2.4.4.5 离子交换层析条件的确定（D.R.马歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸盐缓冲液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取离子交换树脂 1mL，用蒸馏水充分冲洗，定量到 10mL 悬浆。取 7 个 2mL 离心管，每管加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用上述缓冲液平衡。去掉多余缓冲液。按纳米二氧化钛吸附法最佳条件制得供试酶样品，配成一定浓度酶液。取 1mL 样品与相应缓冲液等量加入离子树脂中，混匀，离心取上清液，测酶活性。离子强度：取 4 支 2mL 离心管各加入 1mL 离子树脂悬浆，分别用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 缓冲液充分润洗 1~4 号试管，使离子树脂与相应缓冲液平衡，去掉多余缓冲液，向各管中加入 1mL 样品及等量缓冲液。混匀，静置 10min，离心取上清，测酶活性。吸附容量：取4支2mL离心管加入同初始缓冲液平衡后的离子交换树脂0.2mL。用离心管处理样品，于1、2、3、4号管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的样品。混匀，离心取上清液，测酶活性。离子交换层析：（1）PH的确定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸盐缓冲液（2）洗脱液的浓度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作为梯度洗脱的上限浓度。（3）吸附容量的测定为保证柱层析效率和菠萝蛋白酶的回收率拟选择 1mL 为最佳吸附容量。

离子交换法的详细步骤.1 离子交换介质处理与转型

用初始缓冲液替换倾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占 75%，缓冲液占 25%），作真空脱气处理备用。2 装柱与平衡

将所有材料和试剂平衡至室温，配制初始缓冲液为 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液（含 0.01%的 EDTA）和洗脱液为 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）。根据试验中柱子（1.1cm×30.0cm）的类型取所需量的凝胶，打开层析柱顶部，关闭出口，用 20mM pH4.0 的醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡。将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡的产生，同时用缓冲液填充柱子的剩余部分。打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液。打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定的流速 通过，稳定柱子。用 3~4 倍柱体积的缓冲液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等时表示已达到平衡。同时连接紫外检测仪，等流出液在检测仪上绘出的基线稳定后平直即可。3 加样

略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。.4 洗脱

加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，开始洗脱，同时连接紫外检测仪，调整横流泵为 1mL/min，同时以自动部分收集器收集，每5min 收集一管，分别测定每管的蛋白浓度及酶活。

二．蛋白含量测定方法

采用考马斯亮兰 G-250 法（George R，1973）测定蛋白质含量：①标准蛋白溶液的配制：称取 10mg 牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的标准蛋白溶液。②考马斯亮兰 G-250 染料试剂：称 100mg 考马斯亮兰 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀释至 1L，过滤后贮于棕色瓶中。③标准曲线的绘制：取 7 支试管，编号后如表 1，混匀，放置 2min后，在 595nm 波长下比色测定（应在 1h 内完成），以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标。根据表 1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 为吸光度，x 为蛋白质浓度 μg/mL。

酶的活力测定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml与15ml的具塞试管中，置于37摄氏度恒温水浴中保温十分钟，准确取一定量的的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀释至1ml，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37摄氏度的恒温水浴中，准确反应10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，终止反应，用力混匀，在37摄氏度恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温于3500rpm离心10min，取上清液于275nm波长下测为其吸光度A。另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得吸光度A0。

蛋白酶 篇2

1 MMPs的基本特点

MMPs是一组锌离子 (Zn2+) 依赖性的内源性蛋白水解酶家族, 几乎可降解除多糖外的全部ECM成分, 参与胚胎植入、伤口愈合、肿瘤转移、心肌重塑和动脉粥样硬化等重要生理病理过程。除MMPs-7外, 均包括3个同源性结构域;①前肽区结构域, 包含一小段约10 kD的信号肽, 引导新合成的酶分泌。同时, 此结构域使MMPs处于失活状态, 其他酶将其裂解后可激活酶。②催化结构域, 包括中心部位的锌离子和与之相结合的3个组氨酸, 促进酶与底物的结合。③C-末端结构域, 包含ECM的蛋白结合位点, 与酶的特异性有关, 各种MMPs特异性的差异就是由于该结构区域的不同而导致的。不同的MMPs都具有以下共同特性:①至少可降解一种ECM成分;②在pH中性环境中活性最佳;③每一分子MMPs需要两分子Zn2+和一分子Ca2+维持其稳定性;④可被其他蛋白酶或有机汞激活, 同时也可被金属离子螯合剂如乙二胶四乙酸 (EDTA) 抑制;⑤均为内肽酶, 能从肽链中间裂解产物;⑥通常以潜酶-抑制物复合体形式分泌到细胞外, 常位于底物附近, 并在细胞外激活;⑦除膜型MMPs外, 其他MMPs均可被相应的金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs) 抑制。

2 MMPs的分类

MMPs可分为2型, 4个亚群[2]。一是分泌型MMPs:此型MMPs以潜酶方式分泌到细胞外, 需蛋白水解酶激活, 包括胶原酶 (MMP-1、MMP-8、MMP-13、NNP-18) 、明胶酶 (MMP-2、MMP-9) 、基质水解酶 (MMP-3、MMP-10、MMP-11) 3个个亚群。二是膜结合型MMPs (MT-MMPs) :包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25。该型MMPs位于细胞膜上, 为ECM蛋白降解提供了特定位置, 并可激活其他种类MMPs (如MMP-2) , 且不受局部TIMPs的抑制。

通过近年的研究, 人们发现:心肌组织中MMPs主要来源于成纤维细胞等非心肌细胞, 其中又以MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、MMP-14与心肌重塑有关。

3 MMPs的活性调控

机体内的MMPs主要受5种形式的调节, 包括转录水平的调节、潜酶的活化、特异性TIMPs的调节、其他抑制因子的调节和负反馈调节。

3.1 转录水平的调节

①大多数MMPs的基因调节序列中, 在-30±2位置中含TATA盒, 此盒之前存在多种转录调节结合位点, 激素、细胞因子可直接与之结合, 或通过诱导C-fos、C-jun等原癌基因表达相应产物并与这些位点结合, 从而刺激MMPs转录。②有的MMPs转录起始部位还有转录因子的多瘤病毒增强子A3 (PEA3) 结合位点, PEA3可与ets基因产物结合, 是一功能性转录元件, 具有调节编码基质降解酶基因转录因子的作用。③MMP-2基因无TATA盒, 其表达很少受原癌基因影响, 属典型的看家基因。④细胞外基质金属蛋白酶诱导剂 (EMMPRIN) 是存在于心肌组织中的一种免疫球蛋白, 也可诱导MMPs基因表达。

3.2 潜酶的活化

MMPs均以潜酶形式分泌到细胞外, 在蛋白水解酶的作用下快速激活和动员, 主要有3种激活方式:①逐级活化:新分泌的MMPs前肽区含有高度保守序列PRCGVPDV, 内有一半胱氨酸残基, 它通过与催化部位的Zn2+相互作用而使酶处于失活状态。一些蛋白水解酶如纤溶酶、胰蛋白酶可将前肽区劈开, 使半胱氨酸与Zn2+分离, 从而暴露出Zn2+活性中心, 即被激活。由于整个过程均是酶活化, 因而具有瀑布级联效应。某些细胞因子如白介素-1 (IL-1) 可诱导纤溶酶原激活因子合成, 抑制纤溶酶原激活抑制因子合成, 使纤溶酶合成增加, 进而促使MMPs酶原激活。②细胞内活化:MT-MMPs与其他MMPs不同, 它们是在分泌过程中逐渐活化, 到达细胞膜时已呈活化状态。③由MT-MMPs激活:部分MMPs可被MT-MMPs激活, 如MT1-MMPs可激活MMP-2、MMP-13。

3.3 其他抑制因子的调节

α2-巨球蛋白可抑制所有蛋白水解酶, 但由于分子量太大, 难以进入结缔组织, 故对MMPs调节作用较弱。

3.4 负反馈调节

纤溶酶一方面激活MMPs, 引起ECM降解, 另一方面又诱导产生纤溶酶原激活抑制因子-1, 使纤溶酶的产生受限, 从而使其作用不至过度。

4 MMPs在心肌重塑中的作用

所谓心肌重塑, 是指在各种病因作用下, 心肌细胞出现坏死、凋亡和肥大, 心肌细胞外基质主要是胶原蛋白的类型、组织、连接结构和浓度发生改变 (即间质纤维化) 的过程。在这一过程中, MMPs扮演着重要角色, Battle等[3]发现扩张性心肌病致重度心力衰竭病人的心肌MMP-9表达水平下降;Felkin等[4]发现需要左心辅助装置的重度心力衰竭病人心肌MMP-1和MMP-8表达增高;Ahmed等[5]发现高血压伴左室肥厚的病人MMP-2和MMP-13表达下降, 而MMP-9增加;在Syrian豚鼠心肌病模型中, MMPs的活性明显升高, 且发生心肌重塑的心肌标本中MMPs活性升高更明显。Mori等[6]发现在转基因大鼠的MMP-3活性增加并可通过调节MMP-9促进心肌重塑和心力衰竭的发展。Ducharme等证实, 剔除MMP-9的大鼠发生心肌梗死后, 其左心室腔扩大延缓至梗死后15 d;过度表达肿瘤坏死因子 (TNF) 转基因小鼠, 早期出现MMPs活性增高, 后逐渐出现心肌总纤维胶原减少及左室的扩大。总的说来, MMPs在心肌重塑中主要作用有:①直接降解ECM中的胶原, 引起ECM退化, 从而心肌排列紊乱, 收缩功能异常。②增加 (趋化作用) 纤维细胞进入其作用后的区域, 引起胶原沉积, 使基质重量增加, 但质量下降。③介导许多物质的活化, 如TNF-α、转化生长因子-β (TGF-β) 及白介素-1β (IL-1β) , 这些物质一方面增加新胶原的合成, 并破坏心肌细胞;另一方面可促使MMPs表达增加, 构成恶性循环, 进一步加重心肌重塑。需要指出的是, 某种MMP在心肌重塑中到底起何作用, 除了取决于其本身的特异性, 还与其产生的时间、地点及底物有关。

5 国内外对MMPs及其抑制剂的研究进展

过去20年来, 各国学者尤其是以Weber、Schaper为首的研究小组对心肌ECM研究做了大量的工作, MMPs作为ECM的高效水解酶, 自然备受青睐。由于多种MMPs在心肌重塑、心力衰竭过程中均有不同程度的活性增高, 因此人们希望通过某种方式抑制MMPs活性, 以达到延缓甚至逆转心肌重塑的目的。理论上说, 抑制MMPs活性有如下方法:①加入外源性TIMPs;②减少局部MMPs的产生;③促进局部TIMPs合成;④研制人工合成的MMPs抑制剂。其中, 外源性TIMPs易受各种因素影响而发生变性和降解;人为加入某些细胞因子可减少局部MMPs产生或促进局部TIMPs合成, 但副反应较大。因此, 人工合成的MMPs抑制剂成为主要研究方向。Spinale等用MMPs抑制剂PD166793治疗快速起搏引起充血性心力衰竭猪, 减轻了左室扩张和后壁变薄程度, 并使左室功能得到改善。Rohde等在心肌梗死小鼠模型中证实, 早期应用MMPs抑制剂可以减轻左室扩张。虽然广谱MMPs抑制剂减缓了心肌重塑过程, 但它同时还会影响正常组织的重建, 引起不良反应如肌肉骨骼肌疼痛。因而, 选择性MMPs抑制剂成为研究的新热点。2003年King等[7]证实选择性MMPs抑制剂可在不影响正常组织结构和功能的前提下阻止心力衰竭中心肌重塑过程。

6 目前研究中存在的问题

尽管动物实验结果为MMPs抑制剂的临床应用展现出美好的前景, 但仍存在以下问题亟待解决:①心肌重塑、心力衰竭是一个逐渐进展的漫长过程, 在这一过程中, MMPs并非一直保持高表达, 而是呈现动态变化规律。在不同原发疾病致心肌重塑、心力衰竭的演变中, 活性增高的MMPs种类及变化规律是不尽相同, 不同时相中起主要作用的MMPs种类也是不同的。当临床医生面对心力衰竭的病人时, 又应当在何种时期选用何种选择性MMPs抑制剂?关于这方面的研究较少。②MMPs、TIMPs及各种细胞因子之间构成了一个复杂的调控网络。当使用MMPs抑制剂时, 网络中其他成员也会受到一定影响, 并间接作用于ECM, 从而可能干扰疗效。对于这一调控网络, 我们仍然知之甚少。③许多关于MMPs抑制剂的研究时间太短, 对其改善心功能及降低死亡率的长期效应尚不明确, 因此还不能对MMPs抑制剂的疗效贸然下结论。④使用MMPs抑制剂可能导致合并其他脏器纤维化疾病的病人出现病情恶化。

参考文献

[1]Hijova E.Matrix metalloproteinases:Their biological functions and clinical i mplications[J].Bratisl Lek Listy, 2005, 106 (3) :127-132.

[2]汪砚雨.基质金属蛋白酶在心室重构及充血性心力衰竭中的地位[J].医药论坛杂志, 2004, 25 (11) :78-79.

[3]Batlle M, P啨rez Villa F, Garcia Pras E, et al.Down-regulation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expressioninthe myocardiumof congestive heart failure patients[J].Transplant Proc, 2007, 39 (7) :2344-2346.

[4]Felkin LE, Birks EJ, George R, et al.Aquantitative gene expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TI MPs) inthe myocardiumof patients with deteriorating heart failurere-quiringleft ventricular assist device support[J].J Heart Lung Trans-plant, 2006, 25 (12) :1413-1419.

[5]Ahmed SH, Clark LL, Pennington WR, et al.Matrix metallopro-teinases/tissue inhibitors of metalloproteinases:Relationship between changes in proteolytic determinants of matrix composition and struc-tural, functional, and clinical manifestations of hypertensive heart disease[J].Circulation, 2006, 113 (17) :2089-2096.

[6]Mori S, Gibson G, McTiernan CF.Differential expression of MMPs and TI MPs in moderate and severe heart failure in a transgenic model[J].J Card Fail, 2006, 12 (4) :314-325.

胃蛋白酶与胃蛋白酶原 篇3

消化食物的“生力军”

不过，从主细胞最初排出的并不就是胃蛋白酶，而是它的前体——胃蛋白酶原。如果胃蛋白酶是小刀，胃蛋白酶原就好像是套上了“刀鞘”的小刀，没有消化功能，但一旦遇上“老搭档”——胃酸和少许胃蛋白酶，便有如小刀出鞘，立刻变成有消化作用的胃蛋白酶，成为消化食物的“生力军”，“杀气腾腾”地消化起食物中各种蛋白质，水解蛋白质分子中所有的肽键连接点，蛋白质就成了结构简单的成分，这些比较简单的成分，很容易在小肠中被彻底消化。

胃蛋白酶和胃酸是典型的“铁哥们”，它们同是胃黏膜腺的产物，虽然细微部位有所不同；蛋白酶原要靠胃酸来激活；胃酸处理过的蛋白质，胃蛋白酶消化起来最省力；胃酸给蛋白酶提供了最合适的工作环境；胃蛋白酶的含量是胃酸高低的“反射镜”，两者“难分难舍”，一个缺乏，另一个往往不足，反之亦然。

老资格的促消化药

消化药是促进胃肠道消化过程的药物，其本身大多数就是消化液的主要成分，在消化液分泌不足时，它们可以起补偿作用，有的也能促进消化液分泌。

胃蛋白酶是“老资格”的助消化药，顾名思义，其药理作用机制就是蛋白质的消化酶，其消化力在pH值等于1.8时最强，故宜与稀盐酸合用。

常用药物为胃酶合剂，常用于以下方面：（1）进食蛋白质食物过多时的消化不良；（2）病后恢复期消化机能减弱；（3）慢性萎缩性胃炎、胃癌、恶性贫血所致胃蛋白酶缺乏。

使用上要注意：（1）不宜与抑酸药如质子泵抑制剂（奥美拉唑等）、H2受体阻滞剂（雷尼替丁等）合用；（2）不宜与碱性药物如碳酸氢钠等合用，因这些碱性环境会使胃蛋白酶失去活性；（3）不宜与重金属、鞣酸、硫糖铝合用，因这些成分会使本质就是蛋白质的酶变性；（4）不宜在消化性溃疡、烧心症状重的反流性食管炎、卓-艾综合征（又名胃泌素瘤，是一种难治性溃疡）等高胃酸疾病时使用，否则可能加重症状与病变。

时至今日，胃酶合剂仍然久用不衰。

消化道疾病检测的重要手段

如果说以往关于胃蛋白酶的研究侧重于临床应用，近年来胃蛋白酶原的研究则深入到在某些消化病发病机制与诊断方面，重点是溃疡病与胃癌。

◆ 溃疡病

研究发现，胃蛋白酶原分胃蛋白酶原I与胃蛋白酶原Ⅱ。50%以上的十二指肠溃疡患者血清胃蛋白酶原I含量升高，而对于血清胃蛋白酶原I升高的血缘关系亲属来说，即便目前他们尚未发病，其可能出现十二指肠溃疡的风险相应增大。

实验研究证实，单纯生理浓度的胃酸，对上消化道黏膜并不造成损害，或者损害轻微，同时添加胃蛋白酶后，不但损害范围广泛，而且程度严重。

从化学结构上看，胃黏液糖蛋白、脂蛋白、结缔组织成分如胶原、弹力蛋白等与胃黏膜结构有关的蛋白质，都能被胃蛋白酶所消化。这些结果说明了胃蛋白酶在溃疡病发病中的重要作用。

◆ 胃癌

用于高风险胃癌的诊断

研究发现，胃蛋白酶原I降低与胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原Ⅱ比值降低，是胃底黏膜萎缩的特征。进一步追踪研究发现，上述两种指标的改变，尤其是胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原Ⅱ值小于2，能更好地预测将来胃癌的发生。芬兰一项前瞻性研究证实，胃蛋白酶原I水平降低与胃癌发生的时间有密切关系，胃蛋白酶原I低于50 ng/ml（纳克/毫升）者，未来8～14年内可能发生胃癌的风险为胃蛋白酶原I水平正常人的2.7倍，而2年内这种风险高达6.3倍！

已经确认幽门螺杆菌与胃癌关系密切。一项前瞻性系列研究结果显示：与幽门螺杆菌阴性、胃蛋白酶原水平正常者（风险指数1.0）相比，幽门螺杆菌阳性，胃蛋白酶原正常者，患胃癌风险为1.1；幽门螺杆菌阳性，胃蛋白酶原降低者风险为6.0；幽门螺杆菌阴性、胃蛋白酶原降低且有重度不典型增生者，风险高达8.2！说明幽门螺杆菌结合胃蛋白酶原水平检测，对于判断胃癌发展的风险有重要价值。

以幽门螺杆菌抗体阴性，胃蛋白酶原I水平正常患胃癌风险指数为1.0，即便幽门螺杆菌抗体阴性，只有胃蛋白酶原I低水平，风险指数上升至5.40；抗体阳性，胃蛋白酶原I又是低水平，风险指数上升到9.21。不论肠型或弥漫型胃癌，结果与此类似。

用于胃癌的普查

由于胃癌是日本最常见的恶性肿瘤，日本学者在胃癌普查方面做了大量工作。

他们用胃蛋白酶原检测作为普查手段，并与通常采用的荧光照相术、X线钡餐造影作比较，初步结论认为，胃蛋白酶原检测对胃癌进行普查很有效，可以取代荧光照相术。而与钡餐造影相比，则各有千秋，胃蛋白酶原检测更适用于无症状的早期小肠型胃癌，而钡餐造影更适用于发现弥漫性、溃疡型胃癌。如果将胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原Ⅱ两个指标结合起来作普查，会更为有效。

蛋白酶 篇4

作 者：曹煜成 李卓佳 吴灶和 冯娟 CAO Yu-Cheng LI Zhuo-Jia WU Zao-He FENG Juan 作者单位：曹煜成,CAO Yu-Cheng(中国水产科学研究院南海水产研究所,广州,510300;湛江海洋大学水产学院,湛江,524000)

李卓佳,冯娟,LI Zhuo-Jia,FENG Juan(中国水产科学研究院南海水产研究所,广州,510300)

吴灶和,WU Zao-He(湛江海洋大学水产学院,湛江,524000)

蛋白酶 篇5

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的`化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18

作 者：郝建华 王跃军 袁翠 孙谧 HAO Jianhua WANG Yuejun YUAN Cui SUN Mi 作者单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋酶工程室,山东,青岛,266071刊 名：应用与环境生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED & ENVIRONMENTAL BIOLOGY年，卷(期)：12(3)分类号：Q556.9 Q178.53关键词：海洋假单胞杆菌 低温碱性蛋白酶 化学修饰

蛋白酶 篇6

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)研究了将四氢糠醇加入盐酸胍(GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时,对α-胰凝乳蛋白酶(α-Chy)复性效率的影响情况,并以α-Chy的`生物活性回收率对结果进行了表征.用尺寸排阻色谱(SEC)与HPHIC的实验结果进行了比较,结果表明,四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时,均可提高α-Chy的复性效率,但提高的程度不同.四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α-Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α-Chy形成了复合物的形式.实验中还对GuHCl中加入的四氢糠醇量进行了优化.

作 者：申烨华 王海波 卫引茂 耿信笃 作者单位：西北大学现代分离科学研究所,陕西省重点实验室,西安,710069刊 名：分析化学 ISTIC SCI PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY年，卷(期)：30(12)分类号：O65关键词：蛋白复性 α-胰凝乳蛋白酶 高效疏水色谱 排阻色谱

蛋白酶 篇7

1 牛钙蛋白酶抑制蛋白基因的结构

牛钙蛋白酶抑制蛋白基因由N末端的L区和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区构成。L区是Ca2+通道调节区, Ⅰ～Ⅳ区是钙蛋白酶抑制区, Ⅰ～Ⅳ区对钙蛋白酶的抑制能力为Ⅰ区>Ⅱ区>Ⅲ区>Ⅳ区。根据不同哺乳动物钙蛋白酶抑制蛋白的DNA片段N末端编码区的差别, 牛钙蛋白酶抑制蛋白被确定为TypeⅡ型, TypeⅡmRNA在心脏和骨骼肌中表达水平较高, 在肝脏、脑和睾丸中表达水平却很低[1], 该结论与林亚秋等对九龙牦牛钙蛋白酶抑制蛋白基因表达的研究结果相似。牛钙蛋白酶抑制蛋白基因序列与已发表的人、兔和猪的钙蛋白酶抑制蛋白序列有70%～80%的同源性, L区对应人钙蛋白酶抑制蛋白外显子3处有22个氨基酸的缺失, 该缺失的意义现在还不明确, 但推测该缺失将会影响钙蛋白酶抑制蛋白对钙蛋白酶的抑制活性。牛钙蛋白酶抑制蛋白含有5个结构域。N端第1个结构域即L结构域, 其功能还不太清楚。第2～5个结构域是4个相似的重复单位。

2 牛钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性的研究

2.1 CAST-RFLP的研究

Juszczk-kubiak E等[2]对不同品种牛的钙蛋白酶抑制蛋白编码蛋白质结构域1的外显子1C和1D长624 bp的片段, 用AluⅠ酶切得到CC、GC、GG 3种基因型, 对与其肉质性状遗传相关的研究表明, CC基因型牛肉比GC基因型牛肉更嫩 (P<0.05) 。Cockett N E等[3]对不同品种牛钙蛋白酶抑制蛋白基因编码蛋白质第2结构域Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区及第3结构域Ⅰ区第1 059～1 480位间的核苷酸序列, 用TaqⅠ酶切后得出3种基因型。Lonergan S M等对牛钙蛋白酶抑制蛋白基因编码蛋白质结构域2～4以及3′非翻译区的2.2 kb长的片段, 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切产生多态。这2个酶切多态性及24 h内钙蛋白酶抑制蛋白活性与宰后14天的肌肉剪切力值没有相关性, 因此不能利用这些多态性来预测牛肉的嫩度, 但不排除钙蛋白酶抑制蛋白基因其他片段多态性影响钙蛋白酶抑制蛋白活性和嫩度的可能。Majidi A等[4]对牛钙蛋白酶抑制蛋白基因第6内含子1 552 bp长的片段, 用XmnⅠ酶切得到3种基因型。邓桂馨等[5]对4个杂交改良牛和3个中国地方纯种牛钙蛋白酶抑制蛋白基因第6内含子, 采用XmnⅠ、RsaⅠ、HaeⅢ 、HinfⅠ、HhaⅡ、MspⅠ, HindⅢ 7种限制性内切酶进行酶切, 只有XmnⅠ酶切产生多态性, 得出基因型AA、AB和BB。在总群体中, BB和AB基因型与嫩度显著相关, 纯种群体内各基因型与嫩度无显著相关性, 在杂交改良群体中, 则显著相关。说明总群体的显著性来源于杂交改良群, 这个结果表明杂种优势在该试验中对嫩度的影响起了一定作用。

2.2 CAST-SSCP和CAST-SNP的研究

邱大伟等[6]对重庆山地黄牛及其杂交牛 (西杂牛、红杂牛) 钙蛋白酶抑制蛋白基因第9, 18外显子编码区进行了PCR-SSCP分析, 在第9外显子编码区发现多态性, 第18外显子序列未发现多态性。分析第9外显子, 在3个群体中都检测到了AA、AB、BB基因型, 在重庆山地黄牛中以B为优势基因, 西杂牛、红杂牛群体以A为优势基因, 3个群体均处于Hardy-weinberg平衡状态。Edyta J K等对牛钙蛋白酶抑制蛋白基因外显子1C进行PCR-SSCP分析, 外显子1C与已报道的绵羊和人的钙蛋白酶抑制蛋白序列相比, 分别有89%和82%的同源性, 并发现G→C的碱基替换产生了Alu I酶切位点。Casas E等[7]采用单核苷酸多态性 (SNP) 法对3个不同群体牛钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因与牛肉嫩度的相关性研究表明, 只能用单个基因而不能同时用2个基因来评价牛肉的嫩度。在其中2个群体中, 钙蛋白酶抑制蛋白与嫩度极显著相关, TT基因型肉质嫩度比CC和CT基因型肉质更嫩。Schenkel F S等[8]对不同品种群体肉牛钙蛋白酶抑制蛋白单核苷酸多态性与嫩度的相关性研究中发现了G→C的替换, 检测出CC、CG、GG 3种基因型, 这些钙蛋白酶抑制蛋白基因型明显影响了宰后21天背最长肌平均嫩度 (P<0.05) , 基因型CC嫩度最高, 其次为杂合基因型CG, 最后为GG。品种和性别对嫩度无显著影响 (P<0.05) 。

3 牛钙蛋白酶抑制蛋白基因活性的研究

对牛肉宰后储存时钙蛋白酶抑制蛋白活性变化的研究表明, 宰后可提取的钙蛋白酶抑制蛋白活性持续降低, 宰后1天降到60 %, 宰后7天降到30 %。Woodward B W等[9]提取了宰前牛肩胛骨表面肌肉并将其采用4 ℃冷藏24 h后测定钙蛋白酶抑制蛋白活性 (LISH24) 、宰后取牛背最长 (12～13肋骨之间) 的肌肉冷冻24 h后测定钙蛋白酶抑制蛋白活性 (PMLD) 。结果表明, 宰前和宰后肌肉组织的钙蛋白酶抑制蛋白活性相似, 这使采取活体组织预测肉质嫩度成为可能。Connor S F等研究表明, 瘤牛 (Bos indicus) 品种与普通牛 (Bos taurus) 品种相比, 24 h 钙蛋白酶抑制蛋白活性差异显著 (P<0.05) , 嫩度差异不显著 (P>0.05) , 普通牛24 h 钙蛋白酶抑制蛋白活性更高, 宰后1～7天牛肉老化速度更慢, 宰后4, 7, 14, 21, 35天的嫩度比普通牛坚韧, 对大理石纹选择的增加将导致牛肉嫩度满意度的降低。

不同营养水平对钙蛋白酶抑制蛋白活性影响的研究表明, 不同比例精料饲喂和不同饲喂时间对宰后0小时钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性无显著影响, 对肌肉剪切力值也无显著影响。瓦古力牛 (Waguli) 在宰后7天和10天的肌肉剪切力值显著低于婆罗门 (Brahman) 牛 (P<0.05) , 这种区别在宰后14 d降低。婆罗门牛肉肉质的坚韧度与高活性的钙蛋白酶抑制蛋白有关, 瓦古力牛宰后0小时背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白活性显著低于婆罗门牛 (P<0.05) 。瓦古力牛是以肉质嫩度著称的日本和牛 (Wagyu) 与图里牛杂交得来, 瓦古力牛与婆罗门相比, 大理石纹含量高, 肌肉剪切力值小, 钙蛋白酶抑制蛋白活性低, 嫩度高。研究还表明, 肉质嫩度与遗传因素有关, 但环境因素对其影响不大[10]。

4 展望

综上所述, 无论从钙蛋白酶抑制蛋白基因多态性还是钙蛋白酶抑制蛋白基因活性方面, 都有影响牛肉嫩度和不影响牛肉嫩度的不同报道。牛钙蛋白酶抑制蛋白基因含有20个以上的外显子和内含子, 到目前为止, 该基因的研究仍然很少, 应该继续进行牛钙蛋白酶抑制蛋白基因的不同区域多态性以及钙蛋白酶抑制蛋白活性对牛肉嫩度影响的研究, 以提供钙蛋白酶抑制蛋白作为嫩度候选基因的更多理论依据。目前, 对那些调控营养状况、品种、年龄、宰前和宰后的全方位影响牛肉最终口感的不同基因的认识, 都是基于DNA的技术只适用于不同世代家畜生产性能提高的遗传选择, 而基因对生命体的控制必须通过它所表达的蛋白质来发挥功能, 因此要对牛肉嫩度及其他肉质特性有全面和深入地了解, 就必然要在整体、动态的水平上对细胞、组织或有机体蛋白质组进行研究, 也就是说研究进入了后基因组时代, 相信在不远的将来, 人们对功能基因组学的研究将会对肉质特性的选择发挥重要作用。

参考文献

[1]邱大伟, 赵金红, 黄勇富.牛钙蛋白酶蛋白基因 (钙蛋白酶抑制蛋白) 的多态性的研究[J].畜牧市场, 2009 (5) :23-24.

[2]JUSZCZUK-KUBIAK E, ROSOCHACKI S J, WICINSKA K, et al.A novel RFLP/AluⅠpolymorphism of the bovine calpastatin (CAST) gene and its association with selected traits of beef[J].JAnim Sci, 2004, 22 (2) :195-204.

[3]COCKETT N E, SHAY T L, GREEN R D, et al.Rapid communi-cation:a TaqI restriction fragment length polymorphism in the bovinecalpastatin gene[J].J Anim Sci, 1995, 73 (12) :3790.

[4]MAJIDI A, PANANDAM J M, SAZILI A Q, et al.Characterizationof bovine calpastatin gene in nelore cattle using polymerase chain re-action-restricted fragment length polymorphisms[J].Am J AnimVet Sci, 2009, 4 (4) :92-94.

[5]邓桂馨, 张银花, 梁鸿斌.肉牛钙蛋白酶抑制蛋白基因分子多态性与肉品质性状相关性的研究[J].北京农学院学报, 2007, 22 (3) :25-27.

[6]邱大伟, 赵金红, 黄勇富.重庆山地黄牛及其杂交牛钙蛋白酶抑制蛋白基因部分片段PCR-SSCP分析[J].安徽农业科学, 2009, 37 (13) :5892-5893.

[7]CASAS E, WHITE S N, WHEELER T L, et al.Effects of calpasta-tin and micro-calpain markers in beef cattle on tenderness traits[J].J Anim Sci, 2006, 84 (3) :520-525.

[8]SCHENKEL F S, MILLER S P, JIANG Z, et al.Association of asingle nucleotide polymorphism in the calpastatin gene with carcassand meat quality traits of beef cattle[J].J Anim Sci, 2006, 84 (2) :291-299.

[9]WOODWARD B W, DENISE S K, MARCHELLO J A.Evaluationof calpastatin activity measures in ante-and postmortem musclefrom half-sib bulls and steers[J].J Anim Sci, 2000, 78 (4) :804-809.

蛋白酶 篇8

关键词：角蛋白酶；分离筛选；羽毛降解；皮革脱毛

角蛋白（keratin）是一类纤维硬蛋白，具有稳定的化学性质和较高的机械强度，广泛的存在于毛发、鳞羽、蹄角、爪喙及其他的表皮结构中，含有较多的二硫键，通过交联作用使其具有了稳定的结构，一般的蛋白酶（如胰蛋白酶和胃蛋白酶等）无法将其降解[1]。

角蛋白酶（Keratinase）是一类可以特异性降解天然角蛋白的蛋白酶类，主要由细菌、真菌、放线菌产生，大部分为胞外酶。不同种的微生物产生的角蛋白酶性质不同，催化角蛋白分解的机制也有区别[2]。角蛋白酶具有很高的利用价值，可以广泛的应用在饲料的生产、皮革的脱毛等各类工业生产和环境治理方面。

内蒙古乌兰察布市被誉为“草原皮都”，有大量的皮革制品生产销售，需要发展新型的生物酶脱毛技术来减少污染的排放，同时乌兰察布市卓资县的熏鸡产业发达，家禽屠宰数量极大，产生的大量羽毛垃圾需要合理分解。

目前国内对于角蛋白酶产生菌的研究多集中于不同地区高产角蛋白酶菌株的筛选和鉴定，本文旨在从内蒙古乌兰察布市及周边区域筛选出几株高产角蛋白酶的菌株，可以高效的降解角蛋白，从而为乌兰察布市废弃羽毛的利用和皮革脱毛等角蛋白相关工业的生产奠定良好的基础[3]。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1培养基

富集培养基（g/L）：磷酸二氢钾15g，羽毛粉5g。

初筛培养基（固体）

酪蛋白培养基（g/L）：牛肉膏8g，酵母浸粉2g，蛋白胨5g，NaCl 2g，琼脂20g，磷酸氢二钾18g，干酪素 5g。

脱脂乳粉培养基（g/L）：脱脂奶粉 5g，琼脂粉 20g，二者需分开灭菌。

羽毛粉筛选培养基（g/L）：自制羽毛粉75g，磷酸氢二钾1g，酵母膏1g，琼脂20g，pH75。

兔毛粉筛选培养基（g/L）：兔毛粉5g，磷酸氢二钾1g，NaCl0g，琼脂20g。

NA培养基（g/L）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，Nacl 5g。

1.2 样品采集

乌兰察布市卓资县家禽屠宰场周围的羽毛堆积处，集宁师范学院植物园兔笼周边兔毛堆积处，乌兰察布市前旗幸福村羊圈周边羊毛垃圾堆处分别采集土样。

1.3菌种的筛选及鉴定

1.3.1初筛：取5g土样接入100ml生理盐水中，80℃水浴15min。接种于富集培养基中培养24h后，涂布于干酪素初筛平板培养基，将出现透明圈的单菌落接种于其他种类筛选平板上进行二次筛选，最终挑选在各类平板上均能产生透明圈的菌株编号保藏。

1.3.2复筛：将初筛得到的菌株分别接种到NA培养基中培养，测定各菌株角蛋白酶活性，取酶活性较高的三株菌种分别保存。

1.3.3酶活性测定：角蛋白酶活性的测定参考Gradisar等的方法，以羽毛粉为反应底物，三氯乙酸为催化反应终止剂。于280nm处测定反应液的吸光度。

1.3.4酶活性单位定义：在上述反应条件下，测得的D280nm值每升高001所需要的酶量定义为 1个酶活单位（U）。

1.3.5菌种鉴定

分别观察三株菌株的菌落形态特征，同时观察革兰氏染色特征，生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》。

1.4高产蛋白酶菌株的羽毛分解实验

将三株菌株，以相同的接种量加到放有一只完整羽毛的NA培养基中摇瓶培养，在不同的时间点观察不同菌株对羽毛的降解程度[6]。

1.5高产蛋白酶菌株的兔皮脱毛实验

取大小相同的兔皮分别放入不同种类菌株的培养液中，以不加酶液的皮样作为对照，进行形态学分析，观察脱毛效果。

2.实验结果与分析

2.1菌株的筛选

2.1.1菌株的初筛

通过四种蛋白筛选平板的筛选，得到了11株能产生角蛋白酶并在平板有较大透明圈的菌株，分别编号。

2.1.2菌株的复筛

以角蛋白酶活性为指标进行比较，通过复筛获得 3株角蛋白酶高产菌编号分别为ZY2、ZY4、QY1，酶活性分别为587U/mL、643U/mL、532U/mL。

2.2菌株的鑒定

ZY4菌落颜色为白色，质地均匀，菌落边缘规则，湿润，微透明，菌落正反面形态一致，短杆状菌体，革兰氏阳性芽孢杆菌。QY1菌落呈微黄色，光滑的圆形，质地均匀湿润，边缘不整齐，革兰氏阳性杆菌。

2.3高产蛋白酶菌株的羽毛分解实验

三株菌对羽毛均有降解作用，ZY4菌株作用5天以后其中的羽毛只剩下硬杆，8天后完全降解，降解羽毛的速率最快。

2.4高产蛋白酶菌株的兔皮脱毛实验

QY1菌株作用24h的兔皮脱毛速率最快，表皮脱落后，裸皮粒纹比较清晰。

3.结论

从不同来源的土壤中分离出了3株高产角蛋白酶菌株，综合分析其中ZY4菌株产酶活力最高，降解羽毛速度最快，QY1菌株作用于兔皮脱毛效果最好，本研究表明ZY2、ZY4、QY1是具有高效产角蛋白酶能力的菌株，其16S rDNA分析和工业化的应用有待于深入研究。

参考文献：

[1]杨建强，汤国营.角蛋白酶研究发展[J].生物技术通讯.2005.16（2）：37-42

[2]蔡成岗，郑晓冬.角蛋白酶的来源、理化性质与生物工程研究进展[J].食品与发酵工业，2006，32（4）：111-114.